Hacia una estrategia rentable para la produccin de cutinasa por una

recombinacin de Saccharomyces cerevisiae: cepa aspectos fisiolgicos.

Abstracto
Aunque la fisiologa y el metabolismo del crecimiento de cepas de levadura se
ha estudiado ampliamente, an quedan muchas preguntas sin respuesta en la
induccin de la produccin de una protena recombinante se refiere. Este
trabajo se refiere a la produccin de un Fusarium solani pisi cutinasa por un
Saccharomyces cerevisiae recombinante la tensin inducida a travs del uso
de un promotor galactosa.
La cepa es capaz de metabolizar el inductor, galactosa, que es una fuente de
carbono mucho ms caras que los la glucosa. Tanto el transporte de galactosa
en la clula -requerida para la induccin de la produccin de cutinasa y
metabolismo de la galactosa son altamente reprimida por la glucosa.
Diferentes estrategias de fermentacin fueron probadas y el comportamiento
del cultivo fue interpretado en vista de la cepa metabolismo y la fisiologa. Una
fermentacin de alimentacin discontinua se realiz con una alimentacin
mixta de glucosa y galactosa a cabo, durante el cual el consumo simultneo de
ambos hexosas se logr, siempre y cuando la concentracin de glucosa en el
medio no superior a 0,20 g / l. Los costos, en trminos de hexosas, incurridos
con esta estrategia de fermentacin se redujeron a 23% de los que resultan de
la fermentacin llevada a cabo utilizando una estrategia ms convencional, a
saber, una fermentacin de alimentacin discontinua con una alimentacin de
galactosa.
Introduccin
Cutinasas son enzimas hidrolticas que degradan la cutina, un polmero
cuticular de las plantas superiores, con numerosas y muy diversas aplicaciones
comerciales potenciales (Carvalho et al. 1999). Con el fin de obtener un
sistema de produccin eficiente y de bajo costo para la cutinasa de Fusarium
solani pisi, esta enzima se produce en exceso en la cepa recombinante de
Saccharomyces cerevisiae SU50. Para la expresin heterloga de cutinasa de
cDNA, el fragmento maduro del gen se clon en un vector de expresin de
levadura. El gen de la cutinasa est fusionado a la secuencia seal de la
invertasa para lograr la secrecin de cutinasa eficiente. La expresin est
controlada por el promotor inducible fuerte GAL7 (Van Gemeren y col. 1995).
La productividad de las fermentaciones que emplean microorganismos
recombinantes depende de mltiples factores, a saber, interactuando
relaciones entre la fisiologa microbiana, nmero de copias y la estabilidad del
plsmido, y la expresin gnica. S. cerevisiae ofrece varias ventajas como un
husped para la produccin de protenas heterlogas: (1) la disponibilidad de

