Trabajo Practico N

N3
3
Cultivo de microorganismos en el
laboratorio

Para qu cultivar microorganismos?

Para estudiarlos

Por
P qu?
?
Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen
i
importancia
t
i

ecolgica,
l i

i d ti l
industrial

( li
(alimentos:
t

l t
lcteos,

cerveza,

etc.),
t )

biotecnolgica (produccin de compuestos, obtencin de genes de inters) y

porque
p
q causan enfermedades.

Cmo?
Imitando en el laboratorio las condiciones del ambiente natural del
microorganismo, utilizando medios de cultivos y condiciones que sustenten el
crecimiento.

Qu factores influencian el crecimiento bacteriano en la

naturaleza?
Factores nutricionales
Factores ambientales (fsicos)

Factores nutricionales:
Carbono: CO2, compuestos orgnicos.
Nitrgeno: NH3, NO3-, N2, compuestos orgnicos nitrogenados (aminoacidos,
bases nitrogenadas)
Fsforo: PO3Azufre: H2S, SO4-, compuestos orgnicos azufrados.
Potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro.
El
Elementos
t traza:
t
C M
Cu,
Mo, M
Mn, Ni
Ni, Z
Zn, etc
t
Factores de crecimiento: vitaminas, aminoacidos, purinas y pirimidinas

Qu factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza?

Factores ambientales
Temperatura

Disponibilidad de agua (osmolaridad)

T
Termfilos:
fil
50 60 C
50-60

Halfilos discretos 1-6 % NaCl

Mesfilos: 20-40 C

Halfilos moderados 6-15 % NaCl

Psicrfilos: 10-20 C

Halfilos extremos 15-30

15 30 % NaCl
Halotolerantes

Oxgeno
Aerobios estrictos

pH

A
Anaerobios
bi ffacultativos
lt ti

Acidfilos 1.0 - 5.0

Microaerfilos

Neutrfilos 5.5 - 8.5

Anaerobios aerotolrenates

Alcalfilos 9.0
9 0 - 10.0
10 0

Anaerobios estrictos

Varias preguntas al cultivar un microorganismo:

Es aerobio, anaerobio facultativo, microaerfilo, anaerobio?

Qu sustratos puede utilizar como fuente de carbono y energa?

g
Qu formas de nitrgeno puede utilizar?
Requiere suplementos nutricionales?
Requiere luz como fuente de energa?
Puede crecer sobre un sustrato inorgnico?
Cul es su temperatura ptima de crecimiento?
Tolera concentraciones altas de sal?

Cmo sustentamos el crecimiento en el laboratorio?

M di de
Medios
d cultivos
lti
Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de
nutrientes que en concentraciones adecuadas y con
condiciones fsicas ptimas permiten un buen crecimiento de
los microorganismos.

9 Fuente de carbono y energa (glucosa o cualquier otro

compuesto carbonado)
9 Fuente de nitrgeno,
nitrgeno azufre
azufre, fsforo
9 NaCl
9 Buffer
9 Agua
Segn la
consistencia

Lquidos
q
((caldos))
Slidos (agar 1,5 %)
Semislidos (agar 0,6 %)

Obtencin de cultivos puros Breve historia

1876 Koch Cultivo de MO en medio solido (gelatina y rodajas
de papa) para asegurar cultivos puros.

Postulados de Koch:
1.
2.
3.
4.

El microorganismo debe estar presente en todos los individuos con la misma

enfermedad.
enfermedad
El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder ser
aislado en medio de cultivo.
El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la misma
enfermedad cuando se lo inocula a otro husped.
husped
El individuo experimentalmente infectado debe contener el micoorganismo.
Robert Koch

1882 Walter Hesse remplaza la gelatina por Agar-Agar, lo que

permiti el cultivo de microorganismo aislados a mayores
temperaturas.
1887 Julius Richard Petri uno de los ayudantes de Koch ideo
una caja o capsula de vidrio para el cutivo de los microorganismo.

Obtencin de cultivos puros

Medio Slido: permite el crecimiento en superficie de los microorganismos como

poblaciones discretas
COLONIAS
Cultivos puros

Medio lquido: Permite la obtencin de gran masa celular. Posibilidad de

utilizar
tili
grandes
d volmenes
l
((estudios
t di bi
bioqumicos,
i
ffermentaciones).
t i
)
Medio semislido: Se utiliza para estudios de movilidad, fermentacin.

Tipos de Medios de cultivos

Medio definido o sinttico: son los medios que contienen una composicin
qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de
requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.

Medio complejo:
complejo medios que
q e contienen nutrientes
n trientes de composicin qumica
q mica
variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de
nutrientes. Contienen extractos animales, vegetales
g
e hidrolizados de
protenas.
Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos

Medios complejos
Extracto de carne: Se obtiene a partir de la protelisis de carne
magra sin tendones. Es de alto valor nutritivo.
Fuente de
carbono

Extracto
E
t t de
d levadura:
l
d
S obtiene
Se
bti
d
de lla extraccin
t
i acuosa d
de
levadura de cerveza. Es rico en vitaminas.
Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta
malta.
Rica en carbohidratos y maltosa.
Peptona
p
de carne: Digestin
g
de carne bovina con tripsina
p
o
pepsina

Fuente de
nitrgeno

Peptona de casena (triptena): Tratamiento de

casena con tripsina. Altos contenidos en triptofano.
Peptona de soja: Digestin de soja con papana.

Medio definido

Gl
Glucosa,
sacarosa o cualquier
l i otro
t compuesto
t carbonado
b
d
NH4Cl, (NH4)2SO4, aa, bases nitrogenadas

Medio mnimo definido para Bacillus

megaterium

Medio definido para

Thiobacillus thiooxidans, un
quimiolitoauttrofo del azufre

Medio definido para un

quimilitoautotrofo que oxida
amonio (Nitrosomas)

Medio definido para un

quimiorganohetertrofo

Medio complejo
p j para
p
quimiorganohetertrofo (agar nutritivo)

Medio definido para el crecimiento de

bacterias quimioorganohetertrofas
fastidiosas como Neisseria gonorreae

Medio complejo para

bacterias fastidiosas

Medio complejo para

halfilos extremos

Efecto del oxgeno sobre el crecimiento

Atmsferas de incubacin
Crecimiento en
anaerobiosis
Estufas
E
t f y jarras
j
de anaerobiosis
(generadores de
gases)

Creciemiento en
aerobiosis
bi i
Medios lquidos: Agitacin.
Slidos: en atmsfera
normal (78 % N2, 21 % O2,
0,03 % CO2)
Temperatura de incubacin

Otros medios de cultivo

Medios enriquecidos: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y
se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias
nutricionales.
Medios diferenciales: medio que permite revelar caractersticas
fisiolgicas de los microorganismos.
Medios selectivos: medio que slo permite el crecimiento de un grupo
de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar
microorganismos a partir de poblaciones mixtas.

Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de

un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una
gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo lquido
y se incuba bajo determinadas condiciones.

Agar columbia
CNA
Medio muy nutritivo

Medio selectivo

Contiene peptonas, extractos de

levadura y corazn, almidn.
colistin y cido nalidxico

Inhiben G S. epidermidis en agar Columbia CNA

Agar MRS (Man, Rogosa y sharpe)

Medio enriquecido para Lactobacillus.
Poca selectividad
Contiene
Extratos, peptonas, glucosa, factores de
crecimiento (tween 80, Mn, Mg), citrato
(inhibicin G -)
Lactobacillus lacticus en MRS agar

Levine EMB Agar

Medio para enterobacterias
diferencial y selectivo
Contiene:
Peptona
Permite diferenciar entre los microorganismo capaces
de fermentar la lactosa de los que no.

Lactosa
Eosina
Azul de metileno

No fermentador
de lactosa

Fermentador de lactosa

Fermentador de lactosa, con brillo

verde brillante (E. coli )

Mac Conkey Agar

Medio para diferenciar enterobacterias
Selectivo y diferencial
Contiene:
P t
Peptonas
Lactosa
Sales Biliares y cristal violeta

E coli
E.

Purpura de bromocresol

Lactosa (+)
Lactosa ( - )

colonias Amarillas
colonias transparentes
o blancas
E. coli

Proteus

Agar sangre
Medio enriquecido y diferencial
Se adiciona al medio sangre.
Permite el crecimiento de
bacterias con requerimientos
nutricionales exigentes .
Permite distinguir tres patrones
de hemlisis:

Agar chocolate
Medio enriquecido
Agar con el agregado de sangre,
calentado suave. Suministra factores de
para bacterias exigentes.
g
crecimiento p
(Haemophilus influenzae, Neisseria
gonorrheae)
Haemophilus influenzae

Agar manitol salado

Medio para aislar Staphylococcus
Selectivo y diferencial
Contiene:
Peptonas
Manitol
Cl
Cloruro
d
de sodio
di 7
7,5
5 % (vs
( 0
0,5
5 %)
Rojo fenol

Fermentacin manitol

No fermentacin manitol

acidez

Colonias
amarillas

Colonias rosadas

S.aureus

S epidermidis

Baird-Parker
Medio para distinguir Staphyloccocus aureus.
Selectivo y diferencial
Contiene:
Peptonas
Extractos

Se suplementa con yema

de huevo emulsionada
con telurito de potasio

Cloruro de litio
Glicina
Piruvato de sodio

Glicina + piruvato
promueven el
crecimiento de
Staphyloccocus
S. aureus

S. aureus reduccin telurito a

+
telurio, lecitinasa (-)
S. Epidermidis reduccin de
telurito, lecitinasa (+)

Colonias negro-grisceo
rodeada por zona clara
Colonias negro-grisceas,
sin zona clara

Agar cetrimida

Medio para Pseudomonas

Selectivo, parcialmente
dif
diferencial
i l

Contiene:
Peptona
Cloruro de magnesio
Sulfato de potasio
Cetrimida (detergente catinico
catinico,
bromuro de cetiltrimetil amonio)
Adicin de cido nalidxico
Produccin de pigmentos pioverdina

P. aeruginosa en agar cetrimida

Colonias amarillo verdosas

piocianina, piorrubina

pioverdina

Agar Mossel
Medio para aislar Bacillus cereus
selectivo y diferencial
C ti
Contiene:
Peptonas
Extractos
t actos
Manitol

Adicin de yema
de huevo y
polimixina B

Rojo fenol
Bacillus cereus: no es capaz de utilizar el
manitol (M -), produce la exoenzima
e
a lecitinasa
ec asa ((L+))
Saphilococcus aureus: es capas de utilizar
manitol (M +), no produce
l exoenzima
la
i
llecitinasa
ii
(L
(L-))

Colonias rosadas con

precipitado blanco

Colonias amarillas con

precipitado
p
p
blanco

Salmonella y Shigella Agar

M di selectivo
Medio
l ti y dif
diferencial
i l para Salmonellas
S l
ll y Shi
Shigellas
ll
Contiene

Salmonella typhimurium

Peptonas
p
Extractos
Lactosa
Sales biