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INTRODUCCIN

Las tinciones en microbiologa son las primeras


herramientas que se utilizan en el laboratorio para el
diagnstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace
ms de un siglo han ayudado a resolver problemas de
etiologa microbiana. Hay una gran variedad de tinciones,
que se han ido desarrollando para la deteccin de los
diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen
bacterias, parsitos y hongos.
La tincin de Gram se considera bsica en la
valoracin inicial de muestras para anlisis bacteriolgico,
mientras que la tincin de Wright se ocupa para el
diagnstico de enfermedades muy particulares en el rubro
de la parasitologa. Hay tcnicas tintoriales especficas de
gran utilidad, como la tincin de Ziehl-Neelsen, que se
utiliza para el diagnstico de enfermedades crnicas como
la tuberculosis o la actinomicosis, o la tincin de azul de
lactofenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos.
Las
diferentes
tinciones
en
el
laboratorio
microbiolgico tienen una utilidad fundamental para el
diagnstico y tratamiento oportuno de mltiples patologas
de etiologa infecciosa.

I. OBJETIVOS:
a) Conocer las diferentes tcnicas de tincin y coloracin bacterianas
y utilizarlas correctamente.
b) Identificar las diferentes formas bacterianas.

II. MARCO TERICO:


2.1. Coloracin simple:
La coloracin simple permite observar la presencia de
microorganismos, forma, tamao, disposicin de las clulas
microbianas, usa solo un colorante bsico o cido en solucin acuosa,
ocasionalmente puede aadirse un mordiente. La tincin simple
puede ser directa para teir la estructura microbiana mientras el
medio permanece sin colorear; y tincin simple indirecta, cuyo
objetivo es teir el entorno que rodea la estructura microbiana
mientras esta permanece sin teir.

a) Azul de metileno: La tincin con azul de metileno puede


ser til grnulos metacromticos (tincin directa).
b) Azul de lactofenol: La tincin con azul de lactofenol es til
para la identificacon de estructuras, esporas y hongos (tincin
directa).
c) Tincin negativa: La tincin negativa, nigrosina o tinta
china, permite observar las bacterias con color traslcido sobre un
campo oscuro (tincin indirecta).

2.2. Coloracin diferencial:


Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan
para diferenciar de manera ms explcita los microorganismos. Estas
tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de

ms de una sustancia tintrea. En algunas tcnicas de coloracin, las


tinciones diferenciales ms importantes que se emplean en
bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-resistente. Ambas
tinciones se utilizan para obtener informacin acerca de la
composicin de las capas de la pared celular de las clulas
bacterianas.
a) Tincin de Gram: Esta tincin es un procedimiento de gran
utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas
microbiolgicas. Es definida como una tincin diferencial, ya que
utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.
Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en
1884; hoy en da, sigue siendo una de las tinciones ms utilizadas
universalmente debido a lo econmico, sencillo y eficaz que resulta.
La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario
cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared
bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como
mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formacin de un
complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una
mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y
cierra los poros de la misma, tambin destruye la membrana externa
de las bacterias Gram negativas debido a que sta es soluble a la
accin de solventes orgnicos, como la mezcla de alcohol-acetona.
Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de
peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras
que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos
cantidad de peptidoglicano. Por ltimo, se coloca safranina, la cual
funciona como un colorante secundario o de contratincin y sirve
para teir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal
violeta-yodo.

b) Tincin de Ziehl-Neelsen: La tincin de Ziehl-Neelsen es la


tcnica comnmente usada en el diagnstico rutinario de
tuberculosis. Esta tincin permite diferenciar a las bacterias en dos
grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloracin con
alcohol-cido y aquellos que no lo son.
La tincin se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la
preparacin ligeramente para solubilizar las ceras, lpidos y otros
cidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del
colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los cidos miclicos
presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la
pared vuelven a solidificar, resistiendo la accin abrasiva del alcoholcido, y el azul de metileno se utiliza como contratincin. Una tincin
positiva es aqulla en la que se observan bacilos cido-alcohol
resistentes, loscuales son de color rojo fucsia.

