Plugin Modulo Biotecnologia 1version 2013 PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

Contenido didctico del curso Biotecnologa I
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO MBIENTE
201529 BIOTECNOLOGIA I
ALEXANDER NIVIA OSUNA
(Director Nacional)
Acreditador
BOGOTA D.C
2013

INDICE DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO
INDICE DE TABLAS ................................................

INTRODUCCIN .....................................................
UNIDAD DIDACTICA 1: BASES DE BIOLOGIA MOLECULAR ....
CAPITULO 1: Estructura y funcin de los cidos Nucleicos ................................. 14
Leccin Uno: Estructura de los cidos Nucleicos ................................... 14
1.1. Polimerizacin de los cidos nucleicos ................................................... 14
1.2. Propiedades del ADN .............................................................................. 15
Leccin Dos: Modelos de Replicacin del ADN ...................................... 16
2.1. Experimento de Meselson y Stahl. .......................................................... 16
2.2. Mecanismos de Replicacin del ADN ..................................................... 17
2.3. Origen de replicacin en procariotes ....................................................... 18
2.4. Helicasas, Primasas y Protenas de Unin a la Cadena Simple ............. 18
2.5. Topoisomerasas ...................................................................................... 19
2.6. Sntesis de las cadenas Lder y Retrasada ............................................. 20
2.7. Elongacin y Terminacin de la Replicacin ........................................... 20
2.8. Replicacin en Eucariotes ....................................................................... 21
Leccin Tres: Transcripcin: Sntesis de ARN ........................................ 22
3.1. La ARN polimerasa ................................................................................. 22
3.2. La sntesis de ARN.................................................................................. 24
3.3. Transcripcin en eucariotas .................................................................... 24
Leccin Cuatro: Mecanismos de Reparacin Biolgicos ........................ 25
4.1. Sistemas que evitan los errores antes de que ocurran ........................... 25
4.2. Reversin directa de la lesin: ................................................................ 25
4.3. Reparacin general por escisin: ............................................................ 25
4.4. Vas de reparacin especifica ................................................................. 27
4.5. Reparacin posterior a la replicacin- emparejamiento errneo ............. 28
4.6. Reparacin por recombinacin ............................................................... 29
Leccin Cinco: Traduccin ...................................................................... 29
5.1. Caractersticas del Ribosoma ................................................................. 30
5.2. Sntesis de Protenas .............................................................................. 30
5.2.1. Iniciacin ........................................................................................... 31
5.2.2. Elongacin ........................................................................................ 31
5.2.3. Terminacin ...................................................................................... 31
CAPITULO 2: Principios de ADN recombinante .................................................... 33
Leccin Seis: Importancia de aislar genes .............................................. 33

Leccin Siete: Generacin de ADN recombinante .................................. 33
Leccin Ocho: Molculas portadoras o Vectores .................................... 34
3.1. Tipo de Vectores ..................................................................................... 35

3.1.1. Plsmidos ......................................................................................... 35
3.1.2. Fagos................................................................................................ 36
3.1.3. Csmidos .......................................................................................... 37
3.1.4. Cromosomas Artificiales ................................................................... 37
Leccin Nueve: Aislamiento del ADN...................................................... 39
Leccin Diez: Manipulacin del ADN ...................................................... 39
CAPITULO 3. Marcadores Moleculares ................................................................ 42

Leccin Once: Marcadores Moleculares utilizados en Biotecnologa ..... 42
Leccin Doce: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de RestriccinRFLP .............................................................................................................. 42
Leccin Trece: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados-AFLP
....................................................................................................................... 43
Leccin Catorce: Amplificaciones al Azar de ADN Polimrfico-RAPD ........... 44
Leccin Quince: Repeticiones en Tandem- Microsatlites ............................. 45
UNIDAD DIDACTICA 2: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGA .............................. 48
CAPITULO 4: Tecnologa del ADN recombinante ................................................. 51
Leccin Dieciseis: Reaccin en cadena de la polimerasa-PCR .............. 51
1.1 Ciclos de amplificacin ............................................................................. 51
1.2 Componentes de la PCR.......................................................................... 52
1.2.1. Buffer de Amplificacin ..................................................................... 52
1.2.2. Oligonucleotidos Iniciadores Cebadores-Primers .......................... 53
1.2.3. Desoxinucletidos Trifosfatos-dNTP................................................. 53
1.2.4. ADN Polimerasas y ADN molde ....................................................... 54
Leccin Diecisiete: Tipos de PCR .................................................................. 54
2.1. PCR anidada ....................................................................................... 54
2.2. PCR Multiplex ...................................................................................... 54
2.3. PCR in situ ........................................................................................... 54
2.4. RT-PCR ............................................................................................... 54
2.5. PCR tiempo real .................................................................................. 55
Leccin Dieciocho: Clonacin de genes especficos ...................................... 55
3.1. Bsqueda de clones especficos mediante la utilizacin de sondas .... 55
3.1.1. Sondas para reconocimiento de ADN............................................... 56
3.1.2. Sondas para reconocimiento de Protenas ....................................... 57
Leccin Diecinueve: Aplicaciones de los clones de ADN ............................... 58
4.1 Hibridaciones de cidos Nucleicos ....................................................... 59
Leccin Veinte: Secuenciacin del ADN..................................................... 61
CAPITULO 5: Conceptos y Aplicaciones bsicas en Biotecnologa Vegetal ......... 63
Leccin Ventiuno: Establecimiento de cultivos vegetales in Vitro ........... 63
1.1. El Explante .............................................................................................. 64

1.2. Medios de Cultivo .................................................................................... 65

Leccin Ventidos: Propagacin clonal in Vitro de plantas ....................... 66
2.1. Cultivos de Meristemas ........................................................................... 66
2.2. Embriognesis Somtica......................................................................... 67
2.3. Organognesis ........................................................................................ 69
Leccin Ventitres: Micropropagacin ...................................................... 70
3.1 Concepto .................................................................................................. 70
3.2. Pasos en la Micropropagacin ................................................................ 70
3.3. Factores que influyen en la Micropropagacin ........................................ 71
3.4. Micropropagacin de Especies Herbceas ............................................. 72
3.5. Micropropagacin de Especies Leosas ................................................. 73
Leccin Venticuatro: Cultivo de Protoplastos .......................................... 74
4.1 Aislamiento de Protoplastos ..................................................................... 75
4.2 Caractersticas de los Protoplastos aislados ............................................ 75
4.3. Regeneracin de las plantas ................................................................... 77
Leccin Venticinco:. Ingeniera Gentica y cultivo de tejidos .................. 77
5.1. Transformacin gentica en los vegetales .............................................. 78
5.2. Aplicaciones de la Biotecnologa Vegetal................................................ 79
CAPITULO 6: Principios bsicos en Biotecnologa Animal ................................... 81
Leccin Ventiseis: Ingeniera gentica en animales ............................... 81
Leccin Ventisiete: Rompimiento de genes y remplazo gnico en ratones

................................................................................................................ 82
2.1. Produccin de ratones knockout portadores de la mutacin blanco. ..... 84

Leccin Ventiocho: Terapia gnica en animales ..................................... 85
Leccin Ventinueve: Aplicaciones de la Biotecnologa en la produccin

animal ..................................................................................................... 86
Leccin Treinta: Biorremediacin ............................................................ 87
6. Bibliografa ...........................................................

LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. ARN polimerasas en eucariotes .............................................................. 23

Tabla. 2. Sitios de Reconocimiento de corte de algunas enzimas de restriccin .. 41
Tabla.3. Clasificacin de los Microsatlites..

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO
El contenido didctico del curso acadmico: Biotecnologa I, fue diseado

durante el ao 2006 por la Biloga Claudia Ximena Guerrero, tutora e
investigadora de la sede Jos Celestino Mutis de la UNAD. Claudia Ximena
Guerrero, es Biloga de la Universidad Nacional, tiene una maestra en Biologa
de la Pontificia Universidad Javeriana y en el momento esta en el pas de Chile
adelantando estudios de Doctorado. La mencionada profesional labor como
tutora e investigadora en la Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio
Ambiente de la Unad, durante los aos 2004 y 2005. Los contenidos han sido
transferidos y acondicionados al presente formato, al aplicativo exe learning, as
como a la plataforma tecnolgica de la Unad, por el profesional Alexander Nivia
Osuna, quien en estos momentos asume el rol de director.
El contenido didctico de este mdulo es pertinente para los estudiantes
que cursan los programas de especializacin en Biotecnologa Agraria,
Mejoramiento Gentico y Nutricin Animal Sostenible de la ECAPMA.
Los contenidos que se presentan en este material didctico, son de
propiedad intelectual de la mencionada autora, y por ende la Universidad no se
hace responsable de ellos.

INTRODUCCIN
Colombia cuenta con una buena capacidad en el desarrollo y aplicacin de la

Biotecnologa, principalmente para producciones agrcola y forestal. En tanto que la
infraestructura bsica disponible no es una limitante para el desarrollo, lo es la
insuficiencia de personal capacitado en los diferentes niveles para la formulacin y
ejecucin de actividades en este campo. Las universidades colombianas deben preparar
estudiantes para el desafo cientfico que implica la Biotecnologa; en los pases
neotropicales, se ha venido prestando muy poca atencin a la investigacin bsica, la
cual es sumamente importante en el nuevo contexto en que se desarrolla esta rea.
Para lograr este propsito es fundamental la modernizacin e impulso a la investigacin
en los recursos biticos que generen nuevas tecnologas a travs de la Biotecnologa, es
la tecnologa basada en la biologa, especialmente usada en agricultura, farmacia, ciencia
de los alimentos, ciencias forestales y medicina. Se podra definir como "toda aplicacin
tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la
creacin o modificacin de productos o procesos para usos especficos.
La nueva percepcin de la Biotecnologa reconoce la interdependencia fundamental entre
los fenmenos y el hecho que, los individuos, las poblaciones y comunidades estemos
inmersos en los procesos cclicos de la Naturaleza. Dentro del contexto de biotecnologa,
la biologa molecular se ha convertido en la base para cualquier tipo de investigacin,
pues es el resultado de la combinacin de los enfoques clsicos de Mendel, la bioqumica
y las nuevas tecnologas.
Por lo tanto, dentro de la Biotecnologa es importante profundizar en la estructura y
funcin del ADN, sus modificaciones mediante los diferentes tipos de marcadores
moleculares, que permitan reconocer las caractersticas propias del mismo, para
desarrollar genotipos mejores en todas las especies vivientes de forma mucho ms
rpida y selectiva. Adems proporciona nuevos mtodos de investigacin que pueden
contribuir a la conservacin y caracterizacin de la biodiversidad.
En las ltimas dcadas, con la necesidad de cubrir diferentes mercados de produccin
animal y vegetal, se han implementado nuevas tecnologas basadas en los mecanismos
del ADN recombinante y la fertilizacin in vitro, para obtener animales con ciertas
caractersticas genticas econmicamente importantes, para generar ganados mejorados
teniendo en cuenta su acervo gentico, adems de la produccin de plantas fitomejoradas
que presentan una mayor calidad de produccin adems de la resistencia a plagas.
En este curso, se realizarn dos Unidades Didcticas; la Primera Unidad en Introduccin
a la Biologa Molecular donde se enfocar en temas sobre las bases moleculares ADN y
ARN, procesos como replicacin transcripcin, traduccin, y reparacin, ADN
recombinante , Marcadores moleculares y la tecnologa del ADN recombinante, para
entrar a la Segunda Unidad Didctica que es Principios de Biotecnologa donde se
abordarn los temas sobre principios de biotecnologa vegetal, micropropagacin, cultivo
de protoplastos, organismos genticamente modificados, transgnesis, a, adems de
profundizar en la manipulacin biotecnolgica y sus implicaciones econmicas. El
estudiante de la Especializacin desarrollar la habilidad para comprender, proponer y

relacionar los conceptos de biotecnologa, en el rea agraria, para la mejor manipulacin

de los organismos y cultivos de su inters.
Adicionalmente, este Mdulo contiene las Guas didcticas, en donde el estudiante
encontrar toda la informacin necesaria y pertinente para que relacione secuencialmente
su aprendizaje terico (basado en el mdulo) con el proceso experimental y el diseo de
interrogantes reales en el mbito de la Biotecnologa. El estudiante para lograr con xito la
culminacin de este curso consultar la bibliografa propuesta para garantizar el acceso a
toda la informacin necesaria y as responder a las exigencias acadmicas del curso. As
mismo estn definidos espacios, para el control, validacin y discusin de dichos talleres y
artculos con los tutores y pequeos grupos, de curso y en una socializacin final. Los
Criterios de evaluacin que debern tener presentes tanto el estudiante, como tutores y
docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil, teniendo nfasis en los enfoques
de autoevaluacin, coevaluacin y heteroevaluacin.
Dentro de la Gua de Actividades, est el anlisis de problemas en biologa molecular, la
interpretacin y crtica de artculos cientficos; se realizar ejercicios, donde el estudiante
de postgrado podr analizar los patrones de bandeo de los marcadores moleculares
mediante ejercicios de los procesos biotecnolgicos que permitir obtener la destreza no
solo en los temas, sino en pensar en trminos de biotecnologa para la formulacin de
investigaciones puntuales en el rea.
Adicionalmente en las Guas Didcticas se relacionan las actividades que se tendrn en
cuenta en el proceso evaluativo; adems de los mecanismos para la misma. En trminos
generales se evaluarn actividades de tipo individual, en pequeos grupos colaborativos y
los de socializacin. De todas quedar constancia en el Portafolio Personal de
Desempeo (PPD).

UNIDAD 1
Nombre de la Unidad
Introduccin
Justificacin
Bases de biologa molecular

Los cidos nuclicos se han considerado
las molculas que contienen la informacin
de secuencias de aminocidos que
formarn las protenas. Dentro de estos
cidos
nuclicos,
el
cido
desoxirribonucleico (ADN) es el archivador
o la librera celular que tiene toda la
informacin requerida para la construccin
de clulas y tejidos y por lo tanto
organismos. La estructura del ADN fue
descubierta en 1953 por James Watson y
Francis
Crick,
y
las
siguientes
elucidaciones sobre la sntesis de ADN y
ARN (acido ribonucleico) y protenas son
los ms importantes criterios de la biologa
molecular. La relacin directa de la sntesis
del ADN al ARN y el posterior ensamblaje a
protenas es llamado el Dogma Central de
la Biologa Molecular.
La nueva percepcin de la Biotecnologa
reconoce la interdependencia fundamental
entre los fenmenos y el hecho que, los
individuos, las poblaciones y comunidades
estemos inmersos en los procesos cclicos
de la Naturaleza. Dentro del contexto de
biotecnologa, la biologa molecular se ha
convertido en la base para cualquier tipo de
investigacin, pues es el resultado de la
combinacin de los enfoques clsicos de
Mendel, la bioqumica y las nuevas
tecnologas.
Por lo tanto, dentro de la Biotecnologa es
importante profundizar en la estructura y
funcin del ADN, sus modificaciones
mediante
los
diferentes
tipos
de
marcadores moleculares, que permitan
reconocer las caractersticas propias del
mismo,
para
desarrollar
genotipos
mejores en todas las especies vivientes
de forma mucho ms rpida y selectiva.
Adems proporciona nuevos mtodos de
investigacin que pueden contribuir a la

conservacin y
biodiversidad.
Intencionalidades Formativas
caracterizacin
de
la
Propsito: Generar en el estudiante la

comprensin de los conceptos generales
mediante el anlisis de las herramientas
biotecnolgicas y la aplicacin en los
problemas biolgicos.
Crear en el estudiante la capacidad de
solucin de los problemas agrarios
mediante la aplicacin de conceptos
biotecnolgicos.
Objetivos: Reconocer las estructuras y
funciones de los cidos nuclicos, los
mecanismos de mantenimiento, correccin
y duplicacin del los mismos.
Competencias: El estudiante relacionar
las bases moleculares con la manipulacin
gentica de especies con mayor inters
comercial.
Denominacin de captulo 1
Denominacin de Leccin 1
Metas: El estudiante se apropiara del

conocimiento sobre las bases moleculares
del ADN y estar en capacidad de
relacionarlos con la produccin de
organismos
animales
y
vegetales
genticamente
modificados
mediante
ejercicios de anlisis y discusin de
artculos cientficos.
Estructura y funcin de los cidos
Nuclicos.
Estructura de los cidos nuclecos
Modelos de replicacin del ADN
Transcripcin: sntesis de protenas
Mecanismos de reparacin biolgicos
Traduccin
Principios de ADN recombinante
Importancia de aislar genes
Generacin de ADN recombinante
Molculas portadoras o vectores
Aislamiento de ADN
Manipulacin de ADN
Marcadores moleculares

Marcadores moleculares utilizados en

Biotecnologa
Polimorfismos de longitud de fragmentos de
restriccin RFLP
Polimorfismos de longitud de fragmentos de
amplificacin AFLP
Amplificacin al azar de de ADN polimrfico
RAPD
Repeticiones en Tamden microsatlites
UNIDAD 2
Nombre de la Unidad
Introduccin
Principios de Biotecnologa
La biotecnologa vegetal experimenta hoy
una evolucin rpida que ha suscitado gran
inters en la mayor parte del mundo. El
impacto de la biotecnologa afecta a las
especies cultivadas y su potencial en
trminos del desarrollo tecnolgico. Sin
embargo todava existe una brecha grande
en la formacin bsica de la biologa celular
y molecular adems de las aplicaciones
tecnolgicas que sta conlleva.
El cultivo de tejido vegetales es importante
no slo porque es el rea de la
biotecnologa que tiene actualmente mayor
aplicacin prctica en la agricultura, sino por
ser una herramienta verstil para el estudio
de los problemas bsicos y aplicados en la
biologa de las plantas; ste constituye el
puente
necesario
para
llevar
las
manipulaciones
genticas
desde
el
laboratorio hasta el campo.
Justificacin
El curso de Biotecnologa I, aportara al

estudiante la comprensin y aplicacin de
diferentes postulados moleculares y de
manipulacin In Vitro, necesario para un
mejor desempeo profesional. Permitir por
una parte la familiarizacin de los conceptos
al tener la oportunidad de experimentar con
modelos pedaggicos (Talleres de Biologa
Molecular) que posibilitarn la aplicacin de
modelos de ADN recombinante en la
produccin de plantas y animales mejorados

Intencionalidades Formativas
Propsito: Generar en el estudiante la

comprensin de los conceptos generales
mediante el anlisis de las herramientas
biotecnolgicas y la aplicacin en los
problemas biolgicos, relacionados con la
produccin
de
plantas
y
animales
mejorados.
Objetivos: Comprobar la aplicacin del ADN
recombinante y los marcadores moleculares
mediante la resolucin de problemas
concretos sobre manipulacin.
Analizar las aplicaciones de la biotecnologa
en el manejo agrario por medio de lecturas
cientficas.
Competencias: El estudiante tendr la
capacidad de analizar los conceptos de
cultivos In Vitro, ADN recombinante,
marcadores moleculares para proponer
nuevas alternativas de cultivos dirigidos y
mejoramiento agrario.
Metas: El estudiante se apropiara del

conocimiento sobre la tecnologa del ADN
recombinante y estar en capacidad de
relacionarlos con los cultivos In Vitro y la
produccin
de
organismos
animales
genticamente
modificados
mediante
ejercicios de anlisis y discusin de artculos
cientficos
Tecnologa del ADN recombinante
Reaccin en cadena de la polimerasa PCR
Tipos de PCR
Clonacin de genes especficos
Aplicaciones de los clones de ADN
Secuenciacin Del ADN
Conceptos y aplicaciones bsicas de
Biotecnologa en vegetal
Establecimiento de cultivos vegetales in vitro
Propagacin clonal in vitro de plantas
Micropropagacin
Cultivo de protoplastos
Ingeniera gentica y cultivo de tejidos
Principios bsicos en Biotecnologa

animal
Ingeniera gentica en animales
Rompimiento de genes y reemplazo gnico
en ratones
Terapia gnica en animales
Aplicaciones de la biotecnologa en
produccin animal
Biorremediacin

UNIDAD 1: BASES DE BIOLOGIA MOLECULAR

CAPITULO 1: Estructura y funcin de los cidos Nuclicos
INTRODUCCION
Los cidos nuclicos se han considerado como las molculas que contienen la
informacin de secuencias de aminocidos que formarn las protenas. Dentro de
estos cidos nuclicos, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el archivador o la
librera celular que tiene toda la informacin requerida para la construccin de
clulas y tejidos y por lo tanto organismos. La estructura del ADN fue descubierta
en 1953 por James Watson y Francis Crick, y las siguientes elucidaciones sobre
la sntesis de ADN y ARN (acido ribonucleico) y protenas son los ms importantes
criterios de la biologa molecular. La relacin directa de la sntesis del ADN al ARN
y el posterior ensamblaje a protenas es llamado el Dogma Central de la Biologa
Molecular.
Leccin Uno: Estructura de los cidos Nuclicos
Los cidos nuclicos como son el ADN y el ARN, tienen muchas similaridades
qumicas. En su estructura primaria son polmeros lineales, es decir, contienen
muchas unidades qumicas, compuestos por monmeros (unidades qumicas
simples) llamados Nucletidos. Las molculas de ADN celular pueden tener una
longitud de aproximadamente 100 millones de nucletidos, estas unidades se
pueden visualizar en estructuras denominadas cromosomas.
Tanto el ADN como el ARN contienen solo 4 nucletidos diferentes. Todos los
nucletidos tienen una estructura comn: Un grupo fosfato unido por un enlace
fosfodiester a un azcar de cinco carbonos (pentosas) la cual se une a una base
nitrogenada, la estructura formada entre la base nitrogenada y el azcar se
denomina Nuclesido.
Una de las diferencias entre estos cidos nuclicos e que en el ADN el azcar es
una desoxirribosa y en el ARN el azcar es una ribosa. Tambin existen
diferencias entre las bases nitrogenadas que contienen cada una de las cadenas
tanto de ADN como de ARN; en el ADN existen cuatro tipos de bases
Estas bases nitrogenadas son compuestos heterocclicos con los anillos

conteniendo el nitrgeno y el carbono. Se han clasificado en Purinas, molculas
que contienen dos anillos como son la Adenina (A) y la Guanina (G), y en
Pirimidinas las cuales contienen un solo anillo como son la Citosina(C), la Timina
(T) y el Uracilo (U).
1.1. Polimerizacin de los cidos nuclicos
Cuando se unen los nucletidos para la formar los cidos nuclicos se denomina
polimerizacin, en este proceso el grupo hidroxilo (OH) se une al carbono en la
posicin 3 del azcar de uno de los nuclesidos (unin base azcar) mediante el

enlace Ester al fosfato del otro nucletido eliminando una molcula de agua. Por
convencin las secuencias de nucletidos son escritas y ledas en la direccin 5 a
3 (es decir de izquierda a derecha); la direccionalidad de las secuencias es una
propiedad importante de la molcula de ADN, la secuencia lineal de los
nucletidos unidos por enlaces fosfodiester constituyen la estructura primaria de
los cidos nuclicos (Lodish, et al 2000).
1.2. Propiedades del ADN
En los procesos de replicacin de ADN y la formacin de ARN a partir del mismo,
las cadenas de la doble hlice pueden separarse al menos temporalmente, ms
adelante se profundizar sobre la replicacin del ADN manteniendo una cadena
original.
Cuando las cadenas de ADN se desenrollan y se separan es un proceso
denominado
Denaturacin
o
meeting
que
puede
ser
inducido
experimentalmente.
Si una solucin de ADN es calentada, la energa trmica incrementa el movimiento
molecular, eventualmente rompe los puentes de hidrgeno y otras fuerzas que
estabilizan la doble hlice y las cadenas se separan. Esta separacin del ADN
puede ser medida por la absorcin de luz UV en un rango de 260nm, el cual es
utilizado para medir las concentraciones de ADN por la gran absorbancia que las
bases tienen en el rango UV. La doble hlice de ADN absorbe alrededor de la
mitad de la luz en 260nm lo que equivale a la cantidad de ADN en cadena simple
por lo tanto el ADN denaturado aumenta su absorcin de la luz UV.
La temperatura de denaturacin (Tm) donde las cadenas se separan depende de
diferentes factores; las molculas de ADN que contienen una gran proporcin de
pares de Guanina- Citosina (pares GC) requieren mayor temperatura de
denaturacin para romper los triples puentes de hidrgenos que las unen, estos
puentes son ms estables que los dobles de Adenina y Timina, adems las
cantidad de G-C puede estimarse con el Tm.
En adicin al calor, algunas soluciones de bajas concentraciones inicas
desestabilizan la doble hlice causando la denaturacin en bajas temperaturas, el
ADN denaturado por exposicin a otros agentes que desestabilizan los puentes de
hidrgeno como son las soluciones alcalinas y las soluciones concentradas de
formamida y urea, estas cadenas sin una estructura regular, son como colas de
bases aleatorias.
Sin embargo si se baja la temperatura y se aumenta la concentraciones de iones
en las dos cadenas complementarias separadas estas se pueden volver a
reasociar, la extensin de la renaturacin es dependiente del tiempo, de la
concentracin de ADN y el contenido inico de la solucin adems del tipo de
complementariedad de bases (tipo A-T o G-C) que tengan la molcula de ADN.
Los procesos de denaturacin y renaturacin son importantes en tcnicas de
hibridacin del ADN. Este proceso de hibridizacin permite el aislamiento y

deteccin de molculas especficas de ADN dentro de numerosas y diferentes

secuencias, adems posibilita el estudio de las relaciones de las muestras (Lodish
2000).
Leccin Dos: Modelos de Replicacin del ADN
Watson y Crick propusieron un posible mecanismo bsico para la replicacin del
ADN, donde la doble hlice es como una cremallera que se abre en uno de los
extremos, si esta analoga es vlida podemos obtener dos cadenas con base en el
extremo en cada cadena sencilla, teniendo en cuenta la complementariedad de
las bases, cada una de ellas que est expuesta tendr una base complementaria
en la otra cadena. Teniendo en cuenta que cada cadena tiene su complemento,
cada una de ellas actuar como molde o templete para comenzar a formar la
doble hlice, a partir de una doble hlice que fue desenrollada. Los nuevos
nucletidos adicionales provienen de nucletidos libres presentes en la clula.
Este modelo de replicacin se denomina Replicacin Semiconservativa o
Modelo Watson-Crick donde cada duplex obtenido contiene una cadena parental
y una cadena nueva sintetizada a partir de la parental.
Sin embargo existen otras propuestas de modelos de replicacin, como la
Replicacin Conservativa, donde el duplex es el producto de la unin de dos
cadenas nuevas y la doble hlice parental se mantiene. La Replicacin
Dispersiva consiste en duplex que contiene solamente segmentos del ADN
parental y una cadena de ADN nuevo (Griffiths 2000).
2.1. Experimento de Meselson y Stahl.
En 1958, Mattew Meselson y Franklin Stahl realizaron un experimento para
distinguir entre las tres posibilidades de replicacin. Tomaron cepas de E.coli
(Escherichia coli) y la cultivaron en un medio que contena el istopo de nitrgeno
pesado (15N) ms que el normal (14N). Este istopo fue insertado dentro de las
bases nitrogenadas, las cuales fueron incorporadas en la nueva cadena de ADN.
Despus de varias divisiones el ADN fue marcado con el istopo 15N,
posteriormente fueron transferidas a un medio con 14N y se tomaron las clulas. El
ADN fue extrado de las clulas y puesto en una solucin de Cloruro de Cesio
(CsCl) en una ultracentrfuga. Al centrfugar en altas revoluciones (50.000rpm) los
iones de Cesio y Cloruro tienden a ser empujados hacia el fondo del tubo,
generando un gradiente de Cl- y Cs+, con la mayor concentracin de iones en el
fondo. Las molculas de ADN en la solucin tambin son empujadas hacia el
fondo por la fuerza centrfuga.
Los cientficos encontraron que el incremento de las concentraciones de sales
genera una presin que empuja hacia arriba las molculas de ADN debido a la
tendencia que tienen a flotar (mecanismo boyante).
La flotabilidad del ADN depende de su densidad, la presencia del istopo 15N
cambia la densidad boyante del ADN. El ADN extrado de las clulas que crecen
por algunas generaciones en el medio con 15N puede ser diferenciable desde el

ADN de las clulas crecidas en 14N, por la posicin del gradiente de CsCl
(gradiente de equilibrio). Cada una de las muestras son llamadas comnmente
ADN pesado o liviano. Meselson y Stahl encontraron que despus de una
generacin que las clulas con 15N son movidas al medio con 14N el ADN forma
una sola banda con una densidad intermedia entre las densidades pesada y
liviana de las muestras de ADN. Despus de dos generaciones en 14N el ADN
forma dos bandas, una intermedia y otra en la posicin liviana (fig.1.), mediante
este experimento se demostr que el modo de replicacin en efecto es
Semiconservativo.
Fig.1. Experimento de Meselson y Stahl, permite la comprobacin del tipod e

replicacin semiconservativa del ADN. Fuente Griffths et,al 2000
2.2. Mecanismos de Replicacin del ADN
Watson y Crick inicialmente determinaron que el mecanismo de replicacin provee
la base de la fidelidad del ADN, es decir, que cada base nitrogenada de las
cadenas molde dicta la base complementaria de la cadena nueva.
Los mecanismos responsables de la replicacin del ADN fueron inicialmente
descubiertos en los sistemas bacterianos, en la actualidad estos sistemas han sido
estudiados con protenas aisladas desde levaduras hasta clulas eucariotas.
Los mecanismos y las protenas involucradas en la replicacin se han
profundizado en E.coli, sin embargo la replicacin en eucariotas son analizados
por analoga y algunas reacciones son similares. En este subcaptulo
explicaremos las reacciones y la maquinaria de replicacin del ADN inicialmente
en bacterias (especficamente E.coli) para llegar a profundizar en algunas
diferencias que se presentan en eucariotas. Antes de iniciar los mecanismos de
replicacin del ADN es importante describir varias enzimas y otros factores que
participan en la replicacin.

Las ADN polimerasas son enzimas incapaces de denaturar el ADN, son incapaces
de iniciar su funcin sin una sonda (primer) de ADN o ARN preexistente en la
cadena que va a copiar, las ADN polimerasas solo catalizan la adicin de
nucletidos en la direccin 5-3 es decir con el 3OH terminal de los nucletidos.
2.3. Origen de replicacin en procariotes
Los estudios genticos han sugerido que en E.coli la replicacin se inicia en un
sitio fijo de replicacin, el OriC (origen de replicacin)el cual es dependiente de
una protena codificada por el gen ADNA, este OriC contiene un sitio de inicio y un
sitio de terminacin, este OriC esta situado a 245 pares de bases de longitud y
tiene ciertas caractersticas; en primer lugar a cada lado del ori contiene un grupo
de secuencias en tandem ( bloque)de 13 pares de bases, adems contiene varios
sitios de unin a la protena ADNA, la cual se une a los cuatros sitios de unin en
el Ori formando un Complejo de Iniciacin que contiene entre 10 a 20
subunidades proteicas.
Aunque la ADNA se una al duplex de ADN en la forma de un circulo relajado, este
ADN solo puede iniciar la replicacin si est negativamente supeenrollado; la
razn para que se genere esta especificidad de enrollamiento es que solo as se
pueden separar las cadenas, las enzimas que controlan la separacin y el
superenrollamiento del ADN se llaman Topoisomerasas, de las cuales se hablar
ms adelante.
Una vez la ADNA se une al OriC se inicia la separacin o melting del duplex de
ADN, este proceso requiere de ATP y produce lo que se llama Complejo abierto.
2.4. Helicasas, Primasas y Protenas de Unin a la Cadena Simple
La separacin que genera dos cadenas molde en el cromosoma de E.coli es
mediada por el producto proteico del locus ADNB, el cual es una enzima Helicasa
esencial para la replicacin del ADN; la helicasa ADNB es un hexmero de
subunidades idnticas ancladas en cada una de las cadenas simples en el
complejo abierto formado entre la adn A y el OriC, esta unin tambin requiere de
ATP y adems de la protena adn C del locus ADNC que escolta a la protena adn
B hasta la unin con la ADNA.
Las helicasas constituyen una clase de enzimas que pueden moverse a lo largo
del duplex de ADN utilizando la energa de la hidrlisis del ATP para separar las
cadenas. Estas son bloqueadas para un posible realineamiento mediante las
Protenas de unin a la cadena simple (SSB, single-strand-binding protein). Las
helicasas como la ADNB se unen a una de las cadenas simples, luego se mueve a
lo largo de la cadena rompiendo los puentes de hidrgenos que forma la doble
hlice, como muchas protenas esta helicasa tiene una direccionalidad con
respecto a la reaccin de desenrollamiento, en el caso de la protena ADNB esta
se une al 3OH de la cadena simple, por lo tanto la direccin del desenrollamiento
es de 5 a 3.

Como se explic anteriormente, las ADN polimerasas solo pueden elongar las
cadenas con una secuencia primer de ADN o ARN. Los primers (o sondas) son
utilizados en la replicacin de procariotes y eucariotes, estos consisten en
secuencias cortas (no ms de 20 nucletidos) de ARN, cuya sntesis es catalizada
por la ARN polimerasa Primasa. Esta enzima es generalmente unida al segmento
de cadena simple donde esta unida la ADNB, el termino Primosoma se utiliza
para referirse al complejo formado entre la Helicasa y la Primasa, despus de la
unin de este complejo, las primasas sintetizan primers de ARN complementarios
a ambas cadenas del duplex del ADN, las cuales se mantienen separadas.
2.5. Topoisomerasas
Dentro de complejo de replicacin las Topoisomerasas juegan un papel
fundamental, ya que producen los cambios en la topologa, incluyendo la
formacin de supercolas negativas y positivas. Como se ha discutido, el
desenrollamiento causa estrs en el duplex de ADN, estas enzimas controlan la
topologa de la funcin del ADN en algunos pasos de la replicacin tanto en
procariotes como en eucariotes, existen dos tipos de Topoisomerasas
relacionadas en la replicacin.
a. Topoisomerasas Tipo I
Esta enzima fue la primera topoisomerasa en descubrirse en E.coli, puede
remover negativamente las supercolas sin hacer cortes en las molcula de ADN,
despus la enzima se une a la molcula de ADN y corta un sola cadena
generando simultneamente un enlace fosfodiester entre el fosfato 5 libre del
ADN y el residuo de Tirosina de la enzima, la formacin de los enlaces
fosfotirosina no requiere ATP u otro recurso de energa, la terminacin 3 hidroxil
del ADN es unido por enlaces no covalentes por la enzima. El ADN que no ha sido
cortado es pasado a travs de la ruptura de la cadena simple. La cadena clivada
es luego liberada formando una estructura con los mismos enlaces qumicos del
ADN inicial, pero con una regin superenrollada negativa menos. Las enzimas que
cortan una sola cadena se clasifican como Topoisomerasas tipo I(Topo I),
algunas topo I de eucariotes pueden remover regiones de superenrollamiento
positivo, pero en bacterias solo pueden desenrollar negativamente.
b. Topoisomerasas Tipo II
Este tipo de topoisomerasas se conocen comnmente como Girasas. Estas
topoisomerasas tipo II tienen la capacidad de cortar ambas cadenas de la doble
hlice de ADN, pasando otra porcin del duplex a travs del corte y liberando el
corte en una reaccin que requiere ATP, dependiendo del tipo de ADN estas
maniobras pueden tener un efecto en el cambio de un supercola positiva a una
negativa. Todos los tipos de topoisomerasas II catalizan la Catenacin y
Decatenacin, que es la unin y ruptura de dos duplex de ADN diferentes.

2.6. Sntesis de las cadenas Lder y Retrasada

Como se explic antes, las helicasas y las primasas periten resolver los problemas
inherentes a la replicacin del ADN, el desenrollamiento y los primers para las
ADN polimerasas.
En la replicacin ambas cadenas son copiadas a medida que la burbuja de
replicacin (o complejo abierto) se mueve a travs de las cadenas, el final de cada
burbuja representa un crecimiento de la horquilla de replicacin donde las nuevas
cadenas son sintetizadas.
En cada horquilla de replicacin, una cadena es llamada Cadena Lder la cual es
sintetizada continuamente a partir de un primer simple en la cadena molde
sencilla, la cual crece en la direccin 5-3.La sntesis de la nueva cadena se
genera en la misma direccin del crecimiento de la burbuja de replicacin.
Por otro lado, la sntesis de la Cadena Tarda es mucho ms complicada, debido
a que las ADN polimerasas solo pueden adicionar nucletidos en la posicin 3 de
un primer o secuencia de crecimiento. El movimiento de la horquilla debe ser de
5-3 por la actividad de las polimerasas, sin embargo la direccionalidad de esta
cadena va desde un 3 terminal a un 5 terminal, por lo tanto se genera una copia
discontinua de la cadena tarda para solucionar el problema de la direccionalidad.
Tanto en Procariotes como Eucariotes este aparente problema de incompatibilidad
de los requerimientos de la replicacin, son resueltos con una copia discontinua
de la cadena tarda mediante la utilizacin de mltiples primers.
A medida que la cadena lder progresa, los sitios descubiertos de la cadena tarda
son copiados a partir de secuencias cortas de ARN (< 15 nucletidos) producidos
por la Primasa. Cada uno de estos primers elongan por adicin de
deoxinucletidos en su 3 terminal. En E.coli esta reaccin es catalizada por la
ADN polimerasa III (Pol III); por lo tanto cada cadena tarda crece en direccin
opuesta a la horquilla de replicacin. Los fragmentos cortos obtenidos contienen
ARN ligado covalentemente al ADN, y son llamados Fragmentos de Okazaki. En
Bacterias y bacterifagos los fragmentos de Okazaki contienen entre 1000 a 2000
nucletidos pero en Eucariotes estos fragmentos contienen entre 100-200
nucletidos (Lodish 2000). . (fig.7.).
2.7. Elongacin y Terminacin de la Replicacin
Una vez el complejo de replicacin y el primer de ARN este formado y situado en
el Ori, la elongacin de las cadenas es un proceso menos difcil, aunque la
sntesis de la cadena tarda se haya realizado por medio de mltiples primers.
Dos molculas de ADN polimerasa III se unen a cada uno de los lados de la
horquilla, una adiciona nucletidos en la cadena lder y otra adiciona nucletidos
en la cadena tarda .La coordinacin entre la elongacin de las cadenas es
esencial.

Las dos polimerasas se unen en la horquilla de replicacin con un dmero de la

subunidad, la polimerasa que sintetiza la cadena est unidad a la subunidad en
forma de gancho, este complejo se mueve en direccin del movimiento de la
horquilla, por lo tanto elonga de manera contina la cadena lder. Este proceso
sigue cercanamente el movimiento de la helicasa ADNB que esta unida en la
cadena tarda molde como la protena de desenrollamiento del duplex del ADN.
La otra polimerasa, la cual elonga la cadena tarda, se mueve con el (gancho) o
clamp de la subunidad en la direccin opuesta a la horquilla de replicacin.
Mientras el proceso de elongacin avanza en la cadena tarda, el bucle (loop)
entre la polimerasa y la horquilla, aumenta.
La elongacin se puede referir como la unin de dos polimerasas que generan un
bucle donde se mueven las nuevas cadenas sintetizadas fig6. Eventualmente las
polimerasas que sintetizan la cadena tarda solo se completa cuando los
fragmentos de Okazaki estn formados, estas luego se disocian del molde pero la
subunidad se mantiene unida al complejo de replicacin; simultneamente la
primasa se une a la helicasa ADNB en un segmento de cadena simple de la
cadena tarda e inicia la sntesis de otro primer de ARN. El resultado de este
complejo ADN-primer une otro gancho de la subunidad para el segmento de la
cadena tarda, seguido por la unin de la polimerasa nuevamente al complejo. Una
vez los fragmentos de Okazaki se han dispuesto en la cadena complementaria los
primers de ARN son removidas por una polimerasa con actividad exonucleasa.
Los espacios generados en la remocin de los fragmentos son unidos mediante la
Ligasa para formar una cadena continua ya sintetizada.
Una vez que las nuevas cadenas son sintetizadas, el complejo de replicacin se
desensambla y termina la replicacin. (Lodish 2000).
2.8. Replicacin en Eucariotes
En eucariotes, la replicacin inicia desde mltiples puntos de origen de sta en los
cromosomas, en estudios en levaduras indican que aproximadamente se
producen entre 400 puntos de replicacin distribuidas entre los diferentes
cromosomas, en humanos se estima existen ms de 10.000 horquillas de
replicacin. En los cromosomas se presentan un problema especial en los
procesos de replicacin y es la terminacin de los cromosomas fig.2.

Fig.2. Complejo de la cadena tarda para formar los fragmentos de Okasaki

en donde se integran las primasas, helicasas y polimerasas. Fuente Griffiths
et,al 2000
Para la cadena lder, la adicin de polinucletidos durante la replicacin se puede
extender hasta el final por la direccionalidad de la cadena; sin embargo, en el
extremo, la cadena tarda genera un punto donde el sistema de primer de ARN no
funciona y una seccin permanece sin polimerizarse. Para resolver este problema
en los extremos (telmeros) tienen secuencias simples adyacentes. Estas
repeticiones no codifican para un ARN o protena pero sirven para definir la
terminacin de la replicacin. Una enzima llamada Telomerasa adiciona ests
simples unidades repetidas en los cromosomas. La telomerasa es una enzima de
una clase denominadas Transcriptasas reversas, las cuales producen ADN
desde ARN, la telomerasa toma una pequea molcula de ARN, la cual acta
como molde para la polimerizacin de las regiones repetitivas que se adiciona a la
regin 3 terminal. El ADN obtenido es luego capaz de servir de molde para la
sntesis de la otra cadena. Este proceso hace que en cada replicacin la longitud
telomrica se acorte, por lo tanto se ha demostrado que la edad esta relacionada
con el acortamiento de los telmeros. (Grifftihs 2000.)
Leccin Tres: Transcripcin: Sntesis de ARN
El ARN es la molcula intermediaria en el proceso de flujo de informacin entre el
ADN y las protenas. Este ARN se sintetiza en el ncleo de las clulas eucariticas
despus la mayora del ARN migra hacia el citoplasma, donde se produce la
sntesis de protenas. Normalmente la cantidad de ARN en una clula es
proporcional a la de protena.
3.1. La ARN polimerasa
Para dirigir la sntesis ARN sobre un molde de ADN es fundamental una enzima
denominada ARN polimerasa, la diferencia de sta con el ADN polimerasa es que
la primera utiliza como sustrato nucletidos que contienen azcar ribosa en vez de
desoxirribosa y no necesita un cebador para iniciar la sntesis ya que la base
inicial permanece como nuclesido trifosfato (NTP). La sntesis de ARN sobre un
molde de ADN se puede expresar gracias a que el nuclesido trifosfato funciona
como sustrato para la enzima que cataliza la polimerizacin de nuclesidos
monofosfatos, o nucletidos en cadenas polinucletidas (Ecuacin 1)
n (NTP) ADN (NMP) n + n (PPi)e
enzima
Ecuacin 1. Sntesis de ARN. NTP, nucleosido trifosfato; NMP, nucleosidos
monofosfatos o nucleotidos en cadenas polinucleotidas; PPi, fosfatos
inorganicos.

En el proceso de sntesis los nucletidos se unen por enlaces fosfodister 53.Para continuar el proceso de transcripcion se realiza una adicin secuencial de
cada ribonucleico a la cadena polirribonucleotdica utilizando como precursor a un
nuclesido trifosfato (Ecuacin 2).
(NMP) n + NMP
ADN
(NMP)n+1 + PPi
enzima
Ecuacin 2. Adicin secuencial de cada ribonucletido. NMP, ribonucletido;
NMP n+1, cadena polirribonucletida; PPi, fosfatos inorgnicos.
En la transcripcin en procariotes el modelo ms utilizado es la bacteria E. coli .
Su ARN polimerasa esta formada por subunidades , , y . La forma activa de
la enzima conocida como holoenzima contiene las subunidades 2. Los
polipptidos y son los que proporcionan la base cataltica y el sitio activo para
la transcripcin y la subunidad desempea una funcin reguladora en la
iniciacin de la transcripcin.
En eucariontes hay tres tipos de ARN polimerasa para tres tipos de ARN (Tabla 1),
estos tipos de polimerasas estn formadas por un mayor nmero de subunidades
polippticas en comparacin con procariontes.
Tabla 1. ARN polimerasas en eucariotes
Tipo
Producto
Localizacin
ARNr
Nucleolo
II
ARNm
Nucleoplasma
III
ARNr5S
Nucleoplasma
El resultado del proceso de transcripcin es la sntesis de una molcula de ARN

de cadena sencilla, complementaria a una regin de una de las dos cadenas del
ADN de doble hlice. La cadena que se transcribe se conoce como cadena con
sentido o cadena molde y la cadena complementaria es la cadena antisentido o
cadena acompaante.
El primer paso del proceso de trascripcin es la unin a la cadena con sentido,
donde la ARN polimerasa interacciona con el ADN. En procariotes, el lugar de esta
unin se denomina promotor y es reconocida por la subunidad sigma de la
polimerasa. Esta regin se localiza en la regin 5 y para iniciar el proceso de
transcripcin la enzima explora un trozo de ADN hasta que reconoce la regin
promotora, produciendo la unin del complejo. Despus de producirse la unin, la
hlice se desnaturaliza o desenrolla localmente, haciendo que la cadena molde
sea accesible a la accin enzimtica (Klug et al, 1999) Para procariotes se han

encontrado dos secuencias consenso de ADN; una conocida como la regin-10 o

caja de Pribnow y la otra es la regin-35. Para eucariotas se ha encontrado una
secuencia de este tipo conocida como la caja TATA.
3.2. La sntesis de ARN
Despus de formado el complejo enzimtico, la ARN polimerasa cataliza la
insercin del primer ribonucletido trifosfato 5, que es complementario al primer
nucletido en el lugar de iniciacin de la transcripcin de la cadena de ADN con
sentido. Al llevar a cabo la polimerizacin del ARN, los ribonucletidos
complementarios se insertan y se unen entre si por enlaces fosfodiester; este
proceso se conoce como elongacin de la cadena que va en direccin 5-3,
formando un dplex de ADN/ARN temporal, cuyas cadenas son antiparalelas entre
si. Despus de iniciado el proceso de elongacin de la cadena la subunidad sigma
se disocia de la holoenzima y la elongacin prosigue dirigida por el ncleo de la
enzima.
Para terminar este proceso, la molcula de ARN transcrita se libera del ADN con
sentido, y se disocia el ncleo enzimtico, para efectuar esto la enzima necesita
encontrar una secuencia de terminacin. En algunos casos, la terminacin
depende de un factor de terminacin denominado rho () que es una protena
hexamrica.
En algunas bacterias los genes son denominados cistrones, por lo cual el ARN
transcrito toma el nombre de ARNm policistrnico si en un pedazo de ADN se ha
transcrito ms de un gen. Mientras que para eucariotas en cada pedazo de ARN
transcrito solo se encuentra un gen por ende se denomina ARNm monocistrnico.
3.3. Transcripcin en eucariotas
Aunque muchos de los principios de la transcripcin en procariotas son aplicables
para la transcripcin en eucariotas existen diferencias importantes. En eucariotas
el sitio en donde se efecta la transcripcin es el ncleo y es llevada a cabo por
tres tipos de ARN polimerasa (Tabla 1). Adems el ARNm debe desplazarse
desde el ncleo, por el citoplasma, hasta los ribosomas.
El transcrito primario producido en el ncleo es usualmente procesado por algunas
vas antes de ser transportado al citoplasma, inicialmente una caperuza (cap)
formada por un residuo de 7-metil guanosina se une al extremo 5 del transcrito
por un enlace trifosfato extra que se forma en la transcripcin. Una cola de
residuos de adeninas son adicionadas en el extremo 3, esta cola de poliA tienen
entre 150 a 200 residuos de adenina; despus de estas modificaciones un paso
crucial denominado splicing remueve ciertas partes internas del transcrito primario.
El descubrimiento de este proceso de corte y unin de genes ha sido uno de los
ms importantes hallazgos en la gentica molecular en los ltimos 25 aos.
Los segmentos de ADN que son transcritos para una protena en particular, estn
interrumpidos por secuencias denominadas Intrones; el transcrito primario es

procesado por una serie de reacciones de corte y empalme (splicing) en donde los
intrones son removidos y las regiones del codificantes denominadas Exones son
unidas para formar un ARNm la cual consiste en una secuencia completamente
colineal con la protena a traducir (Grifftihs 2000.)
EL Splicing ocurre despus de la transcripcin y en algunos pasos de la misma,
debido a que existen transcritos de ARN que corresponden a la regin gentica
total ( intrones+exones) as como transcritos intermedios de longitud que pueden
ser aislados. Dependiendo del tipo de ARN que se transcriba y se edite existen
diferentes tipos de splicing para la edicin y maduracin de estos ARN.
Leccin Cuatro: Mecanismos de Reparacin Biolgicos
Los mecanismos de reparacin son una respuesta a un error inherente a la
replicacin del ADN y a lesiones espontneas que aaden nuevos errores, por eso
las clulas han desarrollado diferentes sistemas enzimticos que reparan dichos
daos. En algunos casos se utiliza vas de reparacin, que se estudiarn en este
modulo, despus la clula integrar cada uno de los sistemas estableciendo una
estrategia global de reparacin. Las vas de reparacin se clasifican en diferentes
categoras:
4.1. Sistemas que evitan los errores antes de que ocurran:
Son aquellos sistemas enzimticos que neutralizan compuestos nocivos antes de
que reaccionen con el ADN, ejemplo de este sistema es aquel que implica la
detoxificacin de radicales speroxido que se producen durante el dao oxidativo
del ADN, esto implica que una enzima como la desmutasa del speroxido actu
convirtiendo los radicales speroxido en Peroxido de Hidrogeno, y ste a su vez
es convertido en agua por la enzima catalasa.
4.2. Reversin directa de la lesin:
Es factible pensar en que la forma mas fcil de reparar una lesin es eliminndola,
pero este proceso no siempre se puede dar ya que algunas de las lesiones son
esencialmente irreversibles, pero tiene ciertas excepciones, como es el caso del
fotodmero mutagnico producido por la luz UV, este fotodmero puede ser
reparado por una enzima fotoreactivante conocida como PRE por sus siglas en
ingles; la PRE acta unindose al fotodmero y rompindolo en presencia de luz
visible a ciertas longitudes de onda y regenera as las bases originales (Figura 4),
pero este mecanismo tiene un inconveniente y es la imposible accin de la enzima
en la oscuridad, sin la presencia de luz visible no trabaja, es necesario de otras
vas para la reparacin del ADN.
4.3. Reparacin general por escisin:
Hay diferentes formas para escindir o separar bases alteradas y una porcin de
bases vecinas y as reparar el espacio por medio de la sntesis de ADN, la va mas
conocida esta dada por tres genes uvrA, uvrB y uvrC, que reconocen cualquier
tipo de lesin que altere de forma importante a la doble hlice de ADN.

Fig 3. Estructura del fotodmero producido por daos de la luz UV. Residuos
adyacentes de Timina quedan unidos por la radiacin UV y forman un dmero
de timina.Fuente Grifiths et al, 2000
Fig 4. Reparacin de un fotodmero de pirirmidinas inducidos por luz UV

mediante una enzima fotoreactivante (PRE). La enzima reconoce el dmero y
se une a l. En presencia de la luz, la PRE utiliza la energa luminosa para
romper el dmero en sus respectivos monmero Fuente Klug.

Fig 5. Reparacin general por escisin de nucletidos. Los genes uvrA, uvrB
y uvrC reconocen la lesin, la combinacin de los genes uvr (uvrABC)
forman una endonucleasa que libera la base daada. Las polimerasas y
ligasa sintetizan y unen los nucletidos reparados. Fuente Grifftihs et al
2000.
Es as como una endonucleasa (uvrABC) realiza una incisin alejada varios pares
de bases hacia cualquier lado de la base daada originalmente, eliminando as un
fragmento de ADN de cadena sencilla con una longitud de 12 pares de bases
aproximadamente, ese espacio libre se completa por medio de sntesis de
reparacin mediante la ADN polimerasa I y sellado posteriormente por una ADN
ligasa (Grifftihs 1993). (Fig 5).
4.4. Vas de reparacin especifica: Algunas lesiones no son lo suficientemente
fuertes como para prender el sistema de alarma de la reparacin general por
escisin por lo que es necesario recurrir a otros mecanismos.
a. Reparacin mediante la nucleasa AP: Cada clula tiene un sistema de

endonucleasas que atacan a aquellos sitios o lugares dentro de la cadena que
pierden espontneamente residuos de purinas o pirimidinas, estos sitios son
denominados sitios AP. Por esto las endonucleasas AP son de gran importancia

para las clulas ya que este proceso de depurinizacin es relativamente frecuente;

la enzima acta rompiendo enlaces fosfodiester en sitios AP e introduciendo
hendiduras en la cadena, originando el proceso de reparacin por escisin por
medio de tres enzimas, una exonucleasa, la ADN polimerasa I y la ligasa de ADN.
Debido a su eficiencia este mecanismo puede ser la etapa final de otras rutas de
reparacin (Fig 6).
Fig 6. Mecanismo de reparacin mediante la nucleasa AP.
La AP permite de depurinizacin y la posterior reparacin de las cadenas.
Fuente.Griffthis et al 2000
b. Reparacin mediante glucosilasas de ADN: Estas enzimas no rompen

enlaces fosfodiester, por el contrario atacan directamente a los enlaces Nglucosdicos, liberando la base alterada y originando un sitio AP, este sitio AP es
reparado por endonucleasas AP y ataca al enlace fosfodiester y la escisin por la
exonucleasa es seguida por un mecanismo de reparacin mediado por la ADN
polimerasa y la ligasa.
4.5. Reparacin posterior a la replicacin- emparejamiento errneo:

Algunos mecanismos de reparacin detectan errores incluso despus de la
replicacin, este es el caso de la reparacin de emparejamientos errneos, ya que

detecta errores producidos durante la replicacin del ADN. Este sistema es capaz
de reconocer pares de bases mal emparejadas, determinando cual de las dos
bases es la incorrecta y separndola para que se lleve a cabo la reparacin.
Pero en este sistema la propiedad ms importante es la de ser capaz de
discriminar entre la base correcta y la incorrecta, ya que los errores se dan durante
la replicacin y es por la incorporacin errnea de bases en la cadena recin
sintetizada, as que es la base de esa cadena la que debe ser identificada y
separada, tambin se reconoce la cadena molde o vieja por medio del retraso
normal de la metilacin posterior a la replicacin (Grifftihs 1998.)
4.6. Reparacin por recombinacin:
Este mecanismo esta asociado a tambin con el cortocircuito SOS (fig 7b) con
ellos tambin esta el gen recA en la reparacin despus de la replicacin, donde el
sistema de replicacin del ADN se detiene por un fotodmero producido por luz UV
u otra lesin bloqueante y empieza de nuevo despus de este bloqueo, dejando el
espacio libre en la cadena sencilla, esta reparacin por recombinacin llena ese
espacio con ADN cortado de la molcula hermana (fig 7a), provocando pocos
errores aparentemente; en el caso del cortocircuito SOS que es altamente
mutagnico, el sistema de replicacin continua sobre la lesin aceptando
nucletidos no complementarios para la sntesis de la nueva cadena.
Fig 7. Mecanismos de reparacin por recombinacin .a. Reparacin posterior

a la replicacin b. Replicacin SOS propensa al error. Fuente Griffths 1993
Leccin Cinco: Traduccin
Aunque el ARNm est directamente relacionado con la sntesis de protenas, si se
mezclara el ARNm y todos los 20 aminocidos en un tubo no se obtendra

protenas como es de esperar. Otros componentes se necesitan para la

produccin de protenas.
5.1. Caractersticas del Ribosoma
Los ribosomas consisten en dos subunidades las cuales se diferencian entre
Procariotes y eucariotes. Para procariotes las subunidades de sedimentacin son
de 50S y 30S formando una estructura de 70S y en eucariotes son las
subunidades 60S y 40S para formar una estructura completa ribosomal de 80S
(Fig 8).
Fig 8. Estructura de las subunidades del Ribosoma. Fuente Lodish 2001

Los ribosomas tienen sitios especficos que son capaces de unirse al ARNm, al
ARNt y a los factores de protenas especficos requeridos en la sntesis.
En general, el ARNm se une a la subunidad pequea (30S en procariotes, 40S en
eucariotes), luego el ARNt se une a los dos sitios del ribosoma, estos sitios se
sobrelapan en las subunidades. El sitio A (aminoacil) es lugar de entrada para un
ARNt que lleva un aminocido (aminoacil-ARNt), el sitio P (peptidil) es donde se
da el crecimiento de la cadena (peptidil-ARNt). Cada nuevo aminocido es
aadido por la transferencia a la cadena en crecimiento de un nuevo aminocido
mediante la formacin de un enlace peptdico. Un ARNt deacilado es luego
liberado del sitio P y el ribosoma se mueve de un codon a otro del ARNm
transfiriendo en nuevo pptido del sito A al sitio P liberando en sitio aminoacil para
la entrada de un nuevo ARNt-aminoacil (Fig 9).
5.2. Sntesis de Protenas
La sntesis de protenas es una reaccin qumica en donde cada aminocido es
unido a una molcula de ARNt especfico del aminocido por enlaces de alta

energa derivados del ATP. Este proceso es catalizado por una enzima especfica
denominada Sintetasa; existe una enzima por cada aminocido.
Posteriormente la energa de la carga del ARNt es convertida a un enlace
peptdico que une un aminocido a otro en una estructura de ARNr denominada
ribosoma; aminocidos nuevos son unidos permitiendo que la cadena de pptidos
crezca; este proceso contina hasta el aminocido n es decir el aminocido final
es aadido. Esta reaccin se realiza en presencia de ARNm, ribosomas, algunos
factores proteicos, enzimas e iones inorgnicos.
La sntesis de protenas puede dividirse en tres pasos: Iniciacin, Elongacin y
Terminacin.
5.2.1. Iniciacin
El primer paso de la iniciacin como se coment antes, es la unin del ARNm a la
subunidad pequea del ribosoma; esta unin esta estimulada por el factor de la
iniciacin IF3. Cuando no hay sntesis las subunidades del ribosoma se
encuentran en forma libre, la unin de las subunidades es el resultado de la
iniciacin de la traduccin.
Posteriormente el factor de iniciacin IF2 une el GTP y el ARNt iniciador
denominado fMet-ARNt ( N-formilmetionina) y estimula la unin de este al
complejo de iniciacin llevando el fMet-ARNt al sitio P del ribosoma.
5.2.2. Elongacin
La elongacin esta liderada por tres factores de protenas EF-Tu, EF-Ts y EF-G. el
factor de elongacin EF-Tu permite la entrada del aminoacil-ARNt dentro del sitio
A; para generar esto, el factor se une al GT formando un complejo EF-Tu GTP
que se une al ARNt. Despus, la hidrlisis del GTP a GDP en el complejo ayuda a
moverse el aminoacil-ARNt para luego llevar un nuevo ARNt al sito A. En la
elongacin el factor EF-Ts ayuda a la liberacin del complejo EF-Tu-GDP del
ribosoma y la generacin de un nuevo complejo (EF-Tu GTP).
En el paso de translocacin, el movimiento del sitio A al sito P en donde el
aminocido que entra es unido al pptido en crecimiento en el sito A; el ribosoma
luego transloca por movimiento al siguiente codn a lo largo del ARNm en una
direccin 5-3. Este paso es mediado por el factor de elongacin EF-G por
desfosforilacin del GTP pueden moverse los ARNt del sito A al sitio P.
5.2.3. Terminacin
Es importante tener en cuenta que el cdigo gentico presenta tres codones de
terminacin, UAG, UAA, UGA; estas tres tripletas no son reconocidas por ningn
ARNt pero s por factores proteicos denominados factores de terminacin (RF).El
factor de terminacin RF1 reconoce los tripletes UAA y UAG y el RF2 reconoce el
UGA. Un tercer factor RF3 ayuda a catalizar le reaccin de terminacin.

Cuando el peptidil ARNt esta en el sitio P, los factores de terminacin en

respuesta a los codones de terminacin se unen al sito A. El polipptido es luego
liberado del sitio P, los ribosomas se disocian dentro de las dos subunidades en
una reaccin de hidrlisis de una molcula de GTP.

CAPITULO 2: Principios de ADN recombinante
INTRODUCCION
El objetivo de la gentica es el estudio y funcin de los genes y genomas; desde
Mendel, los genes han sido identificados por la observacin estndar de las
proporciones fenotpicas en cruces controlados. Las caractersticas acerca de la
funcin de los genes provienen de la correlacin entre las mutaciones especficas
con las deficiencias de una enzima u otras protenas. La correlacin de estos sitios
de mutacin dentro del gen y los cambios en la secuencia de aminocidos llev a
entender mejor la estructura y funcin del gen. Sin embargo todas son inferencias
indirectas acerca de los genes, ningn gen haba sido aislado, ni su secuencia
haba sido detallada de manera directa. Aunque es relativamente fcil el
aislamiento de ADN de los tejidos, el ADN en un tubo es como una acumulacin
de moco; entonces Cmo se puede aislar un solo gen de esta masa mucosa de
ADN? La tecnologa del ADN recombinante provee las tcnicas para hacerla y
actualmente los genes y otras partes del genoma son aisladas de manera
rutinaria.
Leccin Seis: Importancia de aislar genes
La primera informacin del aislamiento de los genes es permitir la determinacin
de sus secuencias de nucletidos, a partir de esta informacin las caractersticas
de los genes pueden ser determinadas; por ejemplo el nmero de intrones y la
posicin de los mismos.
Adems la comparacin de las secuencias de ADN de los genes tambin puede
llevar a proponer una evolucin gnica, convertir las secuencias de ADN de un
gen en secuencias de aminocidos utilizando el cdigo gentico, permite la
comparacin de los productos proteicos de genes conocidos y por lo tanto inferir la
funcin de estos genes. La funcin tambin puede estudiarse por la modificacin
directa de partes de un gen seguido por la reintroduccin del mismo dentro del
genoma, adems un gen puede moverse dentro de un organismo a otro, un
organismo que contiene un gen forneo se denomina Transgnico. Por lo tanto,
el aislamiento de los genes es la primera forma de evaluacin sobre la naturaleza
del ADN recombinante y el principio de la tecnologa que puede ser utilizada.
Leccin Siete: Generacin de ADN recombinante
Los organismos escogidos para analizarse de los cuales se utilizar el ADN
donante para el estudio, son llamados Organismos Donantes. El procedimiento
bsico es extraer y cortar el ADN del genoma donante dentro de fragmentos
desde 1 a cientos de genes y llevar estos fragmentos para ser insertados
individualmente dentro de
molculas circulares pequeas de replicacin
autnoma como los plsmidos bacterianos. Estas pequeas molculas actan
como transportadores o vectores para el ADN fragmentado. Los vectores con sus
insertos son llamados ADN recombinante porque consisten de combinaciones

nuevas de ADN desde el genoma donante (el cual puede ser de cualquier
organismo) con el vector de ADN de un recurso totalmente diferente (plsmido o
virus). La mezcla de ADN recombinante es luego utilizada para transformar clulas
bacterianas, estas molculas recombinantes simples son fciles de rastrear
dentro de las clulas individuales de este tipo de microorganismos.
Las clulas bacterianas son cultivadas hasta la formacin de colonias, una clula
transformada con un solo vector recombinante se dividir dentro de la colonia con
millones de clulas todas portando el mismo vector. Adems una colonia individual
contiene una poblacin muy grande de insertos idnticos de ADN lo cual se
denomina Clones de ADN. Los resultados de los anlisis de los clones permiten
reintroducir el ADN clonado dentro de las clulas del organismo donante despus
de manipular y analizar la estructura y funcin del gen (Fig 10). Por lo tanto, los
clones de ADN permiten la amplificacin y recuperacin de un segmento de ADN
a partir de una muestra grande y compleja como es el genoma.
Identificar el gen donante de inters utilizando cruces
Clonar el gen donante de inters en clulas bacterianas
Caracterizar el gen donante en sistemas bacterianos
Modificar el gen de inters
Reintroducir el gen en las clulas donantes

Fig.10. Protocolo para ADN recombinante
Leccin Ocho: Molculas portadoras o Vectores
El vector ideal es una pequea molcula que facilite su manipulacin. Este vector
debe ser capaz de tener una replicacin ptima en una clula viva y mantener la
amplificacin del fragmento de ADN donante insertado. Otra importante
caracterstica es que tenga sitios de restriccin convenientes que pueden ser
utilizados para la insercin del ADN que va a ser clonado, los cuales sern
explicados ms adelante. Los sitios nicos son ms tiles porque el inserto puede

ser rastreado por un solo sitio en el vector, esto permite tambin tener un mtodo
para identificar fcilmente y recuperar la molcula recombinante. Numerosos
vectores son actualmente utilizados y la escogencia de ellos depende del tamao
del segmento de ADN que se necesite insertar y el tipo de aplicaciones a utilizar el
gen.
8.1. Tipo de Vectores
8.1.1. Plsmidos
Son molculas pequeas de ADN circular que no solo se distingue de los
cromosomas bacterianos sino que tambin estn de manera adicional a l, replica
su propio ADN independiente del cromosoma bacteriano. Estos plsmidos
contienen un ORI de replicacin que permite que se repliquen autnomamente, se
han encontrado diferentes tipos de plsmidos en las bacterias, la distribucin de
cualquier plsmido dentro de una especie en general es espordica, algunas
clulas tienen el plsmido y otras no.
Un ejemplo del plsmido es el Plsmido F el cual confiere ciertos tipos de
comportamientos conjugativos a las clulas de E.coli; este plsmido F puede ser
utilizado como vector para insertos grandes de ADN, sin embargo los plsmidos
son utilizados como portadores de genes resistentes a drogas, estos tipos de
genes son muy tiles por que el fenotipo resistente a drogas puede ser usado
para detectar no solo los plsmidos sino tambin del ADN recombinante portador
de estos genes. Los plsmidos son tambin eficientes en la amplificacin del ADN
clonado porque pueden tener muchas copias por clula as como cientos de
plsmidos. Dos vectores plasmdicos han sido utilizados en estudios genticos,
estos vectores son derivados de plsmidos naturales pero ambos fueron
modificados genticamente para utilizarlos como vectores.
El plsmido pBR322 es el ms simple en estructura, presenta dos genes de
resistencia a drogas tetraciclina y ampicilina (tetR y ampR). Ambos genes tienen
sitios de restriccin nicos que son tiles en clonacin, por ejemplo el ADN
donante puede ser insertado dentro del gen de resistencia a tet R, para una
insercin exitosa se cortar e inactivar el gen de resistencia y la clula se volver
sensible a la droga.
Adems el procedimiento de seleccin de los plsmidos con el inserto se da
inicialmente en los plsmidos ampR y luego de esas colonias se determinan los
tetS (sensibles) que son los que poseen el inserto del ADN donante.
El plsmido pUC es un vector ms complejo, cuya estructura lleva a la seleccin
directa de colonias conteniendo vectores con insertos de ADN donantes. El
elemento clave es una pequea parte del gen de la -galactosidasa de E.coli
dentro de esta regin ha sido insertada una pieza de ADN llamada sitio de
mltiple clonacin o polilinker, la cual contiene muchos sitios de restriccin
nicos tiles para insertar fragmento de ADN donante. El polilinker es un marco
traduccional en el gen de la -galactosidasa que no interfiere en la traduccin del

gen, la transformacin del plsmido utiliz clulas que contenan un gen de galactosidasa perdiendo el fragmento en el plsmido. Una complementacin
inusual se form en donde las protenas parciales codificadas por dos fragmentos
eran una unidad gnica funcional. Un sustrato sin color es adicionado en el medio,
el X-gal y la protena funcional lo convierte en azul; si el ADN insertado est en la
regin del polilinker entonces el gen de la -galactosidasa est inactivo y por lo
tanto ser la colonia de color blanco.
Algunos plsmidos que contienen grandes insertos de ADN forneo tienden a
perderlo, adems estos plsmidos no son tiles para clonar fragmentos de ms de
20 Kb.
8.1.2. Fagos
Los vectores virales en los cuales el gen o los genes de inters son incorporados
dentro del genoma del virus, ofrecen muchas ventajas para clonar realizar su
aplicacin. Debido a que los virus infectan clulas con alta eficiencia, el gen
clonado puede ser insertado dentro de las clulas en una frecuencia muy alta por
simple transformacin. Algunos vectores virales son especializados para producir
niveles altos de protenas codificadas por los genes clonados, por ejemplo, el uso
de bacuolovirus de los insectos para expresar protenas forneas en sistemas
eucariticos. Otros vectores virales como el vector basado en el M-13 bacteriano
est diseado para facilitar la secuenciacin y la generacin de mutaciones de
genes clonados. Los vectores derivados de los retrovirus pueden efectuar una
integracin estable dentro de los cromosomas de los mamferos manteniendo la
continua expresin de los genes. Los vectores virales son los vehculos escogidos
para las estrategias de terapia gnica, existen diferentes tipos de vectores virales,
entre ellos el fago y los vectores de cadena simple.
Fago : El fago es un vector conveniente en clonacin por diferentes

razones, primero la cabeza del fago empaqueta selectivamente un
cromosoma de aproximadamente 50Kb de longitud, esta propiedad permite
seleccionar molculas con el inserto de ADN donante; la parte central del
genoma del fago no es requerida para la replicacin o el empaquetamiento
de las molculas de ADN de E.coli; por lo tanto esta regin puede ser
cortada utilizando enzimas de restriccin y eliminarla. Los dos brazo son
ligados al corte del ADN donante, las molculas quimricas pueden ser
introducidas dentro de E.coli directamente por transformacin o
empaquetamiento dentro de las cabeza del fago in Vitro.
En el sistema in Vitro el ADN y los componentes de la cabeza del fago son

mezclados juntos y un fago infeccioso es producido.
Cualquiera de los mtodos utilizados permite que molculas recombinantes con

insertos de 10 a 15 kb sean los nicos que puedan presentar un empaquetamiento
ms efectivo dentro de la cabeza del fago, porque su tamao de inserto sustituye

a la parte central cortada (delecionada) del genoma del fago y as producir una
molcula de tamao de 50kb (fig.19). Adems la presencia de fagos en las
bacterias genera automticamente la seal de presencia de fagos recombinantes
llevando el inserto. Una segunda propiedad del vector es que molculas
recombinantes son empaquetadas dentro partculas de fagos infecciosos, lo cual
puede ser conveniente para el almacenamiento y manipulacin experimental.
Fagos de Cadena simple
Algunos fagos contienen solamente molculas de ADN de cadena simple, en una
infeccin en bacterias la cadena simple infectada es convertida en una forma de
doble cadena replicativa, la cual puede ser aislada y utilizada para clonacin; la
cadena simple de ADN es el sustrato requerido para las tcnicas de secuenciacin
que se profundizar en captulos posteriores. El fago M-13 es el ms utilizado para
este propsito, los fagos permiten la formacin de calvas al infectar las clulas
husped lo cual es til para el rastreo en bacterias o clulas transformadas.
(Griffiths 2000).
8.1.3. Csmidos
Los Csmidos son vectores hbridos de los fagos y los plsmidos y su ADN
puede replicarse en la clula como plsmido o se empaquetado como en el fago.
Sin embrago, los csmidos llevan insertos de ADN de aproximadamente 3 veces
ms grandes que aquellos portados por el fago (>45Kb). La clave de los
csmidos es que gran parte de la estructura del fago ha sido delecionada pero la
secuencia seal del promotor de la cabeza del fago permanece insertada la cual
se denomina Sitio COS. Esto permite que las cabezas de los fagos puedan
albergar casi todo el ADN donante. El ADN csmico puede ser empaquetado
dentro de partculas de fagos por el sistema in Vitro.
8.1.4. Cromosomas Artificiales
La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido el modelo ms sofisticado
eucarionte para la tecnologa del ADN recombinante. Una de las razones
principales es que la transmisin gentica de las levaduras est muy bien
entendida y la generacin de cepas mutantes que afectan cientos de fenotipos
diferentes es un recurso invaluable cuando se utiliza la levadura como sistema
molecular. Otra ventaja importante en levaduras, es la disponibilidad de un
plsmido natural de levadura de 6.3 Kb, que se lo conoce como plsmido 2
micron porque su circunferencias es de 2m. Este plsmido forma parte de los
vectores ms avanzados ya que pueden ser transmitidos por los productos
celulares de meiosis y mitosis.
Los vectores de levadura ms simples son derivados de plsmidos bacterianos
dentro de los cuales el locus de levadura de inters ha sido insertado (fig 11).

Fig.11. Estructura de un Plsmido insertado en levadura para la formacin de

YACS. Fuente Griffths et,al 2000
Cuando son transformados dentro de levaduras estos plsmidos son insertados
dentro de los cromosomas por recombinacin homloga con el gen residente, o
por entrecruzamiento simple o doble.
Con cualquier plsmido replicante autnomo, hay la posibilidad que una clula hija
no herede una copia por que la distribucin de las copias de los plsmidos a las
clulas hijas es esencialmente un proceso al azar y depende del lugar en donde
el plsmido est en el momento en que la pared se forma. Sin embargo, si la
seccin de ADN de levadura contiene un centrmero ste permite adicionar el
plsmido (fig 12a), luego el huso mittico que asegura la segregacin de los
cromosomas llevarn el plsmido en la misma va de separacin de las clulas
hijas. La adicin de un centrmero en un plsmido es el primer paso hacia la
creacin de un cromosoma artificial, para continuar con la linealizacin de la
secuencia del plsmido y la adicin de telmeros en la parte terminal (fig 12b).Si
este constructo contiene Orgenes de Replicacin de Levadura (ARS) constituyen
un cromosoma artificial de levadura (YACS), tambin podemos encontrar
Cromosomas Artificiales de Bacterias (BACS) y Cromosomas Artificiales Humanos
(HACS) cada uno de ellos con mayor capacidad de albergar insertos de ADN
recombinante. (Griffiths 2000).
Fig.12. Formacin de Cromosomas artificiales de levadura, YACS a partir de

plsmidos insertados en levadura. a. Seccin del genoma de levadura que

contiene centrmero donde se inserta el plsmido; b. Estructura final de los

YACS. Fuente Griffths et,al 2000
Leccin Nueve: Aislamiento del ADN
El ADN se encuentra estructurado en entidades discretas denominadas
cromosomas; en procaritas el ADN est suspendido en el citoplasma mientras
que en eucariotas se encuentra compartimentado en el ncleo; adems existe
ADN en otras estructuras como los virus y dentro de las clulas eucariotas en los
cloroplastos y las mitocondrias.
En trminos generales la purificacin o aislamiento de ADN implica el rompimiento
de la estructura que lo contiene y la eliminacin de cualquier sustancia
contamnate o molcula unida a ste, como son las protenas, las membranas y
las sales, etc.
El primer paso en la elaboracin del ADN recombinante es el aislamiento del
ADN donante y el vector. Los protocolos generales para el aislamiento de ADN
han estado disponibles desde antes del desarrollo de la tecnologa del ADN
recombinante, con el uso de estos mtodos el ADN extrado puede ser nuclear en
eucariotes o el genoma principal en procariotes; estos son algunos de los tipos de
ADN requerido para estos anlisis. El procedimiento utilizado para obtener un
ADN del vector depende de la naturaleza del mismo. Los plsmidos son
comnmente utilizados como vectores y estos vectores pueden ser purificados del
ADN genmico bacteriano. Uno de los protocolos utilizados para el aislamiento del
plsmido es por ultracentrifugacin; el ADN del plsmido forma una banda
diferente despus de la ultracentrifugacin en un gradiente de densidad de cloruro
de cesio conteniendo bromuro de etidio. La banda del plsmido es colectada por
medio de una perforacin en el tubo; otro tipo de protocolo se basa en el pH
alcalino de la solucin en el cual el ADN genmico bacteriano se degradada pero
el plsmido no, despus de la neutralizacin el ADN genmico se precipita pero el
ADN plasmdico se mantiene en la solucin. Los fagos como el tambin puede
ser aislados y utilizados como vectores en sistemas bacterianos, el ADN del fago
es aislado desde una suspensin pura de fagos y recuperado desde un fago
lisado. (Griffiths 2000).
Leccin Diez: Manipulacin del ADN
La brecha que hizo que la tecnologa del ADN recombinante fuera posible fue el
descubrimiento y caracterizacin de las Enzimas de Restriccin. Estas enzimas
son producidas por las bacterias como mecanismo de defensa de los fagos, las
enzimas actan como tijeras cortando el ADN del fago y adems inactivndolo. Es
importante resaltar que las enzimas no cortan el ADN de manera aleatoria, stas
cortan una secuencia blanco especfica de ADN, la cual es una de las
caractersticas que las hacen tiles para la manipulacin. Cualquier molcula de
ADN viral o humana, contienen sitios de enzimas de restriccin, lo cual permite
cortar el ADN en fragmentos ptimos para clonacin. Los sitios de restriccin no

son importantes dentro de la funcin del organismo, y ellos no pueden ser

cortados in vivo ya que los organismos no tienen enzimas de restriccin.
Estas enzimas se han clasificado en dos tipos: Enzimas tipo I son aquellas que
requieren ATP, iones de magnesio y S-adenolilmetionina como cofactores, este
tipo de enzimas casi no se utilizan; las Enzimas de Tipo II son ms pequeas y
requieren de iones cargados positivamente, son muy usadas en el laboratorio
dada su capacidad y forma de corte del ADN.
Cada especie bacteriana tiene al menos una enzima de restriccin, su
nomenclatura es simple: la primera letra es del gnero bacteriano de donde se
aisl seguido por las dos primeras letras de la especie (en itlicas), el nombre de
la cepa especfica de la que se purific, si es que tiene y el numeral romano indica
el orden de su descubrimiento, en caso de haber ms de una endonucleasa en
ese gnero y especie (Balbas 2002).
Las enzimas de restriccin reconocen secuencias en el ADN y cortan el esqueleto
fosfodiester dentro o cercana a las secuencias de reconocimiento. Las enzimas
tipo II reconocen secuencias palindrmicas en el ADN. Un palndrome es un
regin que presenta simetra de dada, que quiere decir que la secuencia de bases
en las dos cadenas de ADN es idntica cuando se leen en el sentido 5-3.La
mayora de estas enzimas reconocen secuencias palindrmicas de cuatro a seis
pares.
Ciertas enzimas cortan el esqueleto fosfodiester dejando algunos nucletidos sin
aparear lo que genera colas de cadenas sencillas llamadas Extremos pegajosos
que pueden ser en el extremo 3 o 5. Si el corte no deja extensiones de
nucletidos se conocen como Extremos Romos o rasurados. (fig13).
Ejemplo de Corte de Extremos Pegajosos
5-GAATTC-3
5-G
3-CTTAAG-5
3-CTTAA
AATTC-5
G-5
Ejemplo de corte de Extremos Romos

5-GAATTC-3
5-GAATT
C-5
3-CTTAAG-5
3-CTTAA
G-5
Fig.13. Modelo de corte de Enzimas de restriccin

Las enzimas de diferentes gneros y que reconocen las mismas secuencias de
ADN se denominan Isoezquizmeros. Los Isoezquizmeros imperfectos son
aquellas endonucleasas que reconocen las mismas secuencias pero cortan en
distintas posiciones.

Docenas de enzimas de restriccin con diferentes sitios de reconocimiento han

sido identificadas, como se resume en la Tabla 2, es importante resaltar que
todas las secuencias de reconocimiento son palndromes, aunque algunas corten
de manera diferente (Balbas 2002).
Cuando el ADN es digerido con enzimas de restriccin, los fragmentos obtenidos
pueden separarse por electroforesis en geles, donde los fragmentos migran al
someterse a la accin de un campo elctrico. Comnmente tanto el ADN donante
como el ADN del vector son digeridos con el uso de la misma enzima de
restriccin que produce un nmero de fragmentos, generalmente cada corte
presenta colas que permiten la unin entre los fragmentos mediante la reaccin
enzimtica de la ADN ligasa, enzima obtenida a partir de varias fuentes, entre
ellos el fago T4. Esta enzima cataliza la formacin de los enlaces fosfodiester
entre las bases de ADN, el ligado de los extremos pegajosos es ms fcil debido a
que los grupos fosfato e hidroxilo quedan continuos, el ligado de los extremos
romos es menos eficiente porque los extremos tiene mayor movilidad y es ms
difcil que los grupos qumicos se coloquen correctamente en la posicin
adecuada, los extremos cohesivos no compatibles entre si son imposibles de ligar
(Balbas 2002).
Tabla. 2. Sitios de Reconocimiento de corte de algunas enzimas de
restriccin
Enzima
Organismo
Sitio Restriccin
EcoRI
E.coli
5-GAATTC
CTTAAG -5
EcoRII
E.coli
5-GCCTGGC
CGGACCG- 5
HindII
Haemophilus influenzae
5-GTPyPuAC
CAPuPYTG- 5
HindIII
Haemophilus influenzae
5-AAGCTT
TTCGAA- 5
HaeIII
H.aegyptius
5-GGCC
CCGG-5
HpaII
H.parainfluenzae
5-CCGG
GGCC-5
PstI
Providencia stuartii
5-CTGCAG
GACGTC-5
SmaI
Serratia marcescens
5-CCCGGG
GGGCCC-5
BamI
Bacillus amyloliquefaciens
5-GGATCC
CCTAGG-5
BglII
B.globiggi
5-AGATCT
TCTAGA-5

CAPITULO 3. Marcadores Moleculares
INTRODUCCION
Los marcadores moleculares se definen como segmentos especficos de ADN que
pueden ser identificados dentro del genoma total, se encuentran localizados
muchas veces en sitios especficos y en la tecnologa del ADN recombinante son
utilizados como bandera o marcador (de ah su nombre) de la posicin de un gen,
de varios genes o de la herencia de una caracterstica particular; en los cruces
genticos las caractersticas de inters generalmente estn asociadas a un
marcador molecular, por lo tanto los individuos escogidos para los cruces son
aquellos que presenten el marcador que revela la presencia de la caracterstica a
estudiar (Green Facts., 2005).
Leccin Once: Marcadores Moleculares utilizados en Biotecnologa
Desde la dcada pasada, varios marcadores moleculares han sido desarrollados
para la identificacin y caracterizacin de organismos procariotes y eucariotes a
nivel de ADN. Los tipos de marcadores difieren en su poder discriminatorio,
reproducibilidad, la facilidad de interpretacin y estandarizacin. Los mtodos de
genotipificacin utilizan marcadores que sean invariables entre los laboratorios y
produzcan resultados exactos para analizar.. Entre los diferentes tipos de
marcadores los ms utilizados son: Los Polimorfismos de Longitud,
Las
Secuencias repetidas, Los polimorfismos de un solo nucletido entre otros.
Leccin Doce: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de RestriccinRFLP
Como se explic en la seccin anterior, el ADN puede ser cortado con enzimas de
restriccin, y estos fragmentos pueden ser unidos a otros fragmentos genmicos
para poder clonar. Debido a que el ADN de los cromosomas dentro de una
especie son generalmente homlogos, se espera que el tamao del fragmento de
restriccin sea constante entre los cromosomas y entre los individuos. Sin
embargo, cuando se analizan los fragmentos de restriccin se han encontrado
diferentes tamaos en diferentes individuos.
La explicacin es que los sitios de restriccin no siempre se encuentran en los
individuos, la ausencia de un sitio es generalmente causada por diferencias en un
solo nucletido con efectos neutrales. Esta presencia o ausencia de los sitios de
restriccin pueden ser analizada como dos allos: presencia (+) y ausencia (-); la
obtencin de individuos (+) y otros individuos (-) genera lo que se conoce como
Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restriccin RFLP, estos
marcadores pueden ser detectados con tcnicas de hibridizacin que se
analizarn en el captulo 3.

La significancia de los RFLP es triple, primero, si un individuo es heterocigoto para

los dos morfos (sitios de restriccin en los cromosomas homlogos) de un RFLP,
el locus heterocigoto puede ser utilizado como marcador para la cartografa
cromosmica, aunque inicialmente no se conoca loci de RFLP, cada vez se han
descubierto diferentes loci que tienen relacin con genes o con otros loci de
RFLP. Los RFLP al igual que los sitios de restriccin no tienen significancia
biolgica, pero pueden ser utilizados para ubicar genes, actuando como
posicionadores de estos genes para su mapeo o clonacin.
Segundo, los alelos de RFLP pueden ser utilizados como herramientas de
diagnstico, por ejemplo, en especies donde hay registros de cierta enfermedad, si
se puede establecer que los individuos que tienen la enfermedad tambin portan
un alelo RFLP puede sugerir no solamente que el locus RFLP est ligado al alelo
de la enfermedad, sino adems que el alelo especfico de RFLP tiene una relacin
en cis con el alelo de la enfermedad, es decir que la secuencia de restriccin hace
parte del alelo de la enfermedad. En tercer lugar, los RFLP pueden ser utilizados
para medir la diversidad gentica entre diferentes poblaciones o especies
relacionadas, la diferencias en los sitios de restriccin es efectivamente una
diferencia en el ADN, por lo tanto la medida del nmero total de RFLP diferentes
representa una medida de la diferencia gentica, importante en los estudios
evolutivos. (Griffiths 2000).
Leccin Trece: Polimorfismos de Longitud de Fragmentos AmplificadosAFLP
Los AFLP utilizan los polimorfismos de longitud de fragmentos los cuales estn
amplificados por medio de la reaccin en cadena de la Polimerasa (AFLP-PCR),
tcnica que se profundizar ms adelante. Estos marcadores no dependen de los
estados allicos, ni de la expresin gnica; lo cual permite el anlisis de
heterocigosidades, son marcadores codominantes, lo que significa que las tres
posibilidades de corte se pueden apreciar en el corrido electrofortico (Mueller et
al, 1999). Los marcadores AFLP as como los RFLP tienen su origen en los
cambios de bases en las secuencias o en los rearreglos del ADN que aparecen
naturalmente. Las inserciones, deleciones o sustituciones de bases pueden
ocasionar un cambio en el tamao de los fragmentos que se ve reflejado en la
distancia de desplazamientos de las bandas electroforticas (Vos et al, 1995).
La tcnica de AFLP est basada en la amplificacin de subgrupos de fragmentos
de restriccin genmicos usando PCR. Para el anlisis de los AFLP es necesario
el corte con enzimas de restriccin generalmente se utilizan dos enzimas, una
de corte comn y otra de corte menos frecuente, las mas utilizadas son EcoRI,
como enzima de corte comn y MseI como enzima de corte menos frecuente tanto
en genomas simples como en complejos. Despus de realizada la digestin,
secuencias de ADN denominados Adaptadores son ligados a la terminacin de
los fragmentos de ADN para generar el ADN molde para la amplificacin. Los
adaptadores se caracterizan por poseer una secuencia ncleo (core) y una
secuencia enzima-especfica, las secuencias de los adaptadores y los sitios de

restriccin adyacentes sirven como sitios de unin para la siguiente amplificacin

de los fragmentos de restriccin.
Para la amplificacin de los fragmentos tambin son necesarios los cebadores
(primers), los cuales se caracterizan por poseer una secuencia tambin
denominada ncleo la cual se unir a la secuencia del ADN molde obtenido
despus de ligar el adaptador con los fragmentos de restriccin.
Los cebadores tambin presentan una secuencia enzima-especifica que ser
complementaria con el adaptador y una secuencia de extensin que consiste en
nucletidos de seleccin que se unen a la terminacin 3- de la secuencia a
amplificar, los cuales se aparean con la cadena de ADN solamente en donde la
secuencia sea complementaria, en los genomas complejos las amplificaciones se
realizan con dos tipos diferentes de cebadores, en la primera amplificacin
(preamplificacin) se unen cebadores que tienen en sus extremos solo un
nucletido de seleccin lo que produce un nmero de fragmentos menor que el
obtenido en la digestin ( una reduccin de 16 veces el nmero de fragmentos),
sin embargo la gran cantidad de ADN que presentan este tipo de genomas
requiere para poder analizar, una nueva amplificacin, en este caso se utiliza
cebadores que en sus extremos tengan tres nucletidos de seleccin, lo que
permitir una reduccin mucho mayor de los fragmentos ( 256 veces) y as facilitar
el anlisis en los geles de electroforesis(Vos et al, 1995 )(Fig 14).
Leccin Catorce: Amplificaciones al Azar de ADN Polimrfico-RAPD
Los marcadores RAPD se caracterizan por ser porciones de ADN que han sido
amplificadas azarosamente en cualquier parte del genoma (nuclear y
citoplasmtico); al igual que los polimorfismos de longitud, la variabilidad de los
fragmentos esta determinada por la presencia o ausencia de estos, pero a
diferencia de los RFLP las desemejanzas estn dadas por las mutaciones en los
sitios de unin de los cebadores.
Los RAPD permiten amplificar caractersticas heredables sin que sea necesario
conocer las secuencias del genoma, se encuentran en todo el ADN y son loci
independientes, es decir, no son ligados fsicamente. En estos marcadores la
recombinacin es el principal proceso responsable de la variabilidad genotpica,
adems de ser marcadores que no son afectados por la seleccin natural.
Sin embargo, estos marcadores pueden presentar desventajas debido a que son
caracteres dominantes, los que no permite diferenciar entre un individuo
homocigoto y un heterocigoto, y son muy sensibles a la manipulacin en el
laboratorio.

Fig.14.
Identificacin
de
Fuente.http://210.212.212.4/AFLP_diagram.gif
marcadores
AFLP.
Los marcadores RAPD han sido utilizados para la elaboracin de mapas de

ligamiento, anales de genotipificacin, estudios poblacionales y pedigr, filogenias
e identificacin de clones.( JONG-MAN YOON, 2001).
Leccin Quince: Repeticiones en Tandem- Microsatlites
Los microsatlites son secuencias hechas de una secuencia motivo simple, no
ms de seis bases de longitud, que estn repetidas en tandem (bloques). Ests
regiones repetidas en tandem del ADN son clasificadas dentro de algunos grupos
dependiendo del tamao de la regin repetida. Los minisatlites o repeticiones de
nmero variable (VNTR) tienen repeticiones desde 9bp hasta 80 bp, mientras que
los Microsatlites o secuencias en tandem cortas (STR) contienen repeticiones
desde 2 hasta 6 pb.(Goldstein,1998). En la nomenclatura los microsatlites se
denotan con parntesis la repeticin en tandem y el nmero del subndice es el
nmero de repeticiones que tiene cada STR.
Los Microsatlites han sido detectados dentro de los genomas de cualquier
organismo con una alta frecuencia; en levaduras el motivo TA es el ms frecuente
y motivos de polipurinas y polipirimidinas en otros organismos. Los marcadores
microsatlites se caracterizan por ser selectivamente neutros y altamente
polimrficos, este polimorfismo se genera por las diferencias en el nmero de

repeticiones en los cromosomas, mutaciones generadas por errores en la

replicacin del ADN, adems de inserciones y deleciones.(Fig 15)
Repeticiones en Tandem
NNNCACACACACACANNN
Cromosoma
Cromosoma
NNNCACACACACACACACACANNN
Fig.15. Estructura de los microsatlites
Los Microsatlites se pueden clasificar en simples o compuestos dependiendo de

la organizacin de las repeticiones. En la tabla 3 se ejemplifica la clasificacin de
los microsatlites. Un microsatlite es interrumpido cuando entre los motivos de
repeticin se encuentra otra secuencia.
Tabla 3. Clasificacin de los Microsatlites
Los minisatlites y los microsatlites son considerados como marcadores

moleculares para estudios de gentica de poblaciones, relaciones evolutivas y
mapeo gentico, sin embargo existe evidencia de que las secuencias
microsatelitales tambin tienen papeles funcionales como elementos codificantes
o reguladores. Como secuencias reguladoras, los microsatlites se han
Tipo de Microsatlite
Ejemplo de repeticiones
Microsatlite Puro
(ACC)9
Microsatlite interrumpido puro
(ACC)6 TG (ACC)7
Microsatlite compuesto
(ACC)5 (TGG)9
Microsatlite interrumpido compuesto
(ACC)8 TG (ACC)5 GA (TTA)6
Microsatlite complejo
(ACC)8 TG (GA)12 (TTA)5 GC (TTA)4-3
encontrado corriente arriba de las regiones promotoras de secuencias codificantes

y en algunas instancias se han encontrado conservadas con respecto a las
secuencias codificantes. Las regiones promotoras que contienen microsatlites
sirven como elementos amplificadores (enhancer) en la expresin de constructor.
(Goldstein, 1999).

Los microsatlites tambin permiten la unin de protenas, lo cual es comn en

secuencias activadas corriente arriba; diversos estudios han demostrado que el
efecto de amplificacin de los microsatlites y su capacidad de unin a protenas
es una funcin del nmero de repeticiones en el microsatlite.
Como secuencias codificantes, los microsatlites han sido encontrados en varias
protenas y la variacin en el nmero de repeticiones de las secuencias de
aminocidos homopolimricos han sido asociados con efectos funcionales. En
estudios recientes se ha determinado un efecto fenotpico en la variacin de la
longitud de los microsatlites como en la variacin fisiolgica y de desarrollo a
nivel de organismos. Teniendo en cuenta estas caractersticas, los microsatlites
han sido propuestos como el mayor recurso de variacin gentica y adaptacin
evolutiva. (Goldstein, 1999).

Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD UNO
Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los

contenidos vistos y desarrollados en esta primera Unidad Didctica; as
como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el
desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera
individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente
ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los
cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de
aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos
relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en la
siguiente Unidad de aprendizaje. Los tems a tener en cuenta son:
1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera
cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo,
entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y
colaborativo en el desarrollo de esta unidad.
2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo
colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el
grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos
fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos
justificando su apreciacin
3) Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y
justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no
satisfactorio o supera lo esperado.
4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor
respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al
estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

Fuentes Documentales de la Unidad 1
Amoah E.A. & Gelaye S. Biotechnological Advances in Goat Reproduction. J.

Anim. Sci. 75:578585.1997
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UNIDAD DIDACTICA 2: PRINCIPIOS DE BIOTECNOLOGA

CAPITULO 4: Tecnologa del ADN recombinante
INTRODUCCION
Las clulas manipuladas y modificadas genticamente se utilizan para producir
dos clases de resultados: protenas y no protenas. En respuesta a la necesidad
de conocer las secuencias que codifican esas protenas, se han realizado diversas
tcnicas que permiten el reconocimiento de stas.
Con el desarrollo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), los anlisis
de las secuencias fueron ms sencillos y los resultados permitieron el inicio de la
bsqueda de los diferentes genes implicados en la expresin de caractersticas
fenotpicas interesantes. Actualmente, la tecnologa del ADN recombinante ha
desarrollado una serie de estrategias para reconocer y estudiar los diversos
mecanismos moleculares que contienen las secuencias de ADN.
Leccin Diecisis: Reaccin en cadena de la polimerasa-PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa PCR (Polymerase Chain Reaction) es
un tcnica que permite mediante la amplificacin (copiar muchas veces) identificar
secuencias de ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma,
siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucletidos. La PCR
fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B. Mullis en 1983.
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada
fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas
para que vuelvan a ser duplicadas.
16.1 Ciclos de amplificacin
La PCR bsica consta de un primer paso de calentamiento (94-95C) durante 5-10
minutos, en el cul se activa la ADN polimerasa, posteriormente tiene tres pasos
que se repiten, la unin de esos tres pasos se denomina Ciclos de
Amplificacin, un ciclo consiste de:
Desnaturalizacin.
Alineamiento - Unin del cebador.
Extensin de la cadena.
Este ciclo (desnaturalizacin-alineamiento-extensin) se repetir un nmero de

veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee.
Generalmente son 30 ciclos, ya que un nmero mucho mayor de ciclos no implica
un mayor rendimiento.

a. Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las
cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo
el calentamiento (94-95C) de la muestra la forma ms habitual. Otros mtodos,
raramente empleados, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de
realizar la desnaturalizacin.
b. Alineamiento
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se
unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario
que la temperatura descienda (generalmente, a 55 C, aunque se puede variar
segn sea el caso entre 45C y 65C). Estos cebadores actuarn como lmites de
la regin de la molcula que va a ser amplificada
c. Extensin de la cadena
Por ltimo acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la
cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario
para la sntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 C,
temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su mximo de actividad,
producindose una copia del fragmento que se desea amplificar. (Fig 27)
16.2 Componentes de la PCR
Para la reaccin de PCR son indispensables ciertos componentes que permitirn
una amplificacin efectiva, estos son:
16.2.1. Buffer de Amplificacin
Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2, el
MgCl2 es el componente que ms influye en la especificidad y rendimiento de la
reaccin ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq
polimerasa, es decir, actan como cofactores.
La concentracin ptima de MgCl2 depende de las concentraciones de los otros
componentes (1.5 mM en 200 mM de dNTPs), no obstante, a veces es necesario
probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una
acumulacin de productos inespecficos y una cantidad insuficiente hace que
disminuya el rendimiento de la amplificacin.

Fig.27. Esquema de los ciclos de PCR

16.2.2. Oligonucleotidos Iniciadores Cebadores-Primers
A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN
hay una serie de reglas a seguir: la longitud de cada uno de los primers debe estar
comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que cebadores de
mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos
carecen de suficiente especificidad.
Ambos primers deben tener una Tm (temperatura de denaturacin) similar la
diferencia mxima entre ambas temperatura debe ser de 5C, la relacin entre las
bases pricas y las bases pirimidnicas debe ser 1:1 (por mucho 40-60%), la
secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases pricas. Para
evitar la formacin de dmeros de primers es necesario comprobar que los primers
no contengan secuencias complementarias entre s.
16.2.3. Desoxinucletidos Trifosfatos-dNTP
Es el sustrato para polimerizar nuevo ADN, son los diferentes nucletidos que
utiliza la ADN polimerasa para copiar el fragmento de ADN que se va a amplificar,
la concentracin de dNTPs y de MgCl2 van relacionadas ya que el Mg+ se une a
los dNTPs.

16.2.4. ADN Polimerasas y ADN molde

Las ADN polimerasas son las enzimas que permiten la amplificacin de los
fragmentos de ADN, se caracterizan por ser termoestables, es decir, que
mantienen su actividad enzimtica an en altas temperaturas (94C), algunas
polimerasas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3 de la
cadena en donde agrega una adenina (A) si en este se encuentra una citosina (C),
la polimerasa ms utilizada en PCR es la Taq polimerasa, proveniente de la
especie Thermus aquaticus; la actividad de esta enzima se ve influida por la
concentracin de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes, de manera
que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.
Finalmente, El ADN molde, es el ADN del cual queremos copiar un determinado
fragmento, por lo tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la
sntesis de nuevas cadenas polinucleotdicas, puede ser cadena simple (ssADN) o
doble (dsADN).
Leccin Diecisiete: Tipos de PCR
17.1. PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que
se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy
especfica.
17.2. PCR Multiplex
Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma
reaccin, en este tipo de PCR se utilizan mltiples pares de primers (hasta 8) lo
que da una serie de productos, los amplificados pueden verse como mltiples
bandas en un gel, este tipo de PCR es frecuentemente usada en diagnstico
mdico.
17.3. PCR in situ
Es una PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, consiste
en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos
generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. En la tcnica de in
PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y luego deteccin
mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera
pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma.
17.4. RT-PCR
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una enzima denominada
transcriptasa inversa, para realizar la conversin del ARN a un tipo de ADN
llamado ADNc (ADN complementario). Es especialmente til cuando solo se

dispone de pequeas cantidades de ARN, esta tcnica se utiliza para amplificar

genes especficos
En esta PCR se requiere de dos tipos de cebadores: un cebador denominado
Antisentido que inicia la reaccin de RT-PCR y el cebador denominado Sentido
(sense) que realiza el duplex de ADNc, adems requiere una ADN polimerasa
dependiente de ARN, la RT-PCR puede ser usada para construir bibliotecas de
ADNc.
17.5. PCR tiempo real
Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento.
Para la deteccin de la cantidad de ADN especfico se emplea una sonda unida a
dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse), cuando la sonda est intacta, presentan una
transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no
se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes,
producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite
monitorear
el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de
amplificacin del gen. (The Board of Trustees of the University of South Carolina)
Leccin Dieciocho: Clonacin de genes especficos
Es importante tener en cuenta que el objetivo de la tecnologa del ADN
recombinante es la clonacin de un gen en particular o un fragmento del genoma
de inters. Las tcnicas utilizadas dependern de lo largo del gen y de las
caractersticas que se conocen del mismo. Generalmente los procedimientos
comienzan con una muestra de ADN como el ADN genmico eucariote, el
siguiente paso es la obtencin de una amplia coleccin de clones hechos a partir
del ADN original; esta coleccin se denomina librera de ADN.
Existen tres tipos de libreras, categorizada por el vector a utilizar, como se explico
en el captulo anterior, los vectores portan diferentes tamaos de fragmentos de
ADN, de eso depende la escogencia.
La otra categora es por el recurso de ADN que puede ser de ADN genmico o de
ADNc, la escogencia entre ellos depende de la situacin. Si es un gen especfico
que est activo en un tejido especfico de planta o animal, tendr sentido hacer las
libreras con ADNc, la cual ser enriquecida por el gen en cuestin. Una librera de
ADNc est basada en las regiones transcritas del genoma, lo cual la hace ms
pequea que las del genoma total. Aunque las libreras genmicas son grandes
stas presentan el gen en su forma nativa incluyendo intrones y secuencias
reguladoras. (Grifftihs 2000).
18.1. Bsqueda de clones especficos mediante la utilizacin de sondas
Las libreras, las cuales pueden contener cientos de miles de fragmentos
clonados, pueden ser analizadas para encontrar la molcula de ADN

recombinante que contenga el gen de inters, cada tipificacin es desarrollada por

el uso de sondas que pueden encontrar y marcar el clon que se necesita
identificar. Existen dos tipos de sondas: para reconocer ADN y para reconocer
protenas.
18.1.1. Sondas para reconocimiento de ADN
Estas sondas consisten en secuencias simples de ADN que se hibridizan (unin
entre cadenas) con otra secuencia simple de ADN por medio de
complementariedad de bases.
La identificacin de un clon especifico en una librera es un procedimiento de dos
etapas, primero las colonias o placas de las libreras son transferidas a una
membrana (generalmente de nitrocelulosa) mediante simple contacto con el
medio, (fig 28), las placas o colonias que no son transferidas a la membrana se
lisan y el ADN se denatura. El paso siguiente es la incubacin de la membrana
dentro de una solucin que contiene sondas que son especficas para la
secuencia del gen de inters, esta sonda puede ser marcada con istopos
radioactivos o fluorocromos. Generalmente la sonda es en si misma un fragmento
de ADN que tiene una secuencia homloga en la secuencia de inters, la posicin
de un clon positivo llega a ser claro cuando la concentracin del marcaje puede
ser evidenciada por medio de una mancha en una autoradiografia, por ejemplo.
Las sondas pueden obtenerse de diversos recursos, uno de ellos es el ADNc
proveniente de un tejido que expresa el gen de inters. Otro recurso de ADN son
genes homlogos de especies relacionadas, este mtodo depende del estado de
conservacin evolutivo de las secuencias a travs del tiempo, aunque el ADN a
analizar y la sonda no son totalmente idnticas, existe similaridad suficiente para
generar la hibridacin. Otro recurso de sondas de ADN son aquellas que se
pueden obtener si el producto proteico del gen de inters se conoce y las
secuencias de aminocidos han sido obtenidas. Sondas de ADN sinttico son
diseadas en base al conocimiento del cdigo gentico, es decir, hacer una
traduccin inversa y obtener las secuencias de ADN que codifica este gen, sin
embargo la redundancia del cdigo dificulta la obtencin de este tipo de sondas,
para eso se utilizan secuencias muy cortas de aminocidos para reducirla (Grifftihs
2000).

Fig.28 Identificacin de clones especficos mediante membranas de

nitrocelulosa en colonias cultivadas en cajas de Petri. Fuente. Griffths.2000
18.1.2. Sondas para reconocimiento de Protenas
Si el producto proteico de un gen es conocido y asilado en la forma pura, esta
protena puede ser utilizada para detectar el clon del correspondiente gen en una
librera. Un anticuerpo de la protena es preparado y este anticuerpo es utilizado
para detectar una librera de expresin. Estas libreras son hechas utilizando
vectores de expresin diseados para manifestar altos niveles de una protena
especfica bacteriana, para hacer estas libreras, el ADNc es insertado dentro del
vector enmarcado dentro de la protena bacteriana y las clulas llegan a hacer una
protena fusionada. Posteriormente se coloca una membrana sobre la superficie
del medio, posteriormente esta membrana es hibridizada con una solucin de

anticuerpos. Los clones positivos son revelados haciendo un anticuerpo para el

primer anticuerpo; el segundo es marcado con istopos o fluorocromos. Para
detectar la protena correcta el anticuerpo efectivamente identifica el clon que
contiene el gen que pudo sintetizar esa protena (Grifftihs 2000) (fig.29).
Leccin Diecinueve: Aplicaciones de los clones de ADN
Los clones de ADN pueden ser utilizados en diferentes formas de acuerdo a la
necesidad del experimento; unas de las aplicaciones es la utilizacin del gen
clonado a partir de un organismo para seleccionar el clon ms apropiado en otro,
dentro de estas maneras de manipulacin estn las hibridaciones de secuencias
de ADN, ARN o Aminocidos.

Fig.29 Identificacin de clones especficos mediante la utilizacin de

anticuerpos para el reconocimiento de protenas especficas. Fuente.
Griffths.2000
19.1 Hibridaciones de cidos Nuclicos
En el curso de la manipulacin de genes y genomas, es a menudo necesario la
deteccin y el aislamiento de molculas de ADN a partir de una mezcla. Hay
algunas estrategias tcnicas para el fraccionamiento del ADN, uno de los mtodos
ms conocidos es la electroforesis. Si una mezcla de ADN lineal es colocada en
un gel de agarosa, las molculas migrarn hacia las cargas elctricas opuestas,
en el caso de los cidos nuclicos hacia el polo positivo, dependiendo de su
tamao; adems si hay distintas clases de molculas en la mezcla esta formarn
bandas diferentes en el gel que pueden evidenciarse con compuestos qumicos
como el bromuro de etidio en un transiluminador; una vez las bandas son
separadas, cada banda puede ser cortada y la muestra de ADN se purifica del gel,
as la electroforesis puede ser diagnstica o preparativa.
Cuando se realiza una digestin de ADN genmico por medio de enzimas de
restriccin se obtienen muchos fragmentos que en un gel de electroforesis se
observa como una mancha alargada de ADN. Por lo tanto una sonda puede
identificar un fragmento en esa mezcla, mediante el uso de tcnicas de hibridacin
o transferencia llamadas Blotting.
Una de las tcnicas de hibridacin ms utilizadas es la desarrollada por E.M.
Southern llamada Southern blotting. Despus que los fragmentos de ADN estn
fraccionados en el gel, una membrana absorbente es colocada sobre el gel y las
bandas de ADN son transferidas (Blotting) dentro de la membrana por capilaridad.
Una vez se transfiere a la membrana, las bandas del ADN se mantienen en la
misma posicin relativa como en el gel, la membrana es posteriormente baada
en un recipiente con sondas marcadas y un autoradiograma es utilizado para
revelar la presencia de cualquier banda que es homloga a la sonda en el gel.
Estas bandas que han sido identificadas pueden ser cortadas y aisladas del gel.
ste puede ser calibrado para que corra ciertos fragmentos de ADN de tamao
determinado en el mismo (Grifftihs 2000) (Fig 30).
La tcnica de Southern blot puede ser extendida para detectar una molcula
especfica de ARN a partir de una mezcla fraccionada de ARN en un gel. Esta
tcnica se denomina Northern blotting para diferenciarla de la tcnica de
Southern para el anlisis de ADN. El ARN fraccionado es transferido dentro de
una membrana y una sonda es hibridada de la misma manera que en el Southern.
Una aplicacin de Northern es determinar si un gen especfico es transcrito en
cierto tejido y bajo ciertas condiciones. El ARN es extrado desde la clula ms
apropiada, posteriormente es corrido en electroforesis, transferido e hibridado con
el clon del gen a analizar, un resultado positivo significa la presencia del transcrito.

Fig.30. Protocolo bsico para hibridaciones de cidos nuclicos, Mediante

tcnica de Blotting. Fuente. Griffths.2000

Una tcnica paralela denominada Western blotting ha sido desarrollada para

transferir protenas electroforticamente fraccionada a partir de una gel de ADN y
luego ser visualizada con anticuerpos especficos para protenas, sin embargo las
sondas aqu no son ADN sino un anticuerpo marcado. Estas tres tcnicas son
herramientas poderosas en la deteccin e identificacin de macromolculas en
gentica molecular.(fig 31).
Fig.31. Comparacin de las tcnicas de Southern,Northen y Western blot

para un gen X especfico. Fuente. Griffths.2000
Leccin Veinte: Secuenciacin del ADN
El xito de la clonacin del gen deseado es solamente el principio de una segunda
ronda de anlisis en el cual el objetivo es la caracterizacin de la estructura y
funcin de cada gen. La secuencia de nucletidos del gen es la caracterizacin
final de su estructura gentica. Si conocemos una secuencia de ADN es posible
analizarlo con miras a detectar regiones reguladoras, genes estructurales,
intrones, etc.
Existen dos mtodos bsicos para lograr esto, uno qumico y otro enzimtico.
Ambos descansan en el principio terico de la generacin de fragmentos de
diferentes tamaos, segn la posicin de cada nucletido en la cadena de ADN
marcados con radioactividad o fluorescencia. Con el mtodo qumico, los
fragmentos se obtiene por rompimiento de las bases, mientras que el mtodo
enzimtico utiliza una ADN polimerasa para la sntesis de las cadenas.
Actualmente el mtodo enzimtico ha sido mejorado con la introduccin de la
automatizacin para realizar las sntesis de las cadenas.

El mtodo de secuenciacin ms utilizad es el desarrollado por Fred Sanger. Su

mtodo est basado en la sntesis de ADN, por lo que requiere la presencia de
una molcula de ADN como molde, en la presencia de dideoxy nucletidos
(ddNTP); estos se diferencian de los nucletidos por que presentan una prdida
del grupo 3-hidroxilo. Adems se hibrida el cebador a la cadena sencilla y esa
mezcla de reaccin se separa en 4 alcuotas. A cada una de estas se le agregan
dinucletidos (dNTP) ms un ddNTP que es incapaz de realizar el enlace
fosfodiester con otro nucletido por no tener el grupo hidroxilo en la pocin 3. La
polimerasa sintetiza la cadena complementaria y al incorporar el ddNTP la sntesis
se detiene. La proporcin del ddNTP con el dNTP correspondiente es tal que la
polimerasa incorpora un ddNTP por lo menos una vez en cada posicin donde se
encuentra el nucletido complementario en el molde. En esta reaccin uno de los
nucletidos est marcado, de manera que despus de separar los fragmentos
sintetizados por la polimerasa, mediante electroforesis en geles, las bandas se
observan al ser expuestas en rayos X o fluorescencia. El patrn obtenido se lee
directamente; las bandas ms cortas son las que migran hasta debajo de las
correspondientes al extremo 5(Fig 32)
Fig.32.Esquema de Secuenciacin con el Mtodo Sanger.

Fuente http://web.indstate.edu/thcme/mwking/sangersequencing.gif

CAPITULO 5: Conceptos y Aplicaciones bsicas en Biotecnologa Vegetal
INTRODUCCION
La biotecnologa vegetal es una extensin de esta tradicin de modificar las
plantas, con una diferencia muy importante la biotecnologa vegetal permite la
transferencia de una mayor variedad de informacin gentica de una manera ms
precisa y controlada.
Al contrario de la manera tradicional de modificar las plantas que inclua el cruce
incontrolado de cientos o miles de genes, la biotecnologa vegetal permite la
transferencia selectiva de un gen o unos pocos genes deseables. Con su mayor
precisin, esta tcnica permite que los mejoradores puedan desarrollar variedades
con carcteres especficos deseables y sin incorporar aquellos que no lo son.
Muchos de estos carcteres desarrollados en las nuevas variedades defienden a
las plantas de insectos, enfermedades y malas hierbas que pueden devastar el
cultivo. Otros incorporan mejoras de calidad, tales como frutas y legumbres ms
sabrosas; ventajas para su procesado (por ejemplo tomates con un contenido
mayor de slidos); y aumento del valor nutritivo (semillas oleaginosas que
producen aceites con un contenido menor de grasas saturadas).
Estas mejoras en los cultivos pueden contribuir a producir una abundante y
saludable oferta de alimentos y proteger nuestro medio ambiente para las futuras
generaciones.
http://www.monsanto.es/la-biotecnolog/conceptos-b-sicos-debiotecnolog-vegetal/conceptos-b-sicos-de-biotecnolog-vegetal.
Leccin Veintiuno: Establecimiento de cultivos vegetales in Vitro

La amplitud de la definicin cultivos de tejidos comprende un heterogneo grupo
de tcnicas mediante las cuales un explante, (parte separada de un vegetal) se
cultiva aspticamente en un medio de composicin qumica definida y se incuba
en condiciones ambientales controladas. Las posibilidades de aplicacin de tales
cultivos se pueden resumir en estudios de fisiologa, gentica, bioqumica, la
bioconversin y produccin de compuestos tiles, el incremento de la variabilidad
gentica, la obtencin de plantas libres de patgenos, la propagacin de plantas,
la conservacin e intercambio de germoplasma.
De estas consideraciones surge el establecimiento de los cultivos de tejidos, es
decir, la separacin del explante y las operaciones relacionadas con su incubacin
in Vitro, depender en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo
que se emplee, el cual estar condicionado al objetivo del estudio; por lo tanto las
tcnicas que se emplean no son exactamente las mismas que se usan para

cultivar meristemas, adems un determinado sistema de cultivo puede ser de gran

utilidad para un objetivo pero intil para otros.(Roca et al,1991)
21.1. El Explante
La eleccin de un explante apropiado constituye el primer paso para el
establecimiento de los cultivos, dicha eleccin en parte esta determinada por el
objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada (Fig 33). Si el objetivo final es
la produccin de callos, es factible la utilizacin de una vasta gama de explantes
que permiten una proliferacin callosa. Cualquier explante que contenga clulas
nucleadas vivas se puede emplear para la obtencin de callos, por ejemplo, en el
caso de numerosas dicotiledneas herbceas se puede lograr la proliferacin
callosa mediante la utilizacin de explantes provenientes de diversas partes del
vegetal. Es muy frecuente la utilizacin de pices o mesristemas caulinares, hojas,
entrenudos cotiledones, races, etc.
Fig.33.Procedimiento de preparacin de los explantes para cultivos In Vitro.

Fuente. http://www.serbi.luz.edu.ve/img/fagro/v16n3/art3fig1.jpg
En el caso de vegetales en los cuales la obtencin de callos no este limitada por el
tipo de explante, ste se seleccionar por razones prcticas como disponibilidad,
facilidad de manipulacin, homogeneidad, baja contaminacin y rpida respuesta
in Vitro; en estos casos los explantes se obtienen de plantas jvenes de
invernaderos o semillas germinadas en condiciones aspticas, hay otros vegetales
ms recalcitrantes en la obtencin de callos, entre ellos estn las plantas leosas
y algunas gramneas. Para la obtencin de haploides se cultivan anteras y en
menor medida, inflorescencias, microsporas u ovarios, adems para la obtencin
de plantas libres de patgenos y germoplasma se cultivan meristemas (Roca et
al, 1991).

En relacin con la especie vegetal utilizada, e importante tener en cuenta la

variabilidad asociada con el genotipo de las plantas. Es muy frecuente que en
idnticas condiciones de medio y ambiente, las respuestas in Vitro del cultivo de
un determinado explante en una especie difieran con el modo de cultivo empleado;
ejemplos de estos cambios se han observado en los callos de yuca, pimiento,
man y arveja.
Las respuestas de los explantes cultivados In Vitro pueden variar notablemente
con el estado de desarrollo y edad ontognica de los mismos. Mroginski plantea
que el xito en la obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras depende
en gran medida de su estado de desarrollo al momento de su cultivo; en la
mayora de las plantas leosas los explantes provienen de materiales juveniles,
en plantas herbceas la regeneracin de plantas a partir de hojas depende de la
edad de los explantes (Roca et al, 1991).
El tamao del explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el
establecimiento de los cultivos; cuanto ms grande sea, mayores son las
posibilidades de obtener proliferacin callosa; existe un tamao mnimo para la
proliferacin, el efecto del tamao del explante puede apreciarse en cualquier
sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene; su
importancia ha sido sealada en cultivos de meristemas, anteras, suspensiones
celulares, embriones y protoplastos.
Se debe tener en cuenta la incidencia de otros factores que a menudo pueden
alterar las respuestas de los explantes cultivados; entre estos factores estn la
poca del ao en que se realizan los cultivos, especialmente cuando se obtienen
de plantas de invernadero o campo. Adems se debe tener en cuenta los
pretratamientos a los explantes y las condiciones de crecimiento de las plantas
donantes de los mismos (Roca et al, 1991).
21.2. Medios de Cultivo
Una vez se ha definido el objetivo de estudio con el cultivo in Vitro del explante, es
necesario elegir un medio apropiado de cultivo en el cual considerar no slo sus
componentes sino su preparacin. En la actualidad existen innumerables
formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos
qumicos que suministran: carbono, nutrimentos minerales, vitaminas, agente
gelificante, sustancias reguladoras de crecimiento, entre otros.
Las fuentes de carbono permiten la generacin de alimento in Vitro. Las fuentes
de carbono ms utilizadas son la sacarosa que se puede remplazar por glucosa,
para el crecimiento de callos y suspensiones celulares se incorpora al medio
mioinositol como fuente de carbono.
Cualitativamente los medios de cultivo aportan los mismos elementos, macro y
micronutrientes, que se consideran esenciales para el crecimiento de plantas
enteras, en algunos medios se presentan altas concentraciones de nitrgeno y
potasio con respecto a otros medios; el nitrgeno se suministra en forma de nitrato

y amonio, aunque los cultivos pueden prosperan con solo uno de estos
componentes como fuente de nitrgeno; otras fuentes de este elemento incluyen
glutamina, urea y casena hidrolizada (Roca et al,1991). Muchas veces los medios
de cultivo contienen comnmente varias vitaminas, es probable que en forma
general solo sea esencial la incorporacin de tiamina.
Otro componente de los medios de cultivo especialmente los de tipos semislidos
es el agar, se debe considerar especialmente la pureza del agar, ya que
variaciones en la pureza del agar puede modificar las respuestas de los cultivos
in Vitro. En algunos casos se obtienen en este tipo de cultivos las respuestas
deseadas mediante el empleo de medios basales sin reguladores de crecimiento;
sin embargo en la mayora de los casos se hace necesario agregar al medio
sustancias reguladoras del crecimiento tipo auxinas o las citocininas.
Existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a
los medios de cultivo, como fuentes de nitrgeno reducido, factores de
crecimiento, carbohidratos, entre otros. Adems de glicina, en ocasiones se
incorporan al medio otros aminocidos como asparagina, cistena y L-tirosina,
tambin se pueden adicionar cidos orgnicos como el ctrico, el mlico, el
succnico y el pirvico, como precursores de aminocidos, tambin es frecuente la
adicin de L-glutamina y de casena hidrolizada. (Roca et al, 1991).
Leccin Veintids: Propagacin clonal in Vitro de plantas
Existen varias vas generales para realizar la multiplicacin clonal; entre ellas
estn la multiplicacin de brotes de yemas, la embriognesis somtica, la
organognesis, el microinjerto, entre otros.
22.1. Cultivos de Meristemas
El desarrollo de procedimientos para multiplicar y mantener plantas en cultivos
aspticos ha recibido mucha acogida, desde que los explantes y meristemas de
muchas plantas se han utilizado para obtener y multiplicar los materiales
genticos; de un explante se regenera una planta y en otros casos se puede
estimular la formacin de brotes mltiples. En cada uno de estos casos se espera
a menudo lograr la formacin de ramas axilares que puedan separarse y
enraizarse; tericamente estos brotes pueden producir ramas, estos mtodos han
sido tiles para la multiplicacin clonal de muchas herbceas y leosas (fig 34).

Fig.34. Procedimiento para cultivos de meristemas. Fuente. www.arsgrin.gov/ncgrp/images/potatotubes.jpg

22.2. Embriognesis Somtica
Se definen como embriones somticos, asexuales o adventicios al resultado a
partir de las clulas que no son el producto de la fusin de gametos. Son
estructuras bipolares con un eje radical-apical y no poseen conexin vascular con
el tejido materno, estas estructuras deben tener la capacidad de crecer y formar
plantas normales (Roca et al, 1991). La embriologa adventicia es un evento
morfogentico que ocurre in vivo a partir de nucelas (Fig 35a) en algunas especies
como los ctricos, Citrus spp; a partir de integumentos del vulo (Fig 35b) como
ocurre en las pomarrosas Eugenia malacencis, tambin se origina de otros tejidos
localizados dentro del ovario como el endosperma o el cigoto.
Fig.35.a Estructura de las nucelas b. estructuras de los vulos para

embriognesis
somtica.
Fuente
http://www.redbio.org/rdominicana/redbio2004rd/Memoria_REDBIO_2004/
La totipontencialidad de las clulas vegetales cultivadas in Vitro fue establecida
por Reinert y Steward (1958), quienes describieron la induccin de embriones
somticos a partir de callos derivados del pice radical de la zanahoria. Gracias a
sus estudios se han regenerado plantas in Vitro por medio de la embriognesis
somtica a partir de clulas generativas.
En ciertos aspectos, los embriones somticos mantienen una similitud con los
embriones cigticos; sin embargo tanto in Vivo como in Vitro pueden sufrir

algunas anormalidades en el desarrollo por ejemplo la fusin de cotiledones

(Roca et al, 1991).En los estudios de embriognesis somtica la zanahoria se la
ha considerado el sistema modelo, no solo para estudios sobre control del
desarrollo sino tambin para determinar los eventos bioqumicos que controlan la
embriognesis.
Una de las caractersticas que dan lugar a la formacin de proembriones es que
las clulas deben ser ricas en almidn y poseen una vacuola pequea;
adicionalmente se necesita la presencia de una auxina para la iniciacin de un
callo embriognico, la ms utilizada es la denominada 2,4,-D la cual
aparentemente brinda estmulo e inicia la embriognesis somtica en el callo, sin
embargo la presencia de la auxina detiene la maduracin de los embriones y la
germinacin por lo que hay que utilizarla en concentraciones bajas. La presencia
de nitrgeno reducido es clave para la induccin de la embriognesis somtica y la
maduracin de los embriones (Roca et al,1991).
Existen diversos factores que afectan la embriognesis somtica, entre ellos esta
el explante, el medio de cultivo, los reguladores del crecimiento y las condiciones
medio ambientales. Tericamente, todos los tejidos vegetales tienen la capacidad
de formar callos in Vitro, sin embargo, son pocos los explantes que llegan a
formarlos. Comnmente se han usado como explantes partes de plntulas como
los cotiledones, hipoctilos, embriones, pices caulinares, segmentos de tallos,
hojas, races e inflorescencias inmaduras. Los embriones inmaduros se utilizan
generalmente en los pastos y en los cereales; en otras plantas se han utilizado la
porcin basal de las hojas como en el sorgo.
En las gramneas es importante la posicin del cigoto en el cultivo, el eje
embrionario debe estar en contacto con el medio. Con las plantas leosas la
seleccin del explante se hace en forma muy restringida; en especies de ctricos
se han utilizado nucelas. Adicionalmente se han obtenido explantes de hojas
jvenes, de inflorescencias, de pices radicales en palmas y del endosperma en
arbustos dando como resultados plantas triploides.
La respuesta embriognica del callo depende del genotipo de la planta. Algunos
cultivos pueden responder fcilmente a un medio especfico mientras otros no. El
estado de desarrollo de la planta madre afecta la respuesta morfolgica del
explante; se ha observado que los explantes tienen mejor respuesta si provienen
de plantas maduras.
Generalmente se usa el medio desarrollado por Murashige y colaboradores (1962)
donde la concentracin alta en sales es benfica para el crecimiento de los
embriones. Tambin se han hecho pruebas aumentando las concentraciones de
sacarosa o manitol, el nitrgeno suministrado como nitrato o in amonio es
esencial, y el hierro permite la embriognesis, en ausencia de ste los embriones
globulares no son capaces de desarrollarse hasta la madurez. La mayora de los
cultivos necesitan de concentraciones altas de auxinas en el medio para la
formacin de embriones (Roca et al,1991).