una gran cantidad de informacin relativa a su biologa molecular y la

fisiologa; (2) facilidad de manipulacin gentica; (3) la capacidad de llevar a
cabo despus de la traduccin modificaciones, (4) larga historia de uso en los
procesos industriales tradicionales, siendo generalmente considerados como
seguros. Adems, S. cerevisiae tiene ventajas con respecto a la secrecin de
producto, tales como una va secretora bien caracterizada. Tambin, se secreta
normalmente slo un nmero muy pequeo (5%) de sus propias protenas al
medio, lo cual es ventajoso para la recuperacin del producto (Smith et al
1985; Bitter et al 1987; Das y Shultz, 1987; Calado et al. 2001). La prdida de
producto debido a la degradacin por las proteasas de cutinasa secretada por
S. cerevisiae es insignificante (Verrips et al. 2000). Sin embargo, como una
cepa husped, S. cerevisiae todava plantea varios problemas, a saber:
1. La represin por glucosa: fuentes de carbono industriales comunes se
componen de una mezcla de azcares que se utilizan secuencialmente. Una
cepa desreprimido glucosa sera utilizar todos los azcares del medio complejo
al mismo tiempo, acortando el tiempo de produccin y evitar problemas
ambientales. Adems, la glucosa es conocida por reprimir el sistema de
expresin GAL-mediada.
2. Efecto Crabtree: fermentacin alcohlica puede producirse incluso en
condiciones aerbicas completamente, afectando negativamente a los
rendimientos de biomasa y tambin el rendimiento cutinasa como cutinasa
heterlogo producido durante la fermentacin se correlaciona con la biomasa
producida (Verrips et al 2000.).
Adems, las altas concentraciones de etanol disminuyen la cantidad de
protena recombinante producida (Park et al 1995;.. Kapat et al 2000) y
proteasas que degradan la protena recombinante pueden ser expresados
durante el crecimiento en etanol (Gimnez et al 2000.). La cepa utilizada en
este trabajo se sabe que presentan un fuerte efecto Crabtree (Giuseppin et al.
1993). La fermentacin alcohlica se minimiza actualmente durante el
crecimiento aerbico de levadura al operar en el modo de alimentacin por
lotes en condiciones en que limita el suministro de fuente de carbono de la
tasa de crecimiento y la capacidad de aireacin completa del recipiente se
utiliza. La cepa utilizada en este trabajo es capaz de metabolizar el inductor,
galactosa, que es mucho ms caro que la glucosa. Por lo tanto, una estrategia
de fermentacin optimizada debera mejorar la productividad y reducir al
mnimo el consumo de cutinasa galactosa. Los experimentos realizados tenan
por objeto proporcionar conocimientos fundamentales para permitir una mejor
comprensin de los aspectos fisiolgicos involucrados en cutinasa
recombinante
La produccin por la levadura. La primera fermentacin consisti en una fase
de lote en glucosa, seguido de un perodo de alimentacin por lotes durante el

cual se aadi galactosa como fuente de carbono. Para entender mejor los
efectos de cultivar la cepa en galactosa, una fermentacin por lotes se realiz
con galactosa como fuente de carbono. Siguiente, una tercera fermentacin se
llev a cabo, incluyendo un lote y un perodo de alimentacin por lotes,
utilizando una mezcla de glucosa y galactosa como fuente de carbono en
ambos perodos, para estudiar la represin de glucosa y la posibilidad de
combinar la productividad de biomasa ms alta obtenida en la glucosa con la
accin inductiva de galactosa. Se utilizaron medios complejos, con el objetivo
de imitar las condiciones del proceso industrial.
Materiales y Mtodos
Cepa
Se utiliz la cepa SU50 de S. cerevisiae (Mata, ciro, leu2-3, 112, his4-519, can1)
que contiene el vector de expresin pUR7320. La cepa se construy y
proporcionado amablemente por el Laboratorio de Investigacin de Unilever,
Vlaardingen, Pases Bajos. Los plsmidos que contenan secuencias de ADN
ribosmico para la integracin cromosmica y un gen LEU2d para la seleccin
en placas que carecen de leucina-(Van Gemeren et. Al, 1995). Los cultivos
madre se mantuvieron en una mezcla de 50% (v / v) de medio selectivo (Leu?
Agar) y glicerol (Merck, Darmstadt, Alemania) a? 80? C.
Preparacin del inculo
La composicin del medio selectivo para la preparacin del inculo fue de: 6,7
g / l de base nitrogenada de levadura sin aminocidos libres (Difco, Detroit, MI),
20 g / ld (+)-glucosa (Merck), suplementado con 20 mg / l L-histidina (Merck). El
inculo se cultiv durante la noche en matraces de agitacin a 30 C y 200
rpm en un agitador orbital (Agitorb 160E, Aralab, Oeiras, Portugal) hasta un
peso celular seco entre 1,1 y 1,8 g / l se obtuvo (Calado et al. 2002a).
Biorreactor
Se utiliz, equipada con un recipiente, la relacin de vidrio con camisa de
altura / dimetro de 2, y tres turbinas de Rushton igualmente espaciados,; Un
biorreactor de 5 l (Braun, Melsungen, Alemania Biostat MD). La tasa de flujo de
aire, oxgeno disuelto, pH, temperatura, velocidad del agitador y el volumen de
cido y la base fueron aadidos ordenador conectado. El oxgeno disuelto se
control con un electrodo polarogrfico (Ingold, Urdorf, Suiza). Cero y 100% de
calibracin del electrodo fueron a las 30 C y 500 rpm por burbujeo de
nitrgeno y aire, respectivamente, hasta que se obtuvieron seales estables.
Antiespumante (silicio esta Merck) manualmente; agente antiespumante.
Fermentacin A: fermentacin fed-batch con alimentacin de galactosa

Inicialmente, el biorreactor contena 2 l de medio de cultivo: 20 g / l de

extracto de levadura Difco), 10 g / l de peptona (BDH, Poole, Dorset, Reino
Unido), 20 g / l d (+)-glucosa (Merck) y 10% (v / v) de inculo. Una solucin de
200 g / ld (+)-galactosa (Sigma, Mnich, Alemania), extracto de 35 g / l de
levadura (Difco) y 45 g / l de peptona (BDH, Reino Unido) comenz a ser
alimentado con una bomba peristltica (Watson Marlow 505Di, Falmouth
Cornwall, Reino Unido) inmediatamente despus del agotamiento de la etanol
producido durante la perodo de lote. La velocidad de alimentacin fue
constante y ajustado a 116 ml / h hasta que Se haba aadido 1,68 l de medio
(densidad = 1110 kg/m3). La cantidad de medio agregado se control
gravimtricamente (balance PB1502; Mettler-Toledo, Greifensee, Suiza). La
fermentacin fue llevada a cabo a 30 C y se mantuvo el pH a 6,0 0,5 a 2 M
NaOH y HCl 2 M. El oxgeno disuelto se mantuvo por encima de 60% y 30% de
saturacin durante los periodos discontinuos alimentados por lotes y,
respectivamente, a una tasa de flujo de aire constante de 2,0 lN / min, por la
variacin de la velocidad de agitacin. Un condensador se acopl al aire
fermentador salida y se enfra con agua a 4 C para minimizar las prdidas por
evaporacin.
Fermentacin B: fermentacin por lotes en galactosa
El biorreactor contena 4,0 l de medio de cultivo: 10 g / l de extracto de
levadura (Difco, Detroit, Michigan), 10 g / l de peptona (BDH), 20 g / ld (+)galactosa (Sigma) y 10% (v / v) de inculo. Temperatura y el pH fueron
controlado como antes. El oxgeno disuelto se mantuvo por encima de 30%
saturacin a una velocidad de flujo de aire constante de 3,9 lN / min mediante
la variacin de la velocidad de agitacin.
C Fermentacin: fermentacin de alimentacin por lotes con glucosa y
alimentacin galactosa
Para empezar, el biorreactor contena 2 l de medio de cultivo: 20 g / extracto
de levadura (Difco), 10 g / l de peptona (BDH), 15 g / ld (+)-glucosa (Merck), 5
g / ld (+)-galactosa (Sigma) y 10% (v / v) de inculo. La alimentacin con una
solucin de 10 g / l de extracto de levadura (Difco), 20 g / l peptona (BDH), 45
g / ld (+)-glucosa (Merck) y 10 g / ld (+) -galactosa (Sigma) a travs de una
bomba peristltica (Watson Marlow 202 U1) se encienda a 19,3 h. La velocidad
de alimentacin fue exponencial hasta Se haba aadido medio de 645 ml. A
partir de entonces, entre 26 h y 32 h, la velocidad de flujo fue constante e igual
a 233 ml / h. Temperatura y pH fueron controlados de antes y la cantidad total
de medio alimentado, 1,85 l, se control gravimtricamente como en la
fermentacin A.
El oxgeno disuelto se fij en el 30% de saturacin en un flujo de aire constante
tasa de 1,9 lN / min.

