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Procedimiento del Anlisis del Mtodo de NBT (Tetrazolium Nitro Blue).

v
Sacrificar la rata para extraer su timo.
Centrifugar a 15000rpm, durante 1 minuto.
Incubar en medio RPMI a 37 C por 1, 3 y 6 horas.
600uL medio RPMI 1640.
100uL de 10x106 clulas.
100uL de Pb2+ 0,38uM.
100uL de extracto de planta.
100uL de NBT 1mg/mL.
* La reaccin debe ser en la oscuridad.
Se centrifuga a 15000rpm por 5 minutos.
Se lava con 500uL de metanol 70%.
Se centrifuga a 15000rpm por 5 minutos.
Se centrifuga
disuelve con
200uL KOH
200uL (CH3)2SO 1% y
Se
a 15000rpm
por 1M,
5 minutos.
600uL de agua.
Se cuantifica por espectrofotometra a 570 nm

El O2- reduce a la sal de NBT formando un precipitado morado

y a mayor concentracin de O2- mayor precipitado. Mtodo descrito


por PICK (E. Pick, 1986). Macrfagos (1x106 cel/pozo) las que son
incubadas en placas de cultivo celular.

La superxido dismutasa, enzima que convierte dos O2- en un O2 y


un H2O2.
Existen otros radicales libres como el hidrxilo (el ms peligroso de
ellos y se forma a partir de H2O2 con la presencia de Fe).
Esto puede ser fatal por diversas causas: mutaciones en el ADN, inactivacin de
enzimas y destruccin de las membranas celulares (peroxidacin lipdica). Por eso
existen una serie de enzimas protectoras o antioxidantes catalticos. Adems de varias
superxido dismutasas con estructuras muy diferentes, se han descubierto la catalasa y
la gluthation peroxidasa, las cuales tienen como funcin convertir el perxido de
hidrogeno en oxgeno y agua, previniendo as la formacin del radical hidrxilo.
Minerales y metales de transicin como el selenio, el cobre, el zinc, el manganeso e
incluso el hierro, son indispensables para el funcionamiento de las enzimas
antioxidantes. Existen adems molculas relativamente sencillas de apoyo, como son las
vitaminas C y E, la melatonina y diversas flavonoides.
Acciones "benficas" de los radicales libres

Las mutaciones del ADN, si pueden ser fatales para un organismo en particular, son
tambin las que explican la diversidad de especies que habitan este planeta. Aunque
slo una diminuta parte de las nuevas especies generadas por mutaciones sobreviven a
la seleccin natural, no dejan de ser estas mutaciones la causa de la evolucin. Si los
errores de replicacin del ADN, la radioactividad natural y los rayos ultravioletas
inducen mutaciones, es muy probable que los radicales libres hayan tenido un creciente
papel en el proceso.
Los organismos deben protegerse de los radicales libres, pero tambin son capaces de
usarlos para no ser afectados por otras clulas u organismos que representan una
amenaza. Las plantas y los sistemas inmunes de los animales usan los radicales libres
para combatir bacterias y otros patgenos. Es como si usramos la fuerza de enemigos
permanentes e inevitables (los radicales libres) contra enemigos casuales (ciertos
microorganismos), a pesar del riesgo de destruir parte de nuestras clulas.
Adems, los radicales libres pueden tener un papel muy importante como mensajeros
biolgicos dentro de una misma clula, y de una clula a otra. Cabe recordar que existe
otro radical libre, el oxido ntrico, que es producido por una enzima (la oxido ntrico
sintasa) y tiene un papel muy importante como mensajero, por ejemplo entre neuronas.
Balance entre radicales libres y antioxidantes
Es importante mencionar el concepto de "balance" entre radicales libres y antioxidantes
en el organismo. Como el hierro, los radicales libres son txicos e indispensables a la
vez. La vida depende de su control riguroso, o sea de un equilibrio que apenas ahora
estamos empezando a elucidar. Una de las caractersticas del envejecimiento es la
prdida de control de este balance, lo que conducira a ciertos tipos de cncer,
enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Es conocido el activismo, en las
ltimas dcadas de su vida, del premio Nobel Linus Pauling, contra el militarismo, y a
favor del consumo diario de vitamina C.
Si el uso de suplementos antioxidantes es hoy un tema controvertido, no hay
especialista que niegue que el consumo de verduras y frutas (ricas en antioxidantes) es
indispensable para una buena salud. Ahora se conocen las cantidades de vitamina C,
vitamina E y selenio necesarias al da, y tambin se sabe que una buena alimentacin es
suficiente para satisfacer esas necesidades. Muchos mdicos e investigadores atribuyen
las virtudes de las verduras, frutas y ciertas plantas medicinales a sinergas entre
antioxidantes, es decir a la accin de combinaciones de antioxidantes.
Hacia nuevos antioxidantes
El descubrimiento de los antioxidantes volvi a despertar el mito del elxir de la vida.
En realidad, ningn antioxidante (o ninguna mezcla de antioxidantes), por ms eficaz
que sea, podr oponerse a la vejez y a la muerte. Pero s podemos esperar evitar ciertas
enfermedades. Si la prioridad debe ser el derecho efectivo de todos a la alimentacin, la
educacin y la salud, la investigacin de antioxidantes naturales ir ajustando nuestra
definicin de lo que es una buena alimentacin. La investigacin de antioxidantes
sintticos ya empez, y podra traer nuevos medicamentos. Cabe mencionar que los
radicales libres podran estar involucrados en ciertos aspectos de la vida moderna que

son nefastos para la salud, como son, adems de una alimentacin inadecuada, el
consumo excesivo de alcohol y/o tabaco, la contaminacin ambiental y hasta el estrs.
Mxico dispone de una gran variedad de plantas que sin duda producen, adems de
otros principios activos, muchos antioxidantes interesantes por descubrir. Estos nos
ayudarn a comprender las relaciones entre estructura y actividad antioxidante, y quizs
a usarlos como medicamentos. Los conocimientos ancestrales que se tienen sobre las
plantas podran servir de primer criterio de seleccin. Pero para esto, y ante esta
"globalizacin" de la economa, Mxico debe luchar contra la deforestacin, apoyar a
sus investigadores y protegerse con una legislacin "antibiopiratera" adecuada.