Factores como las condiciones del medio se han divulgado para la optimizacin de
los cultivos, como es la intensidad de la luz, el tipo de medio y la sincronizacin de
los mismos. Fuera del grupo de las angiospermas se han dado pocos ejemplos de
embriognesis somtica, aunque es posible la regeneracin de plantas como los
pinos. Las especies de plantas leosas en general han sido difciles de regenerar
in Vitro a excepcin de las que se han producido a partir de las nucelas.
2.3. Organognesis
A diferencia de la embriognesis somtica, la organognesis comprende el
desarrollo de yemas o de meristemas radicales a partir de explantes
(directamente) o de los callos. Varias partes de una planta pueden responder
directamente a idnticas condiciones de cultivo y tales diferencias reflejan el
estado fisiolgico de la fuente del explante. ste estado determina adems los
factores exgenos que se deben aadir o sustraerse del medio de cultivo para
inducir la respuesta morfogentica requerida. Los factores endgenos podrn
variar cuantitativamente de acuerdo con las condiciones ambientales, el genotipo,
el tipo de clula, etc.
Para que la organognesis ocurra a partir de los callos, se deben producir
cambios que conduzcan a la organizacin celular. Este proceso involucra
diferenciacin celular, interaccin celular y reaccin a seales especficas.
El trmino organognesis de novo en el cultivo de tejidos se refiere a la
diferenciacin dentro del explante (Thorpe, 1980), por ejemplo, a partir del floema
externo de segmentos del tallo del tabaco cultivado in Vitro se desarrollan
meristemas primarios, mientras que en otras especies a partir de protoxilema de
races de explantes se desarrollan races y primordios de yemas.
Una funcin primaria de la mitosis en la organognesis es la formacin de un
nmero crtico de clulas en divisin activa; stas son capaces de responder a las
seales de desarrollo. Los meristemoides o regiones localizadas de clulas en
divisin activa se componen de clulas pequeas, isodiamtricas, con un
citoplasma denso, vacuolas pequeas y ncleos prominentes; usualmente
contienen varios orgnulos y grandes cantidades de almidn del cual necesitan en
cantidad considerable durante su diferenciacin (Thorpe, 1983).
La mayora de estos meristemoides se asemejan a meristemas verdaderos y
poseen conexiones vasculares con el callo o el tejido circundante. Bajo
condiciones apropiadas de cultivo pueden formar yemas o races primarias.
Al igual que en la embriognesis somtica existen factores que afectan la
organognesis, entre ellos estn los factores relacionados con el explante como lo
es su edad fisiolgica y la ontogenia, su tamao , el tejido y rgano de donde
provenga as como el estado fisiolgico de la planta madre y la poca del ao en
que se realice el cultivo. Cualquiera de estos factores o su combinacin pueden
afectar profundamente la respuesta morfogentica.

Leccin Veintitrs: Micropropagacin

23.1 Concepto
La micropropagacin es una multiplicacin masiva de tejidos in Vitro a partir de
diferentes porciones o explantes extrados de tejidos u rganos mediante mtodos
aspticos. Esta tcnica se ha utilizado con xito en especies hortcolas,
ornamentales y leosas, comprobando as las ventajas sobre otros sistemas
convencionales, algunos de los ms importantes son:
Incremento acelerado del nmero de plantas derivadas por genotipo

Reduccin del tiempo de multiplicacin
Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie
reducida, a bajo costo y con tiempos econmicamente costeables.
Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga
Facilidad para transportar el material in Vitro de un pas a otro con menos
restricciones aduaneras.
Posibilidad de multiplica rpidamente una variedad de la cual solo existan
pocos individuos.
23.2. Pasos en la Micropropagacin

Se han determinado tres pasos importantes en la Micropropagacin de una
especie, estos son:
Establecimiento del cultivo asptico:
Despus de realizar la seleccin del explante, es necesario la desinfeccin del
tejido para evitar el crecimiento de microorganismos y hongos que competiran con
las porciones de tejido extrado, esta desinfeccin puede realizarse con diferentes
compuestos como lo son: el Hipoclorito de sodio y de calcio, peroxido de
hidrogeno, nitrato de plata, cloro comercial y disertes concentraciones de alcohol,
es importante tener en cuenta que dichas concentraciones varan dependiendo de
las caractersticas propias del explante y se determinan mediante ensayo y error.
El explante debe adaptarse bien a las condiciones del cultivo in Vitro, ya que el
aislamiento de tejido u rgano del resto de la planta, genera estrs y altera su
metabolismo celular.
Crecimiento del inoculo:
La porcin del tejido extrado se multiplica con o sin la formacin de callos,
dependiendo del cultivo el crecimiento puede deberse a la divisin de las clulas,
el aumento de tamao o a las dos posibilidades; pero cuando existen fines de
Micropropagacin la formacin de callos se evita, debido a que las plantas que
vienen de los callos pueden tener algn grado de variacin que puede ser
epigentico, (que se define como los cambios reversibles de ADN que hace que
unos genes se expresen o no dependiendo de condiciones exteriores) o
mutaciones verdaderas. Una nueva diferenciacin se asocia a produccin de
clulas nuevas y su organizacin esta afectada por las condiciones in Vitro y
ganancia de peso seco.

El Enraizamiento de los brotes y preparacin para su trasplante:

El proceso de enraizamiento de los brotes in Vitro necesita de un trasplante a un
medio de cultivo con concentraciones de sales ms bajas, se requiere a su vez un
cambio en el balance hormonal, que puede ser por la disminucin de citocianinas
y el aumento de axinas, aunque depende de la especie, slo con eliminar las
citocianinas es suficiente para estimular la diferenciacin del sistema radical. El
sistema radical modificado in Vitro necesita de una adaptacin paulatina a las
condiciones del suelo antes de trasplantar al invernadero, este perodo de
adaptacin se conoce como periodo de endurecimiento en el cual las plantas se
riegan con medio de cultivo diluido al 50% y se sustituye poco a poco por
soluciones nutritivas menos complejas, as mismo el trasplante tiene que hacerse
a recipientes con suelo estril y cubierto con bolsas para adaptar a las plantas a
las condiciones del invernadero en un tiempo de 15 a 20 das aproximadamente
(Roca et al,1991).(Fig 36).
23.3. Factores que influyen en la Micropropagacin
El buen resultado en los sistemas de Micropropagacin depende de diferentes
factores, como los mencionados a continuacin:
Planta que dona el explante.
El estado en el cual se encuentra la planta donante es determinante a la hora de
su desarrollo e influye en su capacidad morfogentica, los requerimientos de cada
planta varia de acuerdo a la edad y sta a su vez influye a la morfognesis, entre
mas joven sea la planta se garantiza que el tejido este menos diferenciado y la
respuesta ser mejor en el cultivo. La posicin de las yemas es otro factor
importante, es as como yemas extradas de la porcin media del tallo se
desarrollan mas rpido que las obtenidas de la base como es el caso de las rosas,
pero en otras ocasiones como en el cultivo in Vitro de plantas de esprrago
solamente ha sido posible la produccin del cultivo con yemas apicales
El Explante:
Es una parte de tejido u rgano que se asla del resto de la planta con fines de
cultivo, pero en la seleccin de este tejido se tiene en cuenta cmo se propaga
cada planta. Dependiendo del tipo de plantas (confieras, maderables, etc.) que se
van a micropropagar, las fuentes de explantes varan, es as como el tipo de
reproduccin tambin juega un papel importante a la hora de la seleccin,
ejemplo: En la reproduccin por semilla: se toman zonas embrionales o de la
plntula y se desinfecta las semillas para su germinacin en condiciones
aspticas. En la reproduccin vegetativa: Se utilizan brotes jvenes y los pices
meristemticos.

El tamao del explante no afecta mucho, salvo si lo que se pretende es obtener

plantas sin virus, ya que los meristemas tienen una probabilidad alta de diferenciar
plantas libres de patgenos.
Fig.36. Esquema de los pasos de la Micropropagacin. Fuente

ttp://www.biologia.org/revista/fotos/numero7/micropropagacion
Factores fsicos:
Son determinantes en la Micropropagacin, as como la luz y la temperatura, en el
caso de la temperatura es sta la que controla la incubacin para la propagacin;
la luz es esencial en la morfognesis e involucra varios componentes como la
intensidad, el fotoperiodo y la calidad, y a pesar de ser tan importantes sus
estudios son escasos.
Medio de cultivo:
El xito del cultivo de tejidos depende en gran medida de la seleccin del medio
del cultivo por lo que su composicin qumica y forma fsica es diferente de
acuerdo al tejido que se use.
23.4. Micropropagacin de Especies Herbceas
La Micropropagacin de especies herbceas esta basada en diferentes procesos
morfogenticos como los siguientes:
a. Estmulo de yemas axilares: El desarrollo de yemas axilares es incitado
por las condiciones in Vitro que facilitan la formacin de una planta por cada
yema, la eficiencia esta determinada por el nmero de yemas axilares

preexistentes en el inoculo, el sistema muestra gran estabilidad gentica en

individuos regenerados.
b. Diferenciacin de brotes adventicios: Permite la formacin de estructuras
unipolares nuevas y as una mayor regeneracin de brotes que en el
sistema de yemas axilares, la variabilidad fenotpica en clones
diferenciados esta dado por la formacin del tejido meristemtico y posterior
diferenciacin de pices.
c. Embriognesis somtica: En condiciones in Vitro, es factible diferenciar
embriones a partir de clulas tanto del esporofito como del gametofito.
Aparentemente, los factores qumicos ms importantes para la
embriognesis somtica son las auxinas exgenas, la fuente y la
concentracin de nitrgeno y algunas otras sustancias como la sacarosa.
Desde el punto de vista de la propagacin, la embriognesis somtica es el
sistema ms eficiente, considerando la eficiencia como el nmero de
plantas regeneradas por unidad de tiempo (Roca et al,1991).(Fig 37)
Fig.37. Micropropagacin de especies herbceas de C.japonica. Fuente

http://www.scielo.sa.cr/img/fbpe/rbt/v51n3-4/2911i7.JPG
2.5. Micropropagacin de Especies Leosas
Dentro de las especies leosas ms estudiadas estn las forestales y las
conferas; la propagacin vegetativa ha tenido un papel importante en la
multiplicacin de rboles lite; sin embargo, se ha observado que las estacas
pierden la capacidad para enraizar a medida que el rbol de origen es ms viejo.
Por otro lado, es necesario que los rboles usados como patrones sean los
suficientemente maduros para que expresen su potencial gentico, sin embargo,
al emplear ramas maduras para el enraizamiento se pueden presentar problemas
de crecimiento lateral o plagiotrpico (Swett, 1973).
Las tcnicas de micropropagacin han demostrado ser una importante alternativa
para la solucin de algunos problemas anteriores. El mtodo de diferenciacin de

brotes adventicios es ms comn que la embriognesis somtica y tienen mayor

potencialidad para una propagacin masiva que el estmulo de las yemas axilares.
La primera especie leosa regenerada mediante cultivo fue Populus tremuloides
(triploide) a partir de callos, a partir de embriones fue Pinus palustris gracias a
estos estudios se han regenerado diversas especies de leosas. Diversos
componentes como los explantes, el tipo de brotes y el medio han permitido un
cultivo exitoso.
Los brotes adventicios se pueden producir a partir del explante directamente, o a
partir de callos; para fines de propagacin se ha demostrado que es mejor
producirlos directamente del explante para evitar anormalidades. Adicionalmente
la edad del explante es un factor crtico en las especies maderables, en general la
micropropagacin es ms fcil empleando explantes juveniles. Para una efectiva
micropropagacin los componentes de los medios de cultivo cumplen un papel
importante donde las fuentes de carbono, los macro y microelementos, las
vitaminas, el nitrgeno entre otros son parte de una efectiva propagacin.
Entre los reguladores del crecimiento est la cinetina y las auxinas en bajas
concentraciones.
Los problemas ms serios encontrados en la propagacin de especies arbreas in
Vitro son la variaciones genticas en las respuestas de regeneracin y el proceso
de maduracin; estos dos problemas dificultan considerablemente la ejecucin de
sistemas prcticos de propagacin de fenotipos seleccionados (Roca et al,1991).
Leccin Veinticuatro: Cultivo de Protoplastos
El trmino protoplastos se refiere a los componentes vivos de las clulas vegetales
que estn rodeados slo por la membrana plasmtica; constituyen las clulas
desnudas de una planta. Muchos protoplastos pueden resintetizar la pared celular,
dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas.
Debido a la ausencia de la pared celular, los protoplastos son adecuados para
diversas y diferentes manipulaciones genticas que no seran posibles con plantas
o clulas intactas. Los protoplastos sirven adems como herramientas
experimentales nicas para muchas investigaciones fisiolgicas, biofsicas y
bioqumicas. .(Fig 38)

Fig.38. Cultivo de protoplastos en suspensin de la raz de la remolacha.

Fuente. http://www.spicom.es/chloropage
24.1 Aislamiento de Protoplastos
Aunque existe un mtodo mecnico para aislar protoplastos, el mtodo enzimtico
es actualmente la forma ms importante y efectiva para ese propsito. El mtodo
enzimtico para el aislamiento de los protoplastos consiste en incubar las clulas
en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. Los principales factores
que se deben considerar para el xito de este mtodo son: el tipo de enzimas, la
composicin del medio y el material de origen de los protoplastos.
En teora, es posible aislar protoplastos de cualquier tipo de planta, rgano o
tejido, pero las fuentes que se usan corrientemente son mesfilo foliar y tejidos
cultivados in Vitro como clulas en suspensin, callos y pices de plntulas
generadas in Vitro. El mesfilo es una fuente adecuada de protoplastos; en
general se usan hojas completamente abiertas de plantas jvenes o brotes
nuevos. Los protoplastos tambin se aslan de suspensiones celulares; en cambio,
los callos cultivados en agar no funcionan bien para este propsito (Roca et al,
1991).
24.2 Caractersticas de los Protoplastos aislados
Las poblaciones de protoplastos recin aislados reflejan las propiedades
morfolgicas y fisiolgicas de las clulas de las cuales se derivan y representan
por tanto un material til para los experimentos bioqumicos y fisiolgicos.
Los protoplastos aislados del mesfilo (Fig. 39) contienen cloroplastos verdes y en
la luz muestran actividad fotosinttica; los protoplastos de las suspensiones
celulares contienen muchas veces almidn (Fig. 39b), su tamao y su actividad
metablica se asemejan a las del ciclo de crecimiento de la suspensin. Los
protoplastos aislados de la aleurona de las semillas de avena secretan amilasa y
arnasas en presencia de cido giberlico, los protoplastos de los ndulos de
races de las leguminosas pueden reducir el acetileno en ciertas circunstancias.
Dado que los tejidos de la planta constan generalmente de diferentes tipos de
clulas, las poblaciones de protoplastos aislados conservan la heterogeneidad del
tejido original; estas poblaciones mixtas de protoplastos se pueden reagrupar, por
centrifugacin, en gradientes iso-osmticos de densidad y no por una clasificacin
de flujo y citometra
En comparacin con lo que ocurre en los tejidos intactos, es relativamente ms
fcil aislar y purificar orgnulos celulares en los protoplastos mediante un proceso
que incluye mtodos granulares para que estos conserven su integridad
estructural y funcional. As, los protoplastos del mesfilo constituyen una fuente
adecuada para el aislamiento de cloroplastos. Tambin se pueden aislar vacuolas
de diferentes clulas, adems se han aislado la membrana plasmtica de
diferentes fuentes de protoplastos radicales o foliares.

Fig 39. Caractersticas de los protoplastos. a. protoplastos aislados de

suspensiones celulares, b. protoplastos aislados del mesfilo Fuente.
http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro/12_III_2.pdf
Los protoplastos de suspensiones celulares se pueden utilizar para el aislamiento
de ncleos celulares, cromosomas mitticos y meiticos (Roca et al,1991).
Una de las aplicaciones de la tcnica de aislamiento de protoplastos es el cultivo
de los mismos hasta obtener la regeneracin de las plantas, el xito en el cultivo
de los protoplastos depende de factores como: el tipo y edad del material de
origen de los protoplastos, el sistema de cultivo y la densidad de los protoplastos
contenidos en ste y la composicin del medio.
Se ha recalcado la importancia que para el cultivo de protoplastos tiene el carcter
juvenil del tejido original; los protoplastos obtenidos por las regiones apicales de
las plantas y los vstagos originados por cultivo de tejidos tienen mejores
resultados que los obtenidos del mesfilo, ya que en las clulas juveniles es ms
fcil manejar el mantenimiento de la actividad mittica que en las clulas
altamente especializadas (Roca et al,1991).
En cuanto a los protoplastos obtenidos de suspensiones celulares, el xito
depende de la calidad de suspensin utilizada; los protoplastos de suspensiones
celulares que estn en crecimiento logartmico comienzan a dividirse muy
rpidamente, mientras que los derivados de suspensiones ms viejas regeneran la
pared y se dividen con menos frecuencia. En varios experimentos se ha
encontrado que la densidad de la poblacin celular afecta sobremanera la divisin
de las clulas derivadas de protoplastos, las densidades mximas de divisin se
han obtenido con densidades de 104 a 105 protoplastos/ml.

Otro punto importante en la produccin de protoplastos son los sistemas de

cultivo; para inducir la divisin de estos por aislamiento y la formacin de sus
colonias, se han desarrollado diferentes sistemas. Generalmente, los protoplastos
se cultivan en cajas de petri en un medio lquido o semislido de agar o agarosa.
Para obtener una alta frecuencia de divisin celular y lograr un crecimiento rpido
de las clulas y las colonias derivadas de los protoplastos es necesaria la adicin
gradual de medio fresco con niveles reducidos de estabilizadores osmticos o las
transferencias a medios frescos (Roca et al,1991).
24.3. Regeneracin de las plantas
Una vez logrado un ritmo sostenido de divisin celular, las colonias desarrolladas
se pueden transferir a un medio que conduzca a la generacin de plantas. En
muchas especies, la iniciacin de los brotes requiere el uso de las citocininas y la
regeneracin de la planta se da por la diferenciacin separada de la raz y del
brote.
Si se utilizan protoplastos de cultivos celulares formadores de embriones, las
clulas recin formadas pueden producirlos directamente por embriognesis
somtica. Para la utilizacin de la tecnologa de los protoplastos en las
manipulaciones genticas, la alta frecuencia en la regeneracin de las plantas es
un prerrequisito. La papa es la nica especie importante que se ha podido obtener
por cultivo de protoplastos, y en ella la eficiencia de la regeneracin ha alcanzado
un nivel alto que la tecnologa de los protoplastos ha sido utilizada en los
programas de fitomejoramiento de la especie (Bokelman et,al 1983)
Leccin Veinticinco: Ingeniera Gentica y cultivo de tejidos
En las ltimas dcadas, el mejoramiento tradicional de las plantas, combinado con
las prcticas agrcolas perfeccionadas y enriquecido con las tecnologas
modernas, ha incrementado la produccin agrcola destinada a la alimentacin
humana y animal. La ingeniera gentica ofrece, por medio de la biotecnologa
agrcola, nuevos elementos de anlisis a nivel de las molculas, las clulas y los
tejidos para comprender mejor las caractersticas agronmicas de las plantas y
por consiguiente, poder manipularlas.
Como se explico en captulos anteriores la tecnologa del ADN recombinante se
utiliza para modificar ciertos caracteres unignicos como la resistencia vegetal a
virus e insectos, el incremento de la calidad nutricional de las plantas mediante la
insercin de protenas que son ricas en aminocidos esenciales y que puede ser
codificada por un solo gen.
El cultivo de tejidos vegetales in Vitro como se ha explicado en apartes anteriores,
se ha convertido en el eje sobre el cual giran nuevas tecnologas del mejoramiento
gentico de las plantas y un mejor conocimiento de los procesos genticos y
fisiolgicos de estas.