Anlisis
Determinacin del peso seco celular
Peso seco de la clula (CDW) se obtuvo mediante el filtrado de un volumen
conocido de la cultura a travs de filtros de 0,20 mm de tamao de poro
(Whatman, Clifton, NJ) previamente secado en un secador de infrarrojos
(Mettler LP16) a 105 C hasta peso constante 70. La masa celular hmeda
obtenida se lav con agua destilada y se sec en el filtro en el secador
infrarrojo hasta peso constante.
Anlisis de azcares y metabolitos
Las muestras tomadas del medio de fermentacin se centrifugaron durante 10
min a 3000 g (Sigma 201; Braun). Los sobrenadantes se analizaron para la
glucosa, galactosa, de etilo y etanol con kits enzimticos (d-glucosa kit de
716.251, lactosa / D-galactosa kit de 176.303, 148.261 kit de cido actico y
etanol kit de 176.290, todos de Boehringer Mannheim, Alemania).
Determinacin de la concentracin de protena extracelular
La concentracin de protena se determin por el mtodo de Bradford (1976).
Ensayo de actividad de cutinasa
La
actividad
estereolitica
de
la
cutinasa
se
determin
espectrofotomtricamente, despus de la hidrlisis de p-nitrophenylbutirato a
400 nm (Calado et al. 2002a). Una unidad de actividad se define como la
cantidad de enzima necesaria para convertir 1 mol de p-nitrophenylbutirato a
la p-nitrofenol por minuto.
Anlisis de los gases de escape
Anlisis de los gases de escape en lnea se llev a cabo con un espectrmetro
de masas cuadrupolo (Spectra Internacional, Edgeware, Middlesex, Reino
Unido) despus de la calibracin adecuada con mezclas gaseosas (Ferreira et
al. 1998). El gas de escape se sec a travs de un condensador Dimroth
enfriado con agua a 4 C, antes de entrar en el espectrmetro de masas.
Los datos para el clculo de oxgeno y dixido de carbono concentraciones se
registran por ordenador.
Resultados
Fermentacin A: fermentacin fed-batch con galactosa
Produccin de alimentacin de cutinasa de S. cerevisiae se estudi por primera
vez por la adopcin de una estrategia tpica de alimentacin por lotes de

fermentacin: un primer periodo de crecimiento de la biomasa en glucosa,

seguido de un perodo de alimentacin por lotes en galactosa para la
produccin de cutinasa (Fig. 1).
Se obtuvo un perfil tpico de un lote de fermentacin de S. cerevisiae en la
glucosa en el periodo inicial de lote: una primera etapa en la que la glucosa se
consume con la produccin simultnea de biomasa y etanol, seguida de una
segunda etapa, despus de agotamiento de la glucosa, cuando el cultivo crece
por metabolizar el etanol producido durante la etapa anterior. La presencia de
etanol en el tiempo cero es debido al etanol introducido con el inculo.
Limitacin de oxgeno nunca se le ocurri a lo largo de la fermentacin, debido
a su relativamente bajo volumen y una buena mezcla. Por lo tanto, la
produccin de etanol era un resultado del efecto Crabtree. En efecto, la tasa de
captacin de glucosa especfica, QS, era 1,75 gg 1 h 1, ms alto que el umbral
reportado qS h-1 (0,54 gg h-1), por encima del cual la va respiratoria est
saturado y el etanol se produce como resultado de la aparicin de la va
fermentativa. Cuando el metabolismo no es exclusivamente oxidativa, el
cociente respiratorio (RQ) es mayor que 1, confirmado por mediciones en el
inicio de la fermentacin (Fig. 1). El etanol y el acetato concentraciones
siguieron un perfil similar durante el perodo de consumo de glucosa por lotes.
A continuacin, ambas concentraciones de etanol y acetato disminuy hasta
casi lleno agotamiento de etilo y, despus, etanol. El RQ terico durante la
oxidacin aerbica de etanol es de 0,67, en buen acuerdo con el RQ de 0,66
obtenido experimentalmente.
En caso de agotamiento de etanol, el RQ se increment a un valor bastante
constante cerca de 1. A 17,5 h de fermentacin, galactosa comenz a ser
alimentado a una velocidad constante (116 ml / h). A partir de entonces, se
observ acumulacin de etilo hasta el agotamiento total de etanol, por lo que
el acetato de tiempo comenz a consumirse hasta su agotamiento. Durante las
primeras 10 h de la alimentacin, la mayor parte de la galactosa simplemente
acumulado. Sin embargo, tanto el crecimiento de la biomasa y la produccin de
la protena todava se produjeron (fig. 1). Acetato acumula tanto en el inicio de
la induccin y ms tarde en el inicio de la absorcin de galactosa.
El crecimiento en galactosa mostr dos fases diferentes: una fase exponencial,
seguida por un crecimiento casi lineal.
Fermentacin B: fermentacin por lotes en galactosa
Una fermentacin por lotes en galactosa se realiz para aclarar algunas
observaciones durante la fermentacin A, a saber, la tasa de absorcin de
galactosa especfica limitada y la importancia aparente de etilo para interpretar
el curso del tiempo de la fermentacin (Fig. 2). Inicialmente, el etanol

prorrogado del inculo se consuma. Concentracin de acetato

aparentemente aumentando en el momento de la primera muestra. La

fue

Tasa de produccin de dixido de carbono (RCP) muestra un pico en la primera

5,5 h que no fue acompaado por ningn pico detectable en la tasa de
consumo de oxgeno (OUR), lo que sugiere que el cultivo se fermenta la
glucosa presente en el inculo.
Un gran pico se observa tanto en nuestros perfiles y RCP durante el periodo en
el que la cultura se estaba apoderando de etanol. La abrupta cada de nuestros
y RCP aproximadamente 16 h coincide con el agotamiento de etanol. Debido a
un problema en la calibracin del espectrmetro de masas, la OUR fue
consistentemente superior a la RCP, y por lo tanto no existe informacin
cuantitativa se pueden extraer del anlisis de gases de escape. Los resultados
muestran claramente que el crecimiento fue lineal y fue acompaado por una
disminucin lineal en la concentracin de galactosa, aunque no se produjo la
limitacin de oxgeno. Acetato estuvo presente en una concentracin bastante
constante a lo largo de la fermentacin, a pesar de la muy baja flujo a travs
de la gluclisis.
Fermentacin C: fermentacin de alimentacin discontinua con la glucosa y la
alimentacin galactosa
La tasa de absorcin de galactosa es mucho menor que la tasa de captacin de
glucosa, lo que lleva a un aumento de veces para el crecimiento y la
produccin (es decir, bajas productividades volumtricas) cuando se utiliza
galactosa como nica fuente de carbono. Sera ventajoso si la cepa poda
crecer en glucosa y, al mismo tiempo, producir cutinasa debido a la presencia
de galactosa. El transporte de galactosa en la clula, es necesario para la
induccin de la galactosa que se produzca, es reprimida por la presencia de
glucosa. Adems, las cepas silvestres de S. cerevisiae en continuo crecimiento
en galactosa dejan de metabolizar la galactosa despus de la adicin de un
pulso de glucosa, pero se reinician galactosa metabolizante cuando las gotas
de concentracin de glucosa. Para investigar la influencia de la glucosa en la
absorcin de galactosa y la produccin de protenas, se realiz un lote
alimentado con una alimentacin mixta de glucosa y galactosa (fig. 3). Un lote
de crecimiento se llev a cabo para la biomasa acumulacin antes del perodo
de alimentacin, en un medio que contiene glucosa y galactosa de manera que
cuando se inici la fase de fedbatch las clulas ya eran capaces de metabolizar
la galactosa.
El comportamiento de la cultura durante las primeras 12 horas seguido de
cerca que se obtenga cuando el crecimiento de la tensin en forma discontinua
glucosa. La glucosa se consume fcilmente, con la produccin concomitante de
etanol y acetato. En caso de agotamiento de glucosa, no se observ consumo

