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Seminario N 3B

TCNICAS ANALTICAS BSICAS EN FISIOLOGA


VEGETAL
Contenido hdrico
Para saber el agua que contiene una planta se usa una tcnica muy sencilla que
consiste en dos mediciones consecutivas del peso de la planta en distintas
condiciones. La primera, Peso fresco, consiste en el pesado de la planta intacta u
rgano que se desee cuantificar. Se tara la bscula con la porcin de papel necesaria
pesndose a continuacin el material de estudio. La segunda medida, Peso seco
consiste en pesar la planta en cuestin tras mantenerla en estufa a 60-70 C hasta
peso constante. La diferencia entre ambas medidas nos informar sobre el contenido
hdrico de la planta.

Determinacin de pigmentos fotosintticos


La fotosntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energa
que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la
presencia en las hojas y en los tallos jvenes de pigmentos, capaces de captar la
energa lumnica.
Entre los distintos mtodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se
encuentra el de la cromatografa, que es una tcnica que permite la separacin de las
sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que
se encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el
disolvente arrastra con distinta velocidad a los pigmentos segn la solubilidad que
tengan y los separa, permitiendo identificarlos perfectamente segn su color.
PIGMENTO

COLOR

Clorofila A

Verde azulado

Clorofila B

Verde amarillento

Carotenos

Naranja

Xantofilas
Amarillo
La tcnica que se describe a continuacin se puede realizar sin ningn problema en
casa.
Material necesario.
Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones.
Alcohol de 96 (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas)
Un mortero
Dos filtros de caf
Un embudo
Un vaso
Una pinza de la ropa

Cmo lo hacemos?
Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido, se aade un poco de alcohol
y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.

Se filtra el lquido utilizando el embudo en el que se ha puesto el filtro de caf.


Se recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso hasta que
toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza
Se esperan 30 minutos y aparecern en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que sealan a los distintos pigmentos.
OTROS MTODOS
Medida de pigmentos fotosintticos en Dunaniella viridis
Extraccin de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotomtrica.
Materiales:
Espectrofotmetro
Centrfuga de mesa
tubos
acetona
Mtodo de extraccin y medida
1. Tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min
2. Guardar sobrenadante para medir fosfato con mtodo verde malaquita
3. Resuspender el precipitado en 4ml de acetona para extraer pigmentos
4. Mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada
5. Centrifugar 1min
6. Medir la absorbancia del sobrenadante resultante
7. Posibles resultados:
-750nm turbidez
-664nm mximo de absorcin de la clorofila A
-480nm mximo de absorcin de pigmentos carotenoides
8. Clculos:
-para clorofila A: multiplicar resultados por factor de 10,3 (mg /ml)
-para carotenoides: multiplicar por factor de 10 (mg /ml)
Otro mtodo para la extraccin de pigmentos es el que se describe a continuacin:
Materiales
1 Mortero
1 Embudo de Buchner
1 Matraz de filtracin
1 Matraz aforado de 50 ml
Probeta de 100 ml
Vaso de precipitados de 200ml.
Tubos de ensayo
1 Pipeta de 5ml.
1 Embudo
Pipeta pasteur, mechero, tripie y rejilla
Espectrofotmetro y celdas
2 Discos de papel filtro
Gradilla
1 gr de hojas frescas de espinacas.
3gr de ptalos de flores azules
Arena
Reactivos
Acetona al 80% (v/v)
H2S04 0.1N
NAOH 0.1N
Papel pH 0-14
Metodologa
1. Coloque en el mortero 1 g de hojas de espinacas, sin las nerviaciones, cortadas en
pequeas porciones.