25.1. Transformacin gentica en los vegetales

Existen dos sistemas para introducir genes en el genoma de la transferencia
directa y la transferencia mediada por bacterias del gnero Agrobacterium. El
primero consiste en la introduccin directa de los genes empleando tcnicas como
la microinyeccin; el segundo utiliza las propiedades biolgicas de la bacteria del
suelo Agrobacterium sp para introducir el ADN forneo.
La introduccin directa de molculas de ADN exgenas ha hecho posible la
transformacin de protoplastos. Sin embargo, existe una gran limitante, se deben
establecer sistemas de obtencin de protoplastos y de regeneracin de plantas a
partir de ellos. Como solucin a esta limitante, se desarroll la inyeccin directa de
molculas de ADN en los retoos florales y la llamada agroinoculacin, tambin se
han desarrollado sistemas de microinyeccin de ADN en embriones, ya que se
pueden regenerar plantas a partir de ellos (Roca et al,1991).
En la soya se han empleado sistemas de introduccin de molculas de ADN ms
novedosos, como la utilizacin de microproyectiles a alta velocidad como
transportadores de ADN; las molculas atrapadas dentro de partculas de oro, son
disparadas a la clula mediante un acelerador de partculas.
Para la introduccin de genes mediados por Agrobacterium tumefaciens es
importante conocer las caractersticas de esta bacteria. A. tumefaciens es una
bacteria del suelo gram-negativa que causa la enfermedad llamada agalla de la
corona en la mayora de las dicotiledneas y algunas monocotiledneas; sta
infecta la planta en el sitio de una herida. Las clulas de la corona se caracterizan
por producir sustancias denominadas opinas que no estn presentes en las
clulas normales y adems tienen la capacidad de proliferar indefinidamente en un
medio de cultivo sin necesidad de hormonas de crecimiento.
Las opinas son derivados de intermediarios comunes en las rutas metablicas, la
bacteria que infecta la planta usa estos compuestos como fuente de energa, de
carbono y de nitrgeno. La transformacin de las clulas de la planta despus de
ser infectadas con Agrobacterium se debe a un plsmido de elevado peso
molecular denominado plasmido-Ti que es transportado por esa bacteria; parte de
ese plsmido ser transferido al genoma de la planta el cual se expresar ms
tarde.
Para la integracin del ADN-T en el genoma de la planta es indispensable, primero
que todo, una secuencia de 25 pares de bases (bp) de repeticin directa que se
encuentra a ambos lados de la regin-T. El segundo componente indispensable
para esa integracin de la regin-T son los denominados genes vir. Estos genes
no son transferidos al genoma de la planta, sino que actan en trans sobre la
regin-T para promover la transferencia.
El ADN-T est conformado por dos grupos de genes: un grupo responsable de la
morfologa del tumor y otro responsable de su crecimiento sin necesidad de
hormonas. Esta clase de parasitismo de Agrobacterium en las plantas, permite
que esta bacteria se adapte a las propiedades de las plantas, adems cambia las

propiedades genticas del husped lo que se denomina colonizacin gentica

(Roca et al, 1991).
Los conocimientos de la tecnologa del ADN recombinante permiten modificar los
plsmidos-Ti para convertirlos en convenientes y eficaces vectores de genes en
las plantas. Para la transferencia de la regin-T, lo nico indispensable son las
secuencias en los bordes de esa regin y por lo tanto los genes vir, esto quiere
decir que la parte oncognica es escindida y por lo tanto las clulas obtenidas de
la infeccin con el plsmido mantendrn su capacidad regenerativa; sin embargo
es necesario desarrollar mtodos para remplazar los genes de la regin-T, si se
quiere utilizar el plsmido Ti como vector. Los explantes vegetales utilizados para
la transformacin mediada por esta bacteria han sido muy variados, como
protoplastos, discos de hojas, embriones somticos y meristemas apicales.
25.2. Aplicaciones de la Biotecnologa Vegetal
Varias estrategias se aplican en biotecnologa para obtener plantas tolerantes a
virus, patgenos e insectos, resistentes a los herbicidas y adquirir una mayor
calidad nutricional.
La introduccin de genes dentro de las plantas es una tcnica muy promisoria
para lograr plantas tolerantes a infecciones virales. El trmino Proteccin cruzada
ha sido utilizado para identificar la proteccin obtenida por una planta despus de
su inoculacin con una cepa benigna de un virus, que la protegera de la infeccin
causada por una cepa virulenta del mismo virus, es posible conferir tolerancia a
los virus utilizando mtodos que regulen la expresin de la ARN viral, una vez se
halle ste dentro de la clula.
Hay dos estrategias prometedoras para inducir en las plantas resistencia a los
insectos: La resistencia conferida por la toxina de la bacteria Bacillus thuringiensis
y la accin de los inhibidores de proteasas inducidos por heridas causadas en la
planta. La bacteria B. thuringiensis produce un polipptido activo el cual es txico
para muchas especies de insectos; las plantas regeneradas produjeron suficiente
toxina para asegurar la proteccin contra el ataque de los insectos (Roca et
al,1991).
Aunque las plantas tienen contenidos de los aminocidos esenciales menores que
en los animales, una estrategia para corregir estos defectos es la sntesis de
genes que codifiquen para protenas homopolimricas( que contengan un solo tipo
de aminocidos) o para protenas conformadas por la repeticin de 2 o 3
aminocidos esenciales; se han sintetizado y clonado los genes (Sp44,Sp47) que
codifican para los polipptidos poseedores de un alto contenido de los
aminocidos esenciales ms limitantes de una dieta a base de cereales y
tubrculos.
Parece evidente, por lo expuesto en esta parte del captulo que las tcnicas de la
manipulacin gentica son importantes en el contexto general de la agricultura
moderna; la biotecnologa agrcola se encargar de conectar reas bsicas de la

biologa molecular y la biologa celular con las prcticas agrcolas tradicionales;

esta labor de conjunto producir las nuevas variedades de plantas que se
cultivarn en los prximos aos.

CAPITULO 6: Principios bsicos en Biotecnologa Animal
INTRODUCCION
El mejoramiento gentico de especies econmicamente importantes aport
conocimientos significativos acerca de la biologa durante milenios. Hasta hace
poco, el entrecruzamiento de especmenes fue el nico mecanismo de
mejoramiento gentico. Sin embargo desde el desarrollo de las tcnicas de ADN
recombinante esto cambi radicalmente, ya que genes independientes e incluso
genes pertenecientes a otras especies lejanas en la escala evolutiva, pueden ser
especficamente integrados a la constitucin gentica de organismos completos.
La transferencia de genes es ahora una herramienta rutinaria para el estudio de la
regulacin gnica y desarrollo celular, pero tambin se ha utilizado para lograr el
mejoramiento de especies e incluso para la produccin de protenas heterlogas.
Leccin Veintisis: Ingeniera gentica en animales
Algunos de los animales ms utilizados como sistemas modelos para la
manipulacin de ADN son el nematodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la
fruta Drosophila melanogaster y los ratones. Muchas de las diferentes tcnicas
explicadas en los captulos 2 y 3 pueden ser aplicadas en estos animales.
Existen diferentes vas de producir animales transgnicos. Un ejemplo es la
produccin de Drosophila transgnica por medio de la inyeccin de plsmidos
vectores que contienen el elemento P dentro de los huevos de la mosca. La
Drosophila transgnica puede proveer otro uso del gen bacteriano LacZ como gen
reportero de la regulacin gnica en el desarrollo. En este caso el gen LacZ es
fusionado a la regin promotora de un gen de Shock-trmico (genes sensibles a
cambios de temperatura) los cuales son activados en temperaturas altas. Este
constructo es luego utilizado para generar moscas transgnicas. Despus las
moscas son sacrificadas y baadas en un medio con X-Gal. Los patrones azules
en los tejidos son el resultado de la posicin de los genes de shock trmico con
mayor accin.
Otra aplicacin para la produccin de mamferos transgnicos es la inyeccin
especial de plsmidos vectores dentro del huevo fertilizado.
En ambos casos, debido a que el huevo es formado inicialmente transgnico, el
ADN extra que puede hallarse dentro de lneas celulares germinales, es luego
pasado a la progenie derivada de estas clulas y se comporta como un gen
nuclear regular. Como en las plantas, los animales son manipulados no solamente
para mejorar la calidad del mismo sino tambin para ser productores convenientes
de protenas forneas; por ejemplo, la leche de los mamferos es fcilmente
extrada por lo tanto es un medio conveniente para la produccin de protenas que
seran difciles de obtener sin el sacrificio del animal.

Un ejemplo de este tipo es la produccin de protenas farmacolgicamente

importantes en la leche de oveja. Donde uno de los genes de inters que
codifican para esta protena es el activador del plasmingeno de tejido, utilizado
para disolver cogulos de sangre en humanos. Los genes son colocados bajo el
control del promotor de la -lactoglobulina, el cual es activo slo en tejidos
mamarios y es introducido dentro del vulo de la oveja por microinyeccin de
vectores de expresin dentro del ncleo. El vulo inyectado es implantados dentro
de madres putativas y la progenie que expresa el transgen son identificadas por
amplificacin por PCR del ADN utilizando primers de la secuencia del gen de
inters. Las ovejas transgnicas expresan este gen solo en las glndulas
mamarias y secretan niveles altos de la protena del gen insertado en la leche, de
la cual esta protena puede ser purificada (Grifftihs 2000.) (Fig 40).
Leccin Veintisiete: Rompimiento de genes y remplazo gnico en ratones
Los ratones son los modelos ms importantes de mamferos, ya que mucha de la
tecnologa desarrollada en ellos puede ser aplicada en los humanos.
Dos tcnicas son capaces de romper los genes (generalmente para un estudio de
gentica reversa) y para remplazar un alelo por otro. Para eso existen diferentes
ejemplos de stas.
Las rupturas de los genes son algunas veces llamadas Knockouts. Un organismo
portador de genes knockout puede ser examinado por sus fenotipos alterados. Por
lo general los ratones Knockout son modelos invaluables para estudiar mutaciones
que se pueden encontrar en humanos o en otros animales; por ejemplo los
ratones knockout que han perdido las enzimas de reparacin de ADN vitales han
sido creados para el estudio de estas enzimas en las tasas de control de cncer.
Inicialmente se debe producir las clulas que contienen una mutacin del gen
especfico conocido como mutacin blanco o gen Knockout. En primer lugar las
copias del gen clonado son alteradas in Vitro para producir el vector blanco, por
ejemplo la inactivacin por insercin del gen neo dentro de una regin codificante
de protenas, en este caso el gen neo servir como marcador para indicar que el
vector se insert dentro del cromosoma. Este vector tiene un segundo marcador
en la zona terminal, por ejemplo el gen del herpes tk. Estos son ejemplos de
algunos marcadores estndar pero pueden ser utilizados cualquiera que sea de su
inters
Una vez el vector es complotado con estos marcadores, ste es introducido en las
clulas aisladas del embrin del ratn; cuando la recombinacin homloga ocurre,
aquellas regiones del vector junto con cualquier ADN entre ellos toma el lugar del
gen original excluyendo el marcador en la terminacin del vector. En algunos
casos la recombinacin no es tan exacta y puede darse la insercin en sitios al
azar en el cromosoma o no integrarse a el.

Fig 40. Produccin de protenas importantes de humanos en glndulas

mamarias de oveja. Protena GOI permite disolver coagulos de sangre en
humanos. Fuente Grifftihs 2000.

Para aislar las clulas que contienen la mutacin todas las clulas son puestas en
un medio de cultivo que contienen drogas selectivas (por ejemplo una anloga a la
neomicina). Si las clulas no tienen el vector insertado correctamente las clulas
son intoxicadas con la droga y solo sobreviven aquellas que tengan el gen (neo
en este caso) y otra droga como los anlogos a Ganciclovir (es un componente
activo para los herpes y citomegalovirus) eliminar toda clula que porte el gen del
herpes (tk). Por lo tanto las clulas escogidas son aquellas que sobreviven a los
dos tratamientos con drogas.
26.1. Produccin de ratones knockout portadores de la mutacin blanco.
Para la produccin de los ratones knockout las clulas embrionarias (ES) son
aisladas de una cepa de ratn agouti (coloracin silvestre), portador del gen
blanco para la mutacin en un cromosoma. Las clulas ES son luego insertadas
dentro de embriones jvenes. El color del pelaje en los futuros ratones es la gua
para determinar si las clulas ES insertadas han sobrevivido en el embrin, en la
ausencia de las clulas de las ES los ratones pueden adquirir una coloracin
negra total en su pelaje. Cada embrin es obtenido a partir de ratones negros que
perdieron el alelo dominante para el color silvestre. Una vez los embriones son
alterados, se colocan dentro de una madre sustituta. Los descendientes con
coloracin mezclada de agouti y negro indican que las clulas ES insertadas han
sobrevivido y proliferado en el animal; este tipo de ratones son denominados
Quimeras debido a que ellos contienen clulas derivadas de dos cepas diferentes
de ratones.
Para reconocer el gen mutado en los animales, los ratones quimeras son cruzados
con un ratn no agouti. La progenie es tipificada por la evidencia de la mutacin
del gen blanco de inters. A partir de la evaluacin directa de los genes en los
ratones agouti revelan aquellos descendientes que han heredado la mutacin.
Despus estos animales son escogidos y cruzados entre ellos para producir
animales totalmente Knockout (tener los genes bloqueados) y por lo tanto perder
la funcionalidad del gen (Grifftihs 2000.).
La tecnologa para los genes Knockout de mamferos es similar cuando se
necesita remplazar los genes. E la terapia gnica un alelo mutante es remplazado
por el alelo de tipo silvestre presentando la expresin de ese gen (Fig 41).

Fig
41.
Generacin
de
animales
http://141.217.91.198/genereplacement.GIF
Knockout
Fuente
Leccin Veintiocho: Terapia gnica en animales

El enfoque general de la terapia gnica no es ms que una extensin de la tcnica
de clonacin selectiva por complementacin funcional. Las funciones ausentes del
receptor generadas por su gen defectuoso son introducidas mediante un vector
que se inserta dentro de un cromosoma del receptor y por lo tanto genera
animales transgnicos genticamente curados, esta tcnica es de gran potencial
ya que ofrece la esperanza de corregir enfermedades hereditarias.
El primer ejemplo de la terapia gnica en mamferos fue la correccin de la
hormona del crecimiento en ratones. La mutacin recesiva little (lit) presenta
fenotipos enanos, an cuando el gen este presente y aparentemente normal, no
se produce transcripcin del ARNm del gen. El primer paso en la correccin de la
deficiencia fue la inyeccin en vulos homocigotos lit/lit con aproximadamente
5000 copias de un fragmento lineal de ADN que contena el gen estructural de la
hormona de crecimiento de rata (RGH) fusionado a una secuencia promotora
reguladora del gen de la metalotionina de ratn. El trabajo normal de la
metalotionina es la desintoxicacin de metales pesados, por lo tanto la secuencia
reguladora es la responsable de determinar la presencia de metales pesados en
los animales.

Los vulos son implantados en ratones pseudos-embarazados y los ratones bebes

son criados, cerca del 1% de los ratones bebes llegan a ser transgnicos
mostrando un incremento en el tamao cuando se le administran metales pesados
en el transcurso de su desarrollo.
Tecnologas similares han sido utilizadas para desarrollar cepas de crecimiento
rpido de salmones, con excelentes resultados. En este caso un plsmido que
contiene el gen de la hormona de crecimiento situado cerca del promotor de la
metalotionina derivado del salmn son microinyectados en los huevos. Una
pequea proporcin del resultado llegan a ser peces transgnicos, los cuales son
probados como positivos cuando su ADN tiene insertado el plsmido; estos peces
son en promedio 11 veces ms grandes que los silvestres (fig 42).
Fig 42. Efectos de la transgensis en salmones. Fuente Grifftihs 2000

Leccin Veintinueve: Aplicaciones de la Biotecnologa en la produccin
animal
La clonacin gnica y la transferencia de tecnologa han generado nuevos
mtodos para alterar los genomas de ganados que mejoren la calidad de los
productos animales. Estas tcnicas permiten el mejoramiento gentico como
complemento de la crianza selectiva convencional. Las especies domesticas son
actualmente importantes en las investigacin biolgica y la aplicacin tecnolgica
porque estas tienen diversos productos de valor comercial y adems algunas un
periodo corto de gestacin. Las alteraciones biotecnolgicas pueden generar un
significativo impacto en la calidad de la carne cambiando los valores nutricionales,
tambin se han producido ganados transgnicos que expresan una protena
heterloga (protena activadora del plasmingeno) con grandes efectos
farmacuticos.

No solo los animales importantes en el sector agrario han sido utilizados para el
mejoramiento sino que gracias a la biotecnologa nuevas especies comerciales
han sido involucradas en la tecnologa del ADN recombinante. Tal es el caso de
las cabras, a las cuales se ha manipulado por medio de transferencia de genes,
animales con diferencias en el pelaje dando como resultado una cabra con piel de
oveja, donde la suavidad de la lana esta determinada por los genes de la oveja
introducidos en la cabra, pero la cabra genera mayor resistencia a condiciones
extremas asegurando la produccin de piel (Amoah et al 1997).
Se han establecido nuevos desafos que implican el control de la maduracin
reproductiva, la fertilidad, el control del sexo gentico y la proporcin de las
progenies en diferentes especies, de las cuales la biotecnologa puede contribuir a
incrementar la capacidad productiva.
En estudios en peces comerciales se han analizado las diversas contribuciones de
la biotecnologa en la naturaleza fisiolgica y/o gentica donde sta tiene una
amplia aplicacin industrial y sobretodo en acuicultura, siendo esperable que en el
futuro se consolide la aplicacin de estas estrategias tecnolgicas en la mayora
de las especies comerciales, en tanto se desarrolle la investigacin y la
transferencia tecnolgica de estos resultados (Daz et al, 2005).
Leccin Treinta: Biorremediacin
La agricultura intensiva es una de las actividades humanas que tienen mayor
repercusin en la contaminacin del suelo por metales pesados, debido al empleo
de fertilizantes y plaguicidas de forma prolongada. Los fertilizantes fosforados
pueden contener Zn, As, Cd y Pb debido a su presencia en la roca fosfrica. El
uso de ciertos plaguicidas han contribuido a aumentar los niveles de As, Pb, Hg,
Cu, algunos poseen concentraciones de Zn que pueden superar el 25 %.
Los metales pesados tambin pueden estar presentes en estircoles de animales
(Zn y Cu) debido al uso de ciertos compuestos a base de dichos elementos en la
dieta del animal para evitar ciertas enfermedades. De especial relevancia es el Cu
en el purn de cerdo que limita su utilizacin.
Tambin se encuentran presentes en productos desinfectantes utilizados en las
instalaciones, y pueden proceder de la maquinaria agrcola utilizada. La
recuperacin de suelos contaminados con metales pesados permanece como uno
de los problemas ms difciles de las tecnologas de descontaminacin. La
restauracin ambiental se puede llevar a cabo por diversas estrategias que
suponen eliminar los contaminantes o estabilizarlos en el suelo. Las tcnicas ms
drsticas se basan en procesos fsicos o fsico-qumicos, como la extraccin fsicoqumica de metales por lixiviacin cida y electro-smosis, o la inmovilizacin in
situ, ej. Vitrificacin, o, en caso de contaminacin superficial, la eliminacin de la
capa superficial del suelo contaminado.

Estos mtodos son muy drsticos, costosos, precisan de equipos y personal

especializado, y slo son adecuados para la descontaminacin de reas
pequeas. Dentro de las nuevas tecnologas biolgicas, destacan las tcnicas de
recuperacin in situ o biorrecuperacin (biorremediacin) que consisten en el
uso de microorganismos y/o plantas para descontaminar un ambiente degradado o
contaminado. Las diferentes estrategias tratan de estimular la actividad de los
microorganismos del suelo, inocular la tierra con microorganismos especficos,
aplicar enzimas, y utilizar plantas para extraer, retener o transformar los
contaminantes.
En este punto, hay que distinguir la fito-recuperacin como el uso de plantas,
enmiendas del suelo y tcnicas agronmicas para eliminar, retener, o disminuir la
toxicidad de los contaminantes del suelo. Los compuestos orgnicos exudados por
las races de las plantas activan los procesos qumicos y biolgicos del suelo,
recuperando la actividad microbiana., y adems el establecimiento de una cubierta
vegetal evita que se produzcan una mayor degradacin del suelo por aceleracin
de los procesos de erosin.

Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD DOS
Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los

contenidos vistos y desarrollados en esta segunda Unidad Didctica; as
como el trabajo y desempeo realizado tanto por el tutor director, como el
desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera
individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente
ejercicio de autoevaluacin, el cual consta de los siguientes tems; los
cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de
aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos
relacionados con actividades evaluativas que sern desarrolladas en otros
cursos relacionados con este. Los tems a tener en cuenta son:
1) Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera
cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo,
entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y
colaborativo en el desarrollo de esta unidad.
2) Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo
colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el
grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos
fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos
justificando su apreciacin
3) Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y
justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no
satisfactorio o supera lo esperado.
4) Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor
respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atencin al
estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

Fuentes Documentales de la Unidad 2
Amoah E.A. & Gelaye S. Biotechnological Advances in Goat Reproduction. J.

Anim. Sci. 75:578585.1997
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Klug Willam S. Cummings Michael R. Conceptos de Gentica. 5 edicin.

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South
Carolina

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INDICE DE TABLAS ................................................

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Leccin Siete: Generacin de ADN recombinante .................................. 33

Leccin Ocho: Molculas portadoras o Vectores .................................... 34

3.1. Tipo de Vectores ..................................................................................... 35

Leccin Diez: Manipulacin del ADN ...................................................... 39

CAPITULO 3. Marcadores Moleculares ................................................................ 42

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1.2. Medios de Cultivo .................................................................................... 65

Leccin Ventisiete: Rompimiento de genes y remplazo gnico en ratones

2.1. Produccin de ratones knockout portadores de la mutacin blanco. ..... 84

Leccin Ventinueve: Aplicaciones de la Biotecnologa en la produccin

Leccin Treinta: Biorremediacin ............................................................ 87

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Tabla 1. ARN polimerasas en eucariotes .............................................................. 23

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didctico del curso acadmico: Biotecnologa I, fue diseado

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Colombia cuenta con una buena capacidad en el desarrollo y aplicacin de la

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relacionar los conceptos de biotecnologa, en el rea agraria, para la mejor manipulacin

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Bases de biologa molecular

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Propsito: Generar en el estudiante la

Metas: El estudiante se apropiara del

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Marcadores moleculares utilizados en

El curso de Biotecnologa I, aportara al

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Propsito: Generar en el estudiante la

Metas: El estudiante se apropiara del

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UNIDAD 1: BASES DE BIOLOGIA MOLECULAR

Estas bases nitrogenadas son compuestos heterocclicos con los anillos

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deteccin de molculas especficas de ADN dentro de numerosas y diferentes

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Fig.1. Experimento de Meselson y Stahl, permite la comprobacin del tipod e

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2.6. Sntesis de las cadenas Lder y Retrasada

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Las dos polimerasas se unen en la horquilla de replicacin con un dmero de la

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Fig.2. Complejo de la cadena tarda para formar los fragmentos de Okasaki

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El resultado del proceso de transcripcin es la sntesis de una molcula de ARN

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encontrado dos secuencias consenso de ADN; una conocida como la regin-10 o

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Fig 4. Reparacin de un fotodmero de pirirmidinas inducidos por luz UV

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a. Reparacin mediante la nucleasa AP: Cada clula tiene un sistema de