de galactosa inmediata, la fuente de carbono es etanol. La sntesis de las

enzimas necesarias para la utilizacin de galactosa explica este retraso en la
absorcin de galactosa. Concentracin de acetato aument hasta alrededor de
15 h de fermentacin, 3 h despus de la deplecin de glucosa y, slo entonces
galactosa inicio consumo. En esta etapa, galactosa y etanol se consumieron
simultneamente. Tambin se observ un ligero incremento en la
concentracin de protenas tras el agotamiento de glucosa, es decir, cuando la
cultura se convirti en no reprimido y fue capaz de tomar hasta galactosa.
Al comienzo del perodo de alimentacin exponencial, la concentracin de
galactosa disminuye hasta alrededor de 20 h y se detecta una ligera
acumulacin de la glucosa. La galactosa comienza a acumular a partir de
entonces, mientras que casi toda la glucosa se consume alimentada con la
consiguiente formacin de etanol, adems de la masa celular. La concentracin
de galactosa aumenta bruscamente hasta que se alcanza una concentracin
bastante constante entre 4 y 4,5 g / l, a pesar de la entrada creciente
galactosa. Este nivel de concentracin tambin se mantiene cuando la tasa de
alimentacin se mantiene constante. Durante el perodo de alimentacin, tanto
el etanol y el acetato se acumulan. La RCP aumenta bruscamente mientras se
alimenta es exponencial, lo que indica que la fuente de carbono se metaboliza
principalmente a travs de la va fermentativa.
Durante el perodo de alimentacin constante, la RCP disminuye como
resultado
De una tasa de absorcin de carbono especfico ms bajo debido a la absorcin
volumtrica constante en el aumento de las concentraciones de biomasa.
Esto significa que el flujo de carbono a la clula individual disminuye y por lo
tanto su fraccin fermentada tambin disminuye.
Durante este perodo, se observ un aumento en la concentracin de protena.
A partir de 32 h a aproximadamente 52 h, tanto el etanol y disminucin de la
concentracin de galactosa y el RQ se mantiene cerca de 1, similar a la
situacin hacia el final de la fase de lote.
Al final de este perodo, la tasa de absorcin de galactosa es muy baja, aunque
la concentracin de galactosa es todava ca. 1 g / l. Entre 52 h y 63,5 h, el
etanol restante se consume totalmente, lo que resulta en un aumento
significativo en la concentracin de biomasa a partir de 12,7 g / l a 19,2 g / l. La
concentracin de protenas, sin embargo, se mantuvo constante. Durante este
perodo, el RQ disminuye (a un valor promedio de 0,65), como ya se observ
cuando el cultivo fue creciendo en etanol. Una vez que el etanol se agot, el
acetato se consuma, hasta su agotamiento a 67 h. Posteriormente, aunque

alguna galactosa permaneci en el caldo, tanto el crecimiento como la

produccin de protenas cesaron.
Discusin
La produccin de cutinasa de F. solani pisi por una cepa recombinante de S.
cerevisiae fue tratada como una contribucin para el futuro diseo de una
estrategia de fermentacin para mejorar la productividad de la fermentacin
Proceso, y reducir al mnimo el coste de las fuentes de carbono y un inductor.
Durante la fermentacin A, galactosa se aliment al cultivo despus de una
fase de proceso por lotes de la glucosa para crecimiento de la biomasa.
Sorprendentemente, la mayor parte de la galactosa acumulada durante las
primeras 10 h del perodo de alimentacin. Sin embargo, tanto el crecimiento
de biomasa y produccin de protenas an ocurrieron, aunque a tasas bajas.
Despus de la induccin, la clula comienza a montar la maquinaria necesaria
para la produccin de cutinasa, por lo tanto las rutas biosintticas sern muy
activas y se consumen NADPH (Matthews y van Molde 1990). En caso de
agotamiento de NADPH producido por, por ejemplo, la va pentosa-fosfato, la
NADPH requerido provendr de la produccin de acetato, una importante
fuente de suministro de NADPH en la levadura (Stephanopoulos et al. 1998).
Por lo tanto, el pico de produccin de acetato observada entre 17,5 h y 22,5 h
est probablemente relacionado con la produccin de NADPH necesario para la
biosntesis de protenas. El pico de acetato de entre 27,5 h y 35 h, el perodo
durante el cual comenz la absorcin de galactosa y alcanz su tasa mxima,
corresponde probablemente a la induccin de los genes que codifican las
enzimas de la ruta Leloir. Esto tambin explicara el aumento aparente en la
concentracin de acetato en el momento de
la primera muestra en la fermentacin de B. Acetato estuvo presente en una
concentracin bastante constante a lo largo de la fermentacin B, a pesar de la
muy baja flujo a travs de la gluclisis, lo que sugiere que las clulas estn
produciendo NADPH necesario para la biosntesis de a travs de la produccin
de acetato. Tambin se observ la coincidencia entre la produccin de acetato
y el inicio de la produccin o el consumo de cutinasa galactosa durante la
fermentacin C
Cmo se lleva a cabo la utilizacin de galactosa en presencia de glucosa es una
clave, y todava controversial, cuestin en la comprensin de la regulacin del
metabolismo de hexosa en S. cerevisiae (Horak y Wolf 1997, 2001; Meijer et al.
1998; Rohde et al. 2000). Es bien sabido que la glucosa es capaz de ejercer
represin catablica, y es ampliamente aceptado que la galactosa no puede
ser transportado dentro de la clula o metaboliza en presencia de glucosa. En
la fermentacin A, durante el periodo en el que acumula galactosa, cutinasa
fue producido, lo que indica que se produjo induccin de galactosa, es decir,

algunos galactosa estaba siendo transportado en la clula, aunque otra fuente

de carbono, probablemente a partir del extracto de levadura (que contiene
17,5% de hidratos de carbono que podra ser capaz de reprimir e inhibir el
consumo de galactosa), se utiliz. Transporte de galactosa se logr quizs a
travs de un sistema de transporte de baja afinidad constitutiva presente en
las clulas cultivadas en glucosa (Lagunas 1993).
Esto sugiere que podra ser posible para lograr la induccin de galactosa,
mientras que el crecimiento de la cepa de la glucosa. Esta posibilidad fue
estudiada durante la fermentacin C. La glucosa-y tasas de absorcin de
galactosa-especficos durante el perodo de alimentacin se muestran en la
figura. 4. Mientras que la galactosa inicial an estaba siendo metabolizado, el
perodo de alimentacin se inici con un aumento de la concentracin de
glucosa instantnea y cada concomitante de la tasa de absorcin de
galactosa. Cuando la concentracin de glucosa se redujo a valores inferiores a
0,20 g / l, consumo de galactosa reanud, aunque continu la glucosa se
metaboliza. Estos resultados estn de acuerdo con los hallazgos de Meijer et al.
(1998), segn el cual la represin de glucosa en S. cerevisiae parece estar
relacionada con la concentracin de glucosa en lugar del flujo de glucosa. Esto
sugiere la posibilidad de utilizar soluciones de alimentacin ms baratos que
contienen tanto la glucosa y galactosa, que transmitir galactosa suficiente para
la induccin eficiente, el carbono restante se suministra por el mucho ms
barato el azcar, la glucosa. No se cutinasa se produjo antes de la induccin
con galactosa, pero se produjo tan pronto como se aadi galactosa, excepto
en la fase de lote de fermentacin C debido al efecto represivo de la glucosa.
Cutinasa extracelular la actividad y la protena extracelular se linealmente
correlacionados.
La pendiente de la regresin lineal da la actividad especfica de cutinasa: 226
13, 179 y 414 9 protena 13 U / mg para las fermentaciones A, B y C,
respectivamente. Como se ha informado en la literatura (Verrips et al 2000;
Calado et al. 2002a, 2002b), cutinasa y produccin de biomasa se relacion en
forma lineal. La pendiente de estas lneas da la actividad celular especfica,
(7.90 0,39) 103, (2.62 0.16) y 104 (1,40 0,60) 104 U / g CDW para las
fermentaciones A, B y C, respectivamente. Esto se puede convertir en una
cutinasa de rendimiento de biomasa con la actividad especfica de cutinasa
purificada, 630 U / mg protena (Calado 2001), lo que resulta en 13, 42 y 22 mg
de cutinasa / g CDW para las fermentaciones A, B y C, respectivamente. La
ms alta actividad especfica cutinasa celular obtenido en la fermentacin B,
donde la tasa de crecimiento fue el ms bajo, es consistente con los resultados
de Verrips et al. (2000). Brown y colaboradores (2000) discuten la hiptesis de
que, tras la induccin, es poco probable que formar cutinasa de forma
significativa las clulas existentes, ya que pueden continuar en un estado
reprimido y que, por otra parte, clulas hijas tienden a ser menos reprimidas, y
la induccin de la galactosa se producir en estas clulas. Por lo tanto, la

actividad celular especfica se calcul de acuerdo con dos enfoques diferentes:

(1) sobre la base de la biomasa total (Ec. 1) y (2) teniendo en cuenta
nicamente las clulas producidas despus de la induccin (Ec. 2):
SA= At/XtS (1)
SA=(AtAi)/(XtXi)

(2)

