A nivel de ADN: Hibridacin, PCR, ligacin:

Muestra: in situ (localizacin fsica), amplificacin de ADN de muestra, extraccin de ADN, microdiseccin
con rayo laser.
Tcnicas:
FISH, CGH, MLPA: rearreglos cromosomales, variacin en nmero de cromosomas.
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones)
deteccin de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligacin de oligonucletido, SNuPE (primer extension de un
nico nucletido), OSA (hibridacin con oligonucletidos
especficos), PASA (amplificacin alelo especfica),
alineamiento competitivo de oligonucletidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray
deteccin de mutaciones desconocidas: SSCP, RNAsa,
clivaje qumico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Determinacin de grado de metilacin de ADN

Se utilizan para detectar:

Rearreglos cromosmicos
Prdidas o ganancias cromosomales
Mutaciones puntuales y polimorfismos
Grado de metilacin
Permiten:
Deteccin de individuos portadores de
mutacin recesiva (Deteccin de mutacin en
genes oncosupresores en individuos que an no
desarrollaron cancer).

Diagnstico prenatal
Diagnstico preimplante en fecundacin
in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somticas:
determinacin de la base gentica de la
enfermedad, diagnstico, clasificacin
de tumores, ERM, prognosis).
Identificacin de SNPs

Real time PCR

Este mtodo se aplica tanto para la determinacin de duplicaciones y deleciones y para
alteraciones puntuales (polimorfismos y mutaciones). Diagnstico
Cuantificacin relativa (duplicaciones y deleciones) (MLPA y CGH)
Comparacin de cantidad de una determinada regin en el genoma entre dos situaciones (enfermo vs sano)

No de copias relativo

RA
RB

= 2 (CtB-CtA)= 2 (CtGen-CtRef)

Si la eficiencia es del 100%

Para calcular eficiencia: pendiente de la variacin del Ct con la dilucin para cada gen
Distintos tubos o mismo tubo con distintas sondas fluorescentes

Alteraciones puntuales (mutaciones y polimorfismos)

Anlisis de variacin de Tm

PCR en tiempo real

Discriminacin de alelos con primers especficos
o con sondas especficas

Variacin en el Tm:
a) Usar sonda FRET molecular beacon que hibride en la zona en que se encuentra la mutacin a analizar.
(no se usa sonda de hidrlisis ni Sybr green)
b) Anlisis del Tm del producto formado

Mezcla de
reaccin

Ej.: FRET
ADN del paciente producto de PCR
de una zona acotada
primer forward
primer reverse
sonda de anclado: 5LCRed-oligo
sonda sensora: oligo-fluorescena
dNTP
Taq pol

Sonda sensora

Aplicacin de Real time PCR para deteccin de variantes conocidas y desconocidas dentro de la secuencia de la sonda

Discriminacin de alelos

con primers especficos

con sondas especficas

PCR en tiempo real

Anlisis de variacin de Tm

Discriminacin de alelos con sondas especficas

Mutacin responsable
de la enfermedad de Tay Sachs
(insercin de 4 pb)

Molecular Beacon

Para aumentar el poder de discriminacin entre alelos hay que utilizar una sonda sensora lo ms corta posible
Se puede acortar an ms el tamao de la sonda mediante modificaciones que aumenten la estabilidad de la
doble cadena
Sistema de deteccin eclipse

Se puede utilizar una sonda PNA

(c nucleico peptdico)

Identificacin de la/s alteraciones responsables o que se asocian con una enfermedad

gentica
Clonado de un gen candidato
Aneuploidas
en meiosis
variacin en
nmero de
cromosomas

dada una enfermedad gentica

analizar sntomas y parmetros
que caracterizan la enfermedad.
Buscar gen candidato

Anlisis de ligamiento y clonado

posicional del gen
Si dos genes estn localizados en el
mismo cromosoma, en forma cercana
uno del otro es muy probable que se
hereden en forma conjunta

Estudios de asociacin
en una poblacin
Aplicable a enfermedades
Complejas.
Marcadores usados: SNPs
Diabetes, asma, autismo,
transtornos mentales, lupus,
migraa, hipertensin,
epilepsia, Alzheimer, etc.

Cancer
Alteracin en cromosomas
Comparacin de genomas
Comparacin de transcriptomas
Aplicable a enfermedades monogenticas,
Protemica
algunos cnceres en los que el gen que
Patrones de metilacin de ADN
predispone se hereda en forma mendeliana (gen de
o histonas.
Retinoblastoma).

Marcadores de posicionamiento usados: RFLP, SSLPs

Enfermedades genticas complejas

Estudios de asociacin en poblacin:

Estudios de gran escala de asociacin comparando en una poblacin casos vs controles sanos.
Se testea dentro de una poblacin la correlacin de la presencia de un alelo dado con la
presencia de la enfermedad.
Un marcador allico que se encuentra en una coleccin de individuos afectados con una
frecuencia diferente a la de la poblacin control, se dice que est asociado. Puede ser una
asociacin positiva (suceptibilidad) o negativa (resistencia). El marcador puede estar en el
mismo gen de suceptibilidad o puede ser un marcador asociado al alelo que causa suceptibilidad
(Desequilibrio de unin).

Desequilibrio de unin: ocurre cuando una combinacin

de alelos en diferentes locus ocurre ms frecuentemente en una poblacin
de lo que podra ser esperado por una asociacin al azar.
Cuanto ms cercanos ms probable que se hereden juntos.
SNPs:
Polimorfismos de un nico nucletido. Estos son diferencias en la secuencia de ADN en una nica
base que puede ser observada entre individuos de una poblacin. Se trata de polimorfismo si el
alelo menos comn ocurre en un porcentaje de 1% o mayor en una poblacin. Los SNPs se
presentan en el genoma humano con una frecuencia promedio de 1 cada 1000 pb. Son
generalmente biallicos entonces para aumentar el polimorfismo se debe determinar la asociacin
combinada de varios SNPs cercanos al gen de suceptibilidad (haplotipo).

Ejemplos de Genes de suceptibilidad:

Diabetes mellitus insulino-dependiente:gen de suceptibilidad del locus HLA.
Alzheimer: gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 (ApoE) y en cromosoma 12.
Migraa: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 y en cromosoma X.
Psoriasis: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 3.
Diabetes no insulino-dependiente: cromosoma 12 y cromosoma 2
Asociacin de distintos tipos de cancer con SNPs
La asociacin no es del 100% ya que otros genes son necesarios para para que la enfermedad se
desarrolle.
La fuerza de asociacin es una indicacin de la contribucin relativa del locus a la etiologa de la
enfermedad.
La gran mayora es un desequilibrio de unin entre un determinado alelo en un locus y un locus de
suceptibilidad a la enfermedad. Aqu la fuerza de asociacin es funcin de la distancia de
recombinacin entre el marcador y el locus de suceptilbilidad y de la contribucin relativa del locus a
la etiologa de la enfermedad.

Se estn elaborando actualmente mapas de alta densidad de SNPs del genoma humano. Se calcula que
hay mas de 10 millones de SNPs en el genoma humano.
De la gran cantidad de SNPs totales, interesan los que se encuentran en zonas codificantes, o
aquellas que afecten la regulacin de la transcripcin, el splicing o la traduccin de genes o sea que
el polimorfismo tenga una consecuencia funcional.
Tambin se estudian para cada enfermedad en particular, alrededor de genes que se sospecha
que puedan tener algn efecto en el desarrollo de la misma.

Utilidad en biomedicina de los SNPs

* Anlisis fornsico
* Establecimiento de relaciones entre diferentes poblaciones y dilucidar migraciones ancestrales
* Estudio de desordenes multifactoriales o complejos. Monitoreo de suceptibilidad y resistencia
Cononcer cuales son los genes de suceptibilidad permite contar con nuevos target para una terapia.

* Farmacogenmica

Mtodos de estudio de SNPs:

SNPs desconocidos: Secuenciacin (pyrosecuenciacin), SSCP, DGGE, Clivaje enzimtico de
heteroduplex,
microarray (variant detection array (VDA))
SNPs conocidos: Secuenciacin,
Cualquiera de los mtodos descriptos para deteccin de mutaciones conocidas
Microarray.

Ensayo a gran escala con miles de muestras

Microarrays (anlisis mltiple)

10

Microarrays
Hibridacin alelo especfica
Unir al soporte oligos correspondientes a las distintas variantes posibles para cada SNP. Cada
chip se tendr miles de oligos (array de alta densidad). Cada chip se hibrida con ADN
amplificado marcado de un individuo y se visualiza la seal positiva en las posiciones
correspondiente a los oligos complementarios a sus SNPs. Se puede aplicar tanto para la
deteccin de SNPs desconocidos como la determinacin de SNPs conocidos.