2. Agregue arena y 4 ml de acetona al mortero, para moler el tejido y obtener una


pasta fina. Adicione 20ml ms de acetona.
3. Transfiera cuidadosamente el extracto resultante al embudo de Buchner provisto de
papel filtro, y filtre al vaco.
4. Agregue otros 50ml de acetona a la pulpa de las hojas y reanude la molienda y el
filtrado. Este segundo extracto agrguelo al primero. El tejido debe de quedar sin
clorofila, de lo contrario repita el proceso con otros 20ml de acetona y rena todos los
filtrados.
5. Lave el mortero y el embudo con 50ml de acetona que se incorporara al filtrado. En
todo el proceso no debe de usar mas de 100ml de acetona; se aconseja aforar a 50ml
en un matraz.
6. Lea la densidad ptica (D) a 645, 652, 663 nm del extracto. usando como
blanco el acetona. Anote las densidades medidas.
Anlisis y cuantificacin de antocianos
1. Macere 3g de ptalos de flores azules y colquelos en un vaso de 200ml, con
100ml. de agua y ponga a hervir durante unos minutos.
2. Enfre un poco el extracto y filtre
3. En 3 tubos de ensayo. coloque 5 ml del extracto
4. En tubo uno mida el pH de la solucin, utilizando un papel indicador.
5. Al tubo 2, agregue gota a gota la solucin de H2S04 0.1 N y observe cualquier
cambio de color con respecto al original. Determine el pH y contine la adicin del
cido para ver si ocurren otros cambios.
6. Al tubo 3 aada NAOH 0.1 N gota a gota y mide el pH de la solucin al transcurrir
un cambio de color.
Resultados
Densidad de 645 nm con absorbancia de 0.400
Densidad de 652 nm con absorbancia de 0.550
Densidad de 663 nm con absorbancia de 0.832
CLOROFILA A 0.47452
CLOROFILA B 0.263312
CLOROFILA TOTAL 1 0.737632
CLOROFILA TOTAL 2 0.7971
TRATAMIENTO COLOR pH
Extracto original amarillo 7
Extracto mas H2S04 rosa 3
Extracto ms NAOH verde 9
Mtodo de Lichtenthaler y Welburn (1983)
En un mortero se homogeniza 1 gr de hojas con ter dietlico en fro. El
homogeneizado obtenido se filtra a travs de un crisol con placa filtrante n 3 (Pobel),
acoplado, mediante una junta de goma, a un embudo con filtro de vidrio poroso n 3
(Pobel). El conjunto va encajado a su vez, en un kitasato con un tubo de ensayo
sumergido en hielo, donde se recogi el filtrado. Sobre la placa del primer crisol se
coloc una capa de celulosa nativa en polvo de 1 cm de espesor, para eliminar el agua
del extracto. A este sistema se le conecta una corriente de nitrgeno que se adapta
mediante un embudo invertido a la boca del crisol. En el interior del kitasato se realiza
vaco para acelerar la filtracin y evaporar el disolvente, con lo que se arrastra el
nitrgeno y se crea una atmsfera inerte que evita la oxidacin de los pigmentos.
El homogeneizado se lava con ter dietlico hasta que ste sale incoloro y, finalmente,
se enrasa a un volumen de 25 ml. Durante todo el proceso la muestra se mantuvo en
penumbra y sumergida en hielo, para evitar la destruccin de los pigmentos
fotosintticos.

A continuacin se midi la absorbancia de la muestra a 600, 644 y 662 nm en un


espectrofotmetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz. El contenido en clorofilas se
determin segn las frmulas :
Cl a :10,5 x Abs (662) 0,166x Abs (644)
Cl b : 16,37 x Abs (644) 3,14 x Abs (662)
Cl total : 100,5 x Abs (600)
Los resultados se expresan en mg de clorofila /gr
Utilizacin del espectrofotmetro:
Las etapas son:
1) El espectrofotmetro debe de encenderse al menos media hora antes de hacer una
medicin. Se comprueba que el aparato da una seal estable de ajuste del cero de
absorbancia.
2) Se selecciona la longitud de onda del mximo de absorcin del compuesto a medir
con el mando correspondiente.
3) Se selecciona la opcin de medir en absorbancia.
4) Se toma una cubeta de plstico de 3 ml, procurando cogerla de manera que no se
manchen las paredes de la cubeta que se expongan al haz de luz del
espectrofotmetro.
5) Se vierte en la cubeta un volumen de la solucin del blanco reactivo tal que ocupe
las tres cuartas partes del volumen de la cubeta (~ 2,5 ml).
6) Se coloca la cubeta en el compartimento de cubetas del espectrofotmetro,
procurando que las paredes lisas de la misma se coloquen en la direccin del haz de
luz del espectrofotmetro.
7) Se realiza el ajuste del cero de absorbancia. Este mando no se debe de tocar en las
posteriores etapas.
8) Se saca la cubeta y se devuelve la solucin blanco a su correspondiente tubo de
ensayo, procurando que en la cubeta no queden gotas (no es necesario secarla).
9) Se vierte en la misma cubeta la solucin que contenga la muestra problema.
10) Se introduce la cubeta en el compartimento de muestra del espectrofotmetro.
11) Se mide la absorbancia de la solucin de muestra problema.

