ELECTROFORESIS Y VISUALIZACION DEL

ADN
Karol Gessenia Camperos Soledad 1, Silvia Fernanda Nez Flrez1
Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias, Escuela de
Biologa, Laboratorio de Biologa Molecular, Grupo B1.
Gessecamperos_@hotmail.com; silfer1993@hotmail.com
RESUMEN
La electroforesis es una tcnica til para la separacin de molculas en una
mezcla, mediante la aplicacin de un campo elctrico; basndose en una
relacin de desplazamiento carga: masa nica en cada molcula disuelta. (5).
Esta tcnica tiene mltiples funciones cuantitativas y de identificacin
necesarias en estudios experimentales y complementarias en diferentes
tcnicas de la biologa general. En esta prctica se realiz una electroforesis
con ADN bacteriano de Echerichia coli en un medio de agarosa al 0.8%.

INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica
que ayuda en el estudio del
movimiento de las biomolculas
con una carga neta a travs de un
campo elctrico. Su migracin
depende de la forma, tamao,
carga y composicin qumica; es
decir, en una mezcla cada
molcula presenta una carga y
tamao nicos, por lo tanto la
movilidad y la velocidad de
migracin en el campo elctrico
para cada molcula es tambin
nica y separable en bandas (6).
La electroforesis es una tcnica
que se utiliza para analizar y
determinar el peso molecular de
diferentes tipos de biomolculas,
siendo ms comn su uso en
protenas y cidos nucledos (6).
Existen
diferentes
tipos
de
electroforesis
cuya
diferencia
radica en los distintos tipos de
desplazamiento;
en
la
electroforesis de frente mvil, las
partculas se mueven de forma

libre en el medio en que se

encuentran dispersas y en la
electroforesis de zonal, la muestra
esta obligada a desplazarse sobre
un mecanismo o soporte solido
que puede ser restrictivo (geles de
almidn y poliacrilamida) o
no
restrictivo (papel, acetato celulosa
y agarosa) (4). Los geles de celulosa
de soporte solido, son usados para
molculas de bajo peso molecular
como los aminocidos y los
carbohidratos; en cambio los geles
de poliacrilamida y agarosa de
matriz porosa, se utilizan para
molculas
de
mayor
peso
molecular (DNA, RNA y protenas)
(6).

La electroforesis en gel de agarosa

es un mtodo bastante utilizado
para separar, identificar y purificar
fragmentos de ADN, que han sido
extrados
anteriormente.
La
agarosa es un polmero lineal,
extrado de algas marinas y no
toxico. Los geles de agarosa se

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ADN
preparan fundiendo agarosa en
presencia del buffer adecuado
hasta que se logre una solucin
transparente. La solucin fundida
es puesta en un molde donde
gelifica. El gel forma una matriz
cuya densidad est determinada
por la concentracin de agarosa.
Cuando se aplica un campo
elctrico a travs del gel, el ADN
migra hacia el nodo. Entre los
factores que afectan la velocidad
en la tasa de migracin del ADN
en los geles de agarosa se
incluyen: el tamao del fragmento
a migrar (ADN), la concentracin
de agarosa, la conformacin de
ADN, el voltaje aplicado y el
amortiguador utilizado. (1)

El buffer de corrida es utilizado

para baar el gel de agarosa Y
puede ser reciclado y utilizado
varias
veces
para
este
procedimiento.
Los
ms
comnmente usados son TBE (TrisBorato-EDTA) y TAE (Tris-AcetatoEDTA); aunque es ms frecuente el
uso de TAE, este presenta
capacidad de buffer ms baja que
el TBE. El TBE puede ser usado
para electroforesis de DNA de bajo
peso molecular y en los sistemas
en los cuales es usado no requiere
de
sistemas
adicionales
de
recircularizacin. El buffer de
carga (pH 7), son adicionados a las
muestras antes de servir en el gel
con el propsito de incrementar la
densidad
de
la
muestra;
asegurando que el ADN precipite
al
fondo
de
los
pozos
y
adicionando color a la muestra
mediante colorantes indicadores o
agentes intercalantes (BPB o FF,
entre otros) que permiten el
seguimiento de la electroforesis;

dada la co-migracin de los

colorantes
indicadores
con
fragmentos de DNA de tamao
especfico (7).
EZ -Vision es un
agente
intercalante
de
reaccin
fluorescente no mutagnico, no
toxico,
ni
peligroso
en
su
manipulacin,
transporte
y
eliminacin; a comparacin del
ms usado Bromuro de etidio.
Principalmente forma un apretado
complejo con el ADN de la muestra
y co- migra con l durante la
electroforesis; proporcionando la
visualizacin instantnea de sus
bandas tras la iluminacin UV de
geles de agarosa. (8)

MATERIALES Y MTODOS
Para la prctica se requiri de los
siguientes
Instrumentos,
materiales moleculares y reactivos
qumicos:
Instrumentos:
Micropipeta,
termociclador, microtubos, cmara
electrofortica, fotodocumentador,
horno microondas y pelculas de
ParaFilm.
Material molecular:
ADN genmico de Echerichia coli,
plsmido recombinante, plsmido
no recombinante y una PCR.
Reactivos: Buffer TBE (carga y
corrida) 0.5X, Agarosa (0.8%) y EZVision
.

