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INTRODUCCION

Las reacciones de aglutinacin y de precipitacin son la base de la mayor parte de


las tcnicas inmunolgicas. Su principio se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo.
Para comprender lo anterior es necesario definir qu es un antgeno y un
anticuerpo. Antgeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez
estructural y que tiene la particularidad de ser parcialmente metabolizado por
clulas especializadas llamadas macrfagos, por lo tanto es capaz de generar una
respuesta inmune en un organismo que la detecte como un agente extrao.
Mientras que un anticuerpo es una glicoprotena, producida por linfocitos B
activados, llamados clulas plasmticas, como respuesta a la presencia de un
antgeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por lneas
celulares in vitro, como es el caso de la produccin de anticuerpos monoclonales.
Dichos anticuerpos llamados tambin inmunoglobulinas, se presentan en cinco
clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre s por sus
caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas.
La capacidad inmunognica de distintas partculas, es en orden decreciente la
siguiente: protenas, glicoprotenas, polisacridos, lpidos y azcares. Las
reacciones de precipitacin son medibles en cantidad y son fciles de ejecutar. Las
tcnicas de aglutinacin son slo semicuantitativas y algo ms difciles. La
aglutinacin de los antgenos nativos insolubles o de las partculas recubiertas por
el antgeno puede evaluarse a simple vista con o sin la ayuda del microscopio. Entre
las ventajas de las reacciones de aglutinacin estn su alto grado de sensibilidad y
la enorme variedad de substancias identificables a travs del uso de partculas que
estn recubiertas por antgeno o por anticuerpo.
Segn Coombs existen 3 requerimientos principales
en las pruebas de aglutinacin:
1. Disponibilidad de una suspensin estable de clulas o de partculas.
2. Presencia de uno o ms antgenos cercanos a la Superficie.
3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son
localizables sin modificacin (Reacciones antiglobulina).

IX. PRACTICA No 9: PRUEBAS SEROLGICAS: DETERMINACIN DE


FIEBRE TIFOIDEA, PARATIFOIDEA, MALTA, SIFILIS
AGLUTINACIONES
Marco terico
Microbiologia de la Salmonella typhi
La Salmonella typhi es un bacilo gram negativo,
Estructura antignica de la Salmonella typhi
El gnero Salmonella tiene una estructura antignica similar al resto de
enterobacterias, con tres tipos de antgenos (figura 2):
1. Antgeno somtico (O)
2. Antgeno flagelar (H) o (d)
3. Antgeno capsular o de envoltura (Vi) o (K) (especfico para Salmonella typhi,
dublin, y paratyphi C)

Estructura antignica de la Salmonella


El antgeno somtico O, nombrado as del alemn ohne hauch, que significa sin
movimiento, esta conformado por una cadena repetida de polisacridos, que hace
parte del lipopolisacarido (LPS) de la pared celular; por lo general, el antgeno O no
es nico(3,5), sino que esta constituido por diversos factores antignicos, algunos
de los cuales pueden ser comunes con otros serotipos y permiten dividir las
Salmonellas en grupos O, por ejemplo, O:9 y O:12 (figura 3)(4). En cuanto a la
distribucin del antgeno O en los diferentes serogrupos de Salmonella, es de
anotar que en el grupo D, la totalidad de sus 78 serotipos consta de antgeno O:9,
sin embargo 59 de estos, adicionalmente expresan O:12; a diferencia de los
serogrupos A y B en los cuales todos sus serotipos presentan O:12, esto explica las
mltiples reacciones cruzadas en el test de Widal con Salmonellas no typhi El
antgeno flagelar H deriva su nombre igualmente del alemn hauch, por el halo
producido en un medio de cultivo a raz del movimiento, es una protena ter- molbil
a diferencia del antgeno O; segn este, las Salmonellas pueden ser monofsicas,
cuando contienen siempre el mismo antgeno flagelar, generalmente especfico ( S.
typhi, S. paratyphi A), o difsicas, cuando el antgeno flagelar puede presentarse
alternativamente en fase especfica o menos especfica, que puede ser comn con
otras Salmonellas (fase I y fase II)(3).

El antgeno capsular Vi, denominado as por ser el determinante en la virulencia de


esta bacteria, ya que confiere resistencia contra la respuesta

Estructura antignica de la Salmonella

Bases inmunolgicas de la reaccin de Widal


La reaccin de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes
(aglutininas) contra los antgenos H (flagelar) u O (somtico) de la Salmonella typhi
en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea.
Los anticuerpos contra el antgeno O aparecen luego de 6 a 8 das de iniciada la
enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses.
Los anticuerpos contra el antgeno H aparecen a los 8 a 12 das, alcanzando ttulos
mas elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por ms de 1 ao.
Los anticuerpos contra el antgeno Vi aparecen mas tardamente, a la tercera
semana, sin embargo lo hacen en ttulos bajos 1:10-1:20 con respecto a los
previos(3) (tabla 2).