Determinacin de protenas
Uno de los mtodos mas usados hoy en da es el mtodo de Bradford (1976) .
Mtodo de Bradford (1976)
Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin azul entre los
residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el colorante Azul de Comassie.
Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos
Reactivos:
Reactivo de Bradford
Disolver 5 mg de azul de Comassie en 2.5 ml de etanol al 96%

Aadir 5 ml de cido ortofosfrico al 85%


Diluir hasta 50 ml con agua destilada
Dejar reposar 24 h en oscuridad y filtrar 2 veces con papel de filtro o con filtros de 45
nm
Conservar en botella oscura no mas de 15 das
Patron de BSA, 100 microgramos/ ml en agua
Tcnica:
B
P1
P2
P4

P6

P8

Agua
100
90
80
60
40
20
Patrn
10
20
40
60
80
Problema
Bradford
1000 1000 1000 1000 1000 1000
Nota: todas estas cantidades estn expresadas en microlitros.
Agitar bien. Esperar 2-3 minutos.
Leer absorbancia a 295 nm.
La reaccin es estable durante 1 hora.
Lavar la cubeta con metanol entre medida y medida.

P10

Pr1

Pr2

100
1000

25
1000

50
1000

Mtodo de Makino
En este ejemplo concreto vamos a usar el kiwi como modelo.
Se tritura 1 g material en un mortero con nitrgeno lquido y 1% de
polivinilpirrolidona(PVPP) (p7v) con el fin de eliminar los fenoles. El polvo obtenido se
disolvi en 1 ml de tampn Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8. El extracto obtenido se utiliz para
determinar protenas totales y Rubisco.
El ensayo de protenas totales se realiz mediante annlisis colorimtrico, utilizando el
kit Protein Assay de BIORAD, USA. Antes de cada ensayo se realiz una curva de
calibracin con diluciones conocidas de una solucin de seroalbmina bovina (BSA),
entre 2 y 20 microgramos/microlitros.
Para la separacin del enzima rubisco ya se llevaron a cabo ms pasos y de mayor
complejidad.
Mtodo de Lowry
Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del biuret, el complejo protena-Cu 2+ se
hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una coloracin azul, con un
mximo de absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido
fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno de composicin no
definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos
e histidilos de las protenas que forman el complejo con el Cu2+.
Las caractersticas del mtodo son:
La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos de la
protena.
Es ms sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15 mg/ml.
Presenta muchas interferencias.

Complejo
Protena-Cu 2+
AA red.

Complejo
Protena-Cu 2+
AA oxid.

Reactivo Folin
oxid.
AMARILLO

Reactivo Folin
red.
AZUL

Esquema de la reaccin de Lowry


Reaccin del Biuret
El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la
condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco.

H2 N

CO

NH2

H2 N

CO

NH2

H2 N

CO

Urea

NH CO NH2

Biuret

Reaccin del Biuret


Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO 4) se aade a una
solucin de protena se forma una complejo entre el in cprico y los enlaces
peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo
de absorcin a 540 nm.
Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:
La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los
pptidos y protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

NH
RC H
O

HN
Cu2+

NH
RC H

H CR
C

HN
H CR

Violeta-prpura
Complejo protena-Cu(II)

Mtodo del cido bicincnico


Est basado en la reduccin en medio alcalino de Cu(II) a Cu(I) en medio
alcalino y la formacin de un complejo cido bicincnico:Cu(I), con un mximo
de absorbancia a 562 nm.
El rango de concentracin de protena es de 0,5-30 mg/ml.
Ms rpido que el mtodo de Lowry.
Altamente preciso y sensible.