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ADN
1. Se fundieron 30 mL (0.24
gr) de Agarosa al 0.8%,
anteriormente gelificada. Se
emplearon 6 ciclos de calor,
cada uno de 8 segundos
aproximadamente;
utilizando la energa calrica
de un horno microondas. Se
verific que la Agarosa
tuviera
una
contextura
liquida,
clara
y
muy
homognea.

2. Se verti la solucin de
agarosa en la caja molde
electrofortica, verificando
que no existiera ninguna
burbuja y se coloc el peine
con las cabezas de los
tornillos hacia el frente,
cerrndolo hermticamente
en las extremidades.
3. Se espero unos segundos y
se introdujo la Agarosa a
una nevera para gelificar la
solucin. Transcurrido 10
minutos se observ que
faltaba un poco y se espero
otros 5 minutos ms.
4. Al
enfriar
y
gelificar
completamente la Agarosa;
se sac el peine y los
cauchos
del
gel,
se
ensamblo el molde en la
cmara y se sumergi el
gel en una solucin de
buffer de corrida 0.5X TBE;
cubriendo 3 milmetros por
encima a los posos credos
por los peines.
5. Se utiliz una micropipeta
de 10x para premezclar el
buffer de carga 0.5X (TBE)

+
el
EZ-Vision
=
equivalentes a 1.4 L que se
colocaron en una pelcula de
ParaFilm formando una
gota o punto. Se repiti 4
veces
ms
este
procedimiento.

6. Al terminar de premezclar y
colocar las cinco gotas; a
cada una se le adicion su
correspondiente muestra.
#
gota
1
2
3
4
5

Muestra
1L del marcador de peso
molecular
3L de ADN genmico de
E.coli
3L de PCR
3L de Plsmido no
recombinante
3L de Plsmido
recombinante

7. Se Tom con la punta de la

micropipeta
(10X),
la
primera
muestra (gota # 1), para
empozarla en el fondo del
primer poso; procurando no
romper el gel y se descarg
suavemente la muestra. Se
repiti este procedimiento con
las
4
muestras
faltantes,
siguiendo una lnea horizontal y
una seguida de otra.
8. Se encendi la fuente de
poder y se corri el gel a
120V/cm * 30 minutos
hasta que los indicadores
migraron
la distancia
apropiada

ELECTROFORESIS Y VISUALIZACION DEL

ADN
9. Se visualiz el ADN bajo la
lmpara UV y se tomo una
foto de la imagen.

10.Se descarg el Software

Gelanalyzer(R) para analizar
los datos de la imagen

RESULTADOS
MARCADOR DE PESO MOLECULAR

Partiendo de este resultado, se define el

marcador molecular como un segmento de
ADN que a partir de bandas permite el anlisis
del genoma (en este caso bacteriano). El marcador molecular est dado en
pares de bases (pb) y en nanogramos (ng), siendo as un punto de
referencia para el anlisis del ADN, ADN amplificado, y los tipos de
plsmidos (recombinante y no recombinante).
La curva de intensidad nos da a conocer los picos de cada banda en donde
posiblemente debe ir un valor respecto al peso y la intensidad (valga la
redundancia) con que este se presenta en la electroforesis.
Las bandas en la imagen no se presentan muy definidas debido a que el
tiempo de corrida de del gel fue relativamente bajo, con referencia a lo
mencionado no se ver la marcacin como tal del peso en forma ntida.
ADN

BANDA ADN VS MARCADOR

ADN

MARCADOR

ADN AMPLIFICADO

BANDA ADN AMPLIFICADO VS MARCADOR

ADN AMPLIFICADO

MARCADOR

PLASMIDO RECOMBINANTE

BANDA PLASMIDO RECOMBINANTE VS MARCADOR

PR

MARCADOR

PLASMIDO NO RECOMBINANTE

PLASMIDO NO RECOMBIANATE VS MARCADOR

PNR

MARCADOR

ELECTROFORESIS

CURVA DEL PESO MOLECULAR

TABLA DE VALORES

Bibliografas
1. Puerta B. Concepcin y Urea P. Claudia. Prcticas de biologa
molecular. Ed Pontificia Universidad Javeriana. Colombia 2005.pg
24-28
2. Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
3 ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001.
Pgs. 23-44.
3. DAVID L. NELSON; MICHAEL M. COX. Lehninger Principios de
bioqumica. Cuarta Edicin. Ed Omega. 2006. Pg. 86-87
4. Christopher K. Mathews Kensal E. van Holde Kevin G. Ahern.
Bioqumica. Tercera edicin. Ed PEARSON EDUCACION S.A. Madrid.
Espaa 2002.pg 1040.
5. Lodish, Berk. Matsudaira, Kaiser y otros. Biologa celular y molecular.
Ed. Mdica Panamericana. 5 ed. Capitulo 3.6. Buenos Aires.
Argentina 2005. Pg. 87
6. Segal Kischinevzky,Claudia Andrea. Manual de Practicas Biologa
Molecular de la Celula L. Ed UNAM. Universidad Nacional Autnoma
de Mxico. Facultad de Ciencias. Colombia 2005. Pg. 51-56
7. Serna Oriana. ELECTROFORESIS Y VISUALIZACIN DEL ADN.
Laboratorio de biologa molecular (20071). UNIVERSIDAD INDUSTRIAL
DE SANTANDER. 2013

8. EZ-VisionA Fluorescent Dye for the Instant Visualization of DNA Bands

in Agarose Gels Supplied in 6X Loading Buffer. 1-800-829-2805

web http://www.amresco-inc.com/media.acux/eef4bdfc-0b74-4f46-8e9c-fb48bebdc6d3