Deteccin de SNPs desconocidos

A y B: Distintos individuos

Array de deteccin de variantes (VDA)

1-25

2-26

3-27

4-28

etc

T
G
C
A
Oligos sintetizados sobre el soporte de 25 nt de longitud

Tamao 8L
Homocigotas, heterocigotas

Se amplifican distintas regiones del ADN, se marca y se hibrida sobre el chip (tambin es utilizable para deteccin de SNPs conocidos)

11

Sobre SNPs conocidos

1) Amplificacin de ADN y Hibridacin alelo especfica

(discriminacin sobre el array):
demasiados spots, demasiadas amplificaciones.

2) Amplificacin de ADN

Hibridacin alelo especfica (discriminacin sobre el array)

Cortar ADN con enzima de restriccin

Ligar adaptadores a los extremos de los fragmentos
Amplificar con un solo par de primers

3) Amplificacin de ADN

Hibridacin alelo especfica (discriminacin sobre el array)

PCR mltiple

12

4) Amplificacin de ADN

Discriminacin de alelo en
solucin

PCR mltiple

Deteccin sobre array

Hibridacin con productos de extensin de un nico nucletido (SNuPE SBE).

Protocolo
142 SNPs
9 reacciones (9 pooles, los SNPs
de cada pool comparten el mismo
polimorfismo,multiplex PCR)
9 multiplex SBE
ddUTP-biotina, ddCTP-fluorescena
Se combinan los pooles
Se hibridan a un chip que tiene
las secuencias complementarias
a los tags unidos a cada SNP
Lavado y tincin con
Phycoerytrina-streptavidina
escaneado

Variante genrica: Tag-SBE (array de oligonucletidos

genricos de alta densidad-

Coleccin de fluorescencia
A 530 y 560 nm

Los oligos (tag) no deben dar reaccin cruzada y deben

tener similares caractersticas de
hibridacin.

13

5) Discriminacin de alelo sobre el ADN

Amplificacin de los targets

discriminados con un solo par
de primers ( 3 primers)

genmico

Deteccin s/array
(array de secuencias
complementarias
a tags)

P1

Molecular Inversion probe

Discriminacin en la reaccin de
extensin de un solo nucletido

Golden Gate assay

Discriminacin por hibridacin
alelo especfica

14

Enfermedad determinada por alteraciones genticas: estudios que se pueden realizar

A nivel de protenas
A nivel de ARNm

A nivel de ADN

Deteccin de apoptosis

15

A nivel de ARNm:
Variacin en niveles de expresin de genes :
Hibridacin sustractiva por supresin
SAGE
Microarray
RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real)

16

SAGE

AAAAA
TTTTT b

cDNA synthesis

Cleave with anchoring enzyme (AE)

Bind to streptavidin beads
AAAAA
TTTTT b

GTAC

Divide in half
Ligate to linkers
A
+
B
CATG
GTAC

CATG
GTAC

AAAAA
TTTTT b

AAAAA
TTTTT b

Cleave with tagging enzyme (TE), Blunt end

Primer A

Primer B
GGATGCATGOOOOOOOOO
CCTACGTACOOOOOOOOO
TE
AE

GGATGCATGXXXXXXXXX
CCTACGTACXXXXXXXXX
TE AE
Ligate and amplify with
primers A and B

GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC
CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACCTAGG
Ditag
Cleave with anchoring enzyme
Isolate Ditags
Concatenate and clone

-----CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG---------GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC----AE

Tag 1

Tag 2
Ditag

AE

Tag 3

Tag 4
Ditag

AE

Serial analysis of Gene Expression (SAGE)

redrawn from (Velculescu et al., 1995)
mRNA is reverse transcribed using biotinylated
oligo(dT) primers to produce cDNA, and this is
subsequently cleaved with a 4 bp recognition site
restriction endonuclease (e.g. NlaIII) termed the
anchoring enzyme (AE). Restriction fragments,
biotinylated at the 3 end, are immobilised using
streptavidinated beads and then divided in half.
Each fraction is ligated to one of two adapter linkers
(A and B), designed to contain sequence
complementary to the overhangs produced by the
anchoring enzyme, a type IIS restriction enzyme
recognition site (e.g. BsmFI) known as the tagging
enzyme (TE), and sufficient additional sequence
complementary to adaptamer PCR primers.
Cleavage with the tagging enzyme releases the
linker and a short cDNA sequence known as the
tag. Tags from pools A and B are blunt ended and
ligated to each other to form ditags. Ditags serve
as amplification templates for PCR using adaptamer
primers A and B, and cleavage of amplification
products with the anchoring enzyme releases the
ditags. Ditags are concatenated by ligation and
concatemers cloned and subsequently sequenced.
Serial sequence analysis of ditags of fixed length is
achieved using the anchoring enzyme recognition
site as punctuation in the sequence.