Limitaciones de la reaccin de Widal


La importancia de la aglutinacin de Widal radica en ser un mtodo serolgico,
rpido, barato, y ampliamente conocido para el diagnstico de la fiebre tifoidea;
sin embargo, tiene grandes limitaciones por reacciones antignicas cruzadas con
otras bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo Salmonellas no typhi),
parsitos, virus y hongos, llevando con frecuencia al clnico a sobre diagnosticar
sndromes febriles como fiebre tifoidea

Procedimiento
Tomar muestra de sangre venosa y luego centrifugar para la obtencin del suero,
del cual trabajaremos.

Las determinaciones comprenden dos etapas:


1. Prueba presuntiva:
Con una pipeta serolgica o una micropipeta depositar una gota de suero
problema en cada cuadrado.
A cada gota de suero se le aade una gota de cada antgeno previa agitacin.

Mezclar con un palillo mondadientes para cada cuadrado y leer en el trmino


de uno a tres minutos.

Lectura: La reaccin es positiva cuando aparece aglutinacin en uno de los 5


cuadrados, de lo cual se proseguir a la titulacin.

Prueba de titulacin:
Se preparan 5 cuadrados limpios y con una pipeta depositar en cada uno el
volumen de suero ya agregar 1 gota de reactivo y mezclar.

80 ul de suero

titulo 1/20

40 ul de suero

titulo 1/40

20 ul de suero

titulo 1/80

10 ul de suero

titulo 1/160

5 ul de suero

titulo 1/320

Valores de referencia:
Ttulos 1/40 1/80 sospechosos de enfermedad.
Ttulos > 1/80
considerados probatorios de enfermedad.

RESULTADOS:
En la prueba presuntiva no hubo presencia de aglutinacin, por lo cual no se
procedi a realizar la prueba de cuantificacin.

CONCLUSIONES:
Se concluye que el paciente no presenta anticuerpos especficos para tifoidea,
de lo cual se afirma que es negativo para esa enfermedad.

Cuestionario
1. Cul es la importancia
aglutinaciones?

clnica

de

la

determinacin

de

las

Las Salmonellas se consideran patgenos entricos obligados. Los alimentos y el


agua contaminados son los mecanismos de transmisin. La enfermedad puede
presentarse como gastroenteritis, septicemia con lesiones en diversos rganos o
fiebre tifoidea.
La Brucelosis se presenta en la mayora de los casos con anorexia, fiebre,
decaimiento y escalofros, pudiendo aparecer luego complicaciones importantes
como son las seas y neuropsquicas. A pesar de que el mtodo definitivo para
establecer la etiologa de estas enfermedades es a travs del aislamiento del
agente patgeno, esto resulta difcil debido a que la investigacin se realiza
frecuentemente en perodos tardos de la enfermedad y luego de una terapia
antibitica. Por este motivo es de gran importancia diagnstica la deteccin de los
anticuerpos especficos producidos en el curso de cada una de estas patologas.
Una prueba aislada es de escaso valor, siendo necesarias 2 o ms pruebas seriadas
a fin de poner en evidencia cambios en el ttulo de anticuerpos.

2. Cul es la interpretacin clnica de los valores TO y TH elevados?


VALORES DE REFERENCIA

Generalmente ttulos de 1:40 1:80 son sospechosos de enfermedad.

Slo ttulos mayores de 1:80 pueden considerarse probatorios de


diagnstico de enfermedad cuando estn acompaados de la sintomatologa
clnica.

Ttulos mayores de 1:320, son concluyentes.

B. DIAGNSTICO DE SIFLIS
Marco terico

La sfilis es una enfermedad infecciosa cuyo agente causal es el Treponema


pallidum, perteneciente, junto con otros treponemas (borrelias y leptospiras) a la
familia Treponemataceae. El mecanismo de transmisin es por contacto directo con
las lesiones, por paso a travs de la placenta o por transfusiones de sangre
contaminada, aunque actualmente este ltimo mecanismo es muy raro que ocurra.
Tras un periodo de incubacin de 12 a 90 das, aparece en el lugar de la inoculacin
una lesin primaria, rica en treponemas, que desaparece en algunas semanas.
Durante esta etapa, llamada sfilis primaria, el T. pallidum se multiplica en los
ganglios y se distribuye por la sangre a todos los rganos del individuo (infeccin
sistmica). En el segundo estadio, la manifestacin ms frecuente es el exantema,
que puede afectar a cualquier superficie del cuerpo acompaado de sntomas
generales; las lesiones abiertas son muy contagiosas. Tras la primera desaparicin
espontnea de la misma y durante el primer y segundo ao, pueden aparecer brotes
similares cada vez de menor intensidad (fase de latencia precoz) hasta que
desaparecen todos los sntomas y signos (fase de latencia tarda). En la evolucin
de los casos no tratados, se puede presentar un periodo terciario con posibilidad
de alteraciones mucocutneas y de los sistemas
seo, cardiovascular y nervioso (neurosfilis). La identificacin del T. pallidum
mediante el examen directo del exudado de la lesin (campo oscuro y/o
fluorescencia directa) es una prueba definitiva para asegurar el diagnstico,
aunque un resultado negativo del mismo no descarta la posibilidad de la
enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser escasa dependiendo de
los das de evolucin y de tratamientos previos. Debido a las dificultades que puede
presentar la realizacin del diagnstico directo, la experiencia indica que el
diagnstico indirecto (serolgico) se ha convertido en el procedimiento de uso ms
frecuente .
Actualmente existen diferentes tcnicas para el diagnstico serolgico de sfilis:
las no treponmicas (reagnicas) no determinan anticuerpos especficos frente a
Treponema pallidum y se basan en antgenos compuestos de soluciones alcohlicas
con cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina. Miden
anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos daados
por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research Disease
Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum
Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA (Enzimoinmunoensayo). Son de bajo
costo, fciles de efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la deteccin de
sfilis y para evaluar la respuesta al tratamiento. La desventaja que presentan es
que, debido a su inespecificidad, pueden arrojar falsos resultados positivos.

FUNDAMENTOS DEL METODO


En la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), las "reaginas" presentes en el
suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por accin de
las mismas con antgeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre
partculas de carbn.
La reaccin produce una aglutinacin visible macroscpicamente, favorecida por las
partculas de carbn. Las reacciones inespecficas se evitan con el empleo de
antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es
necesario inactivar la muestra.

Procedimiento
MTODO DE RPR
Es una prueba serolgica plasmtica de floculacin macroscpica
RPR CUALITATIVO EN PLASMA
1. Colocar 0.05ml de suero a evaluar o una gota utilizando el aplicador
del kit no olvidar colocar los sueros control.

2. Con ayuda del aplicador extender la muestra dentro del crculo sin
salir del margen.

3. Agregar 0.017ml del antgeno con micropipeta o una gota con el


gotero del kit sobre la muestra a evaluar.
4. Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador, por 8 min a 100
RPM, o hacerlo manualmente.
5. Luego de los ocho minutos hacer la lectura con ayuda de la lmpara
de luz.

Muestra del paciente

Control positivo

VALORES REFERENCIALES
Reactivo.-(R) Grumos grandes medianos, o pequeos pero definidos
No reactivo (NR) Sin grumos si se observa grumos definidos o
pequeos debe realizarse la prueba cuantitativa.

RESULTADOS:
La muestra de suero no se observo floculacin de cual se afirma como no NO
REACTIVO.

CONCLUSIONES
Se concluye que el RPR es una prueba indirecta para la determinacin de sfilis,
de lo cual indica la presencia de anticuerpos en el organismo del paciente.

Cuestionario
1. En que se diferencian las pruebas de VDRL y RPR?

VDRL
Esta prueba se puede realizar en lmina y ser observada al microscopio como un
precipitado de partculas finas (floculacin), o se puede realizar en un tubo de
ensayo y ser leda macroscpicamente.
Los resultados de VDRL en lmina son comunicados como no reactivos (no hay
floculacin, dbilmente reactivos (ligera floculacin, y reactivos floculacin
definitiva. Todos los sueros reactivos se diluyen seriadamente, a cada dilucin se
le realiza la prueba de VDRL y se registra el titulo mximo obtenido. Rara vez se
tiene un paciente con ttulo elevado en las diluciones y con VDRL no reactivo en
la muestra sin diluir (fenmeno de prozona), si ocurriera es ms frecuente en la
sfilis secundaria1,10.
Se obtiene falsos negativos en ciertas condiciones, tales como fenmeno de
prozona, bajo ttulo de anticuerpos, presencia de sustancias inhibidoras en el
suero del paciente, VIH, la temperatura ambiental fuera del rango de 23-29 C o
error tcnico.
RPR
El RPR es una prueba diseada para detectar reagina en el suero de manera
rpida, no requiere inactivacin por calor La muestra se mezcla con una
suspensin que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partculas de
carbn. Si la muestra es positiva se observa pequeos grumos negros
(floculacin). El resultado se reporta como reactivo o no reactivo; todos
aquellos reactivos deben ser diluidos seriadamente para realizar la titulacin,
y se reporta la dilucin ms alta que exhibe reaccin.
Los falsos negativos se pueden producir por errores tcnicos y los falsos
positivos son los mismos que para la prueba de VDRL.

2.Cules son las pruebas confirmatorias de un VDRL positivo?

Las pruebas treponmicas, en cambio, detectan especficamente los anticuerpos de


Treponema pallidum y su utilidad en el laboratorio est orientada a confirmar los
resultados arrojados por las pruebas no treponmicas. Las pruebas treponmicas
ms conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin del
suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin y doble
tincin), TPHA (Micro hemaglutinacin), Captia syphilis M (ELISA de captura anti
cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo ndice
de falsos resultados, tanto positivos como negativos.

REFERENCIAS DE INTERNET
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrehttp://www.wienerlab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/6369_antigenos_febriles_sp.pdfvistas/derm
atologia/v10_sup1/pruebas_lab.htm
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043p.pdf
http://www.revista-api.com/2%20edicao%202006/pdfs/mat%2006.pdf
http://www.scielo.org.ar/pdf/abcl/v38n3/v38n3a05.pdf
http://www.wienerlab.com.ar/wiener/catalogo/archivos/6392_rpr_slide_test_sp.pdf