Donde SA es la actividad celular especfica, A es la actividad cutinasa

extracelular, X es cdw, y los subndices t y me refiero a la poca de muestreo y
la induccin tiempo, respectivamente. La actividad especfica cutinasa celular
SPE calcula con el total de los aumentos de biomasa durante las primeras
horas despus de la induccin (Fig. 5), es decir, o bien una fase de retardo
existe correspondiente al tiempo necesario para que las clulas de montar la
maquinaria para la formacin de cutinasa, o slo la hija las clulas son capaces
de producir cutinasa. Cuando se calcul la actividad celular especfica teniendo
slo las clulas formaron despus de la induccin en cuenta, inmediatamente
alcanz los niveles observados a lo largo de la fermentacin, lo que sugiere
que slo las clulas hijas son capaces de producir cutinasa. Entendiendo que la
situacin mejor refleja la realidad se requieren ms estudios.
La mayor actividad celular especfica y la menor tasa de crecimiento observada
durante la fermentacin B indican que las clulas han dirigido la mayor parte
de sus recursos a la produccin de cutinasa. Esto, junto con la hiptesis de que
existen dos poblaciones diferentes (inducida y no inducida), es crucial para el
desarrollo y optimizacin de una estrategia fedbatch, especficamente con
respecto al ptimo tiempo para la induccin. La Tabla 1 compara el rendimiento
de cutinasa / azcar, el volumtrica la productividad, la concentracin cutinasa
y el coste de produccin en trminos de cutinasa hexosas para las tres
fermentaciones. Los precios de la glucosa y la galactosa se obtuvieron
promediando los valores de reactivos de grado farmacopea de varios
fabricantes, que se venden en paquetes de 1 kg (12.6/kg de glucosa y
galactosa para 137/kg). Estos costos sern obviamente ms bajos para
grandes cantidades, pero su proporcin se mantendr ms o menos la misma,
por lo que la comparacin significativo. Fermentacin B dio el rendimiento ms
alto de cutinasa hexosas totales, pero ya que se llev a cabo en slo galactosa,
que no era el ms rentable en trminos de hexosas. Dado que tanto el
crecimiento y las tasas de absorcin de galactosa fueron bajas, esta
fermentacin era el ms largo, dando una productividad volumtrica
relativamente baja cutinasa. Fermentacin Un exhibe la ms alta
productividad, lo que se puede atribuir tanto a la corta duracin de la
fermentacin y la produccin de alta cutinasa. La corta duracin de la
fermentacin A tiene el beneficio adicional de menor gasto de energa. Sin
embargo, el rendimiento de cutinasa en hexosa total fue la ms baja y cutinasa
slo se produce cuando se utiliza galactosa como la nica hexosa, lo que
resulta en una fermentacin de ser la opcin menos efectiva en costo en

trminos de consumo de hexosa. Fermentacin C se evalu a 50 h tiempo de

fermentacin, es decir, cuando la actividad cutinasa extracelular se nivel. Esta
fermentacin fue el ms rentable en trminos de consumo de hexosa. Sin
embargo, la concentracin de cutinasa en la fermentacin C fue el ms bajo
(Tabla 1), lo que implica el procesamiento aguas abajo ms costoso. Sin
embargo, la actividad especfica de cutinasa fue el ms alto, que puede dar
lugar a costes ms bajos en las etapas finales de purificacin, a menudo los
ms significativos en trminos de costos generales de produccin. Para definir
una estrategia de produccin eficiente, tanto en la composicin del medio de
cultivo, especialmente la relacin glucosa / galactosa, y la tasa de alimentacin
de medio, tienen que ser optimizados. Fermentacin C, llevada a cabo con una
alimentacin mixta de glucosa y galactosa, ha demostrado ser el ms rentable
en cuanto a consumo de hexosa (Tabla 1). Costes de azcar fueron slo 23% de
los de fermentacin A, que se llev a cabo con una estrategia de fermentacin
convencional, es decir, una fermentacin de alimentacin discontinua con la
alimentacin galactosa. Estos resultados podran ayudar al desarrollo de un
proceso de produccin cutinasa altamente eficiente, basado en el diseo
apropiado del rgimen de alimentacin.