17

18

19

Microarray aplicado a expresin genmica: el mRNA proveniente de una dada lnea

celular o tejido se usa para generar una muestra marcada que se hibrida en paralelo, a un gran
nmero de secuencias de ADN, inmovilizado sobre una superficie slida en forma ordenada.
Miles de transcriptos pueden ser detectados simultneamente.

20

Aumento de cantidad de RNA para microarray

(cuando hay poca muestra)

dNTP marcados

21

Objetivos

Inters en hallar el cambio en la expresin

gnica, causa de la alteracin del fenotipo

Tambin para anlisis

de hipermetilacin

Redundancia
Insuficiencia
Reg. Traducc.

Muestras a
comparar

Estudiar patrones de expresin global

# estados
#etapas del
ciclo celular
Activacion
por # factores

Software:
para
comparain
de
# patrones de
expresin

Causa o efecto?

validacin de los resultados

22

Ejemplo: Distinguir distintos tipos de linfoma difuso de clulas B (DLBCL)

Morfologica y inmunohistoqcamente
homogeneo.
DLBCL
Clinicamente heterogneo, solo el
40% responde bien a la terapia.
FL
Array de 18000 cADN:
Genes que se inducen o reprimen durante
la activacion de clulas B y T por
mitgenos. cADN de clulas B
germinales. Biblioteca de DLBCL.
Clones con cADN de linfoma folicular
(FL), de leucemia (CLL) y de otros linfomas.
y otros genes de importancia en linfocitos y
en biologa del cancer (reproducibilidad)

Muestras cuyo perfil de mRNA se

estudi: DLBCL, FL, CLL, linfocitos
en distintos estados. Del mRNA
proveniente de cada muestra se
obtuvo un cADN marcado con Cy5.
Se compara con un cADN de calibracin
(obtenido de pool de mRNA de 9 lneas
celulares de linfomas) marcado con Cy3.

CLL

G
E
N
E
S

En total: 1.800.000 medidas en 96

muestras usando 128 microarrays.
<

>

Genes coordinadamente
expresados en muestras
relacionadas

23

Cel B s/act
Cel B Germinales
DLBCL
FL

CLL

Distincion entre FL y CLL por un lado

Y DLBCL

Inhomogeneidad en
DLBCL

24

Descubrimiento de distitos tipos

en el linfoma difuso de celulas B (DLBCL)

Hay dos grupos bien diferenciados en base a

la expresion de genes de B germinal y de
genes de B activados (no histologica ni
inmunologicamente).
Clasificacion de paciente: en base a los dos
sets de genes (heterogeneidad)

A los 5 aos de tratamiento

sobrevive el 52% del total
(76% delos GC-like
Y 16% de los B-like.
Buscar dentro de cada tipo
subgrupos en base a expresin
de otros genes

Potencial del anlisis de cluster

Identificar funcin de genes desconocidos por asociacin con genes conocidos

Identificar la firma de un tipo celular o estado. Util para clasificacin de tumores
Identificar un mecanismo de control de la transcripcin

25

RT-PCR en tiempo real

IL1-b A

Referencia B
Referencia A
IL1-b B

Numero de veces diferentemente expresado en el estado A respecto del estado B

= Eficiencia (CtA-CtB)

CtA= Ct gen-Ct referencia en la condicin A (patolgica)

CtB= Ct gen- Ct referencia en la condicin B (sano)

26

Cambios epigenticos

Hipermetilacin

Metilacin aberrante
de DNA e histonas

Identificacin sitios de hipermetilacin

Anlisis de la alteracin de expresin por desmetilacin por la tcnica de microarray
Validacin: PCR y secuenciacin post tratamiento con bisulfito de sodio
PCR en tiempo real post tratamiento con bisulfito
RT-PCR en tiempo real

Diagnstico: Deteccin, clases de tumor, prognosis

1) Efecto de metilacin sobre corte con enzimas de restriccin

2) Cambio de nucletido por accin del bisulfito de sodio y deteccin alelo especfica de mutacin
Ejemplo PCR en tiempo real: -discriminacin alelo especfica (con primers especificos) (Tokum
-Variacin en Tm

3) Silenciamiento de transcripcin por metilacin por RT-PCR en tiempo real (Sybr green)

27

28

Metodo de deteccin de SNPs en multiwell

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