III. MATERIALES:
_Material biolgico

_ Aceite de inmersin

_ Microscopio

_ Hisopos

_ Porta y cubreobjetos
_ Tinta china, azul de metileno, azul de lactofenol.
_ Aceite de inmersin

_ Microscopio

_ Bateria para tincin Gram (cristal violeta, lugol, alcoholacetona, safranina).

IV.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
4.1 Procedimiento para el azul de metileno:
a) Hacer un extendido a partir de una muestra de saliva bucal
tomada con hisopo.
b) Dejar secar por unos minutos.
c) Cubrir el extendido con una pequea cantidad de azul de
metileno, djelo actuar por un minuto.
d) Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante.

e) Examinar la preparacin teida al microscopio.

4.2 Procedimiento para la tincin Gram:


a) Hacer un extendido de la muestra (saliva bucal y tierra).
b) Dejar secar por unos minutos o calentar de forma suave.
c) Cubrir el extendido con el cristal violeta (colorante primario) y
dejar actuar por un minuto.
d) Lavar el exceso con agua.
e) Cubrir el preparado con Lugol (mordiente) y deje actuar por
un minuto.
f) Lavar con agua.
g) Decolore con alcohol cetona por 15 segundos.
h) Lavar con agua
i) Aplicar la safranina (contraste) y dejarla actuar por unos 30 a
60 segundos.
j) Lavar con agua.
k) Secar la preparacin y observar con el microscopio.

VI. CONCLUSIONES:
_Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiologa
permiten el diagnstico oportuno y sugerente de los agentes
infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisin del
tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Las tinciones son
importantes en la microbiologa porque:
* Proporciona contraste entre el microorganismo y el
medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfolgicos.

* Permite el estudio de las estructuras internas de las


clulas bacterianas, tales como paredes celulares, vacuolas o cuerpos
celulares.

VII. CUESTIONARIO:
7.1 Mencione los factores que afectan toda tcnica de
coloracin
_ Concentracin de los reactivos de tincin.
_ pH adecuado.
_ Tiempo de tincin.
_ Temperatura adecuada.
7.2 Indique a que se denomina MORDIENTE, mencione algunos
ejemplos.
Son los reactivos o sustancias que preparan al tejido para la
coloracin, comunicndole las apetencias colorantes. El uso de los
reactivos mordientes es imprescindible en aquellos casos en que la
materia orgnica se muestra refractaria a los colorantes. Algunos
ejemplos: Alcohol etlico, lugol, cido crmico, bicromato potsico y
acetato de cobre.
7.3 Qu funcin cumplen el Lugol en la coloracin Gram?
El lugol cumple la funcin de mordiente e impide la salida del
cristal violeta por la formacin de un complejo cristal violeta-yodo que
satura los espacios de peptidoglicano de la pared bacteriana.

7.4 Cul es la funcin de la fucsina fenicada en la coloracin


Zihel Neelsen?
Su funcin es adherirse a los cidos miclicos de la pared
celular por accin del calentamiento de la muestra.
7.5 A qu se denomina colorante primario y colorante de
contraste?
Colorante primario: Es un colorante bsico (+), que entra en
contacto con las clulas cargadas negativamente y reacciona con
ellas. El ms utilizado es el cristal violeta.

Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color


que el colorante primario como la safranina.
7.6 Mencione 5 ejemplos de bacteria Gram+ y 5 ejemplos de
bacteria GramGram positiva: Bacillus anthrasis, Clostridium perfringes, Clostridium
tetanis, Clostridium botulini, Lactobacillus acidofillus.
Gram negativos: Neisseria gonorrhoeae (gonorrea),
meningitidis, Escherichia coli, Salmonella enteriditis.

Neisseria

BIBLIOGRAFA
* Las tinciones bsicas del laboratorio de microbiologa (Artculo de
revisin)
* De la Torre y Callejas, Salvador Luis. Manual bsico de microtecnia
biolgica. Edicin Revolucionaria. Instituto Cubano del Libro. La
Habana, 1975. p.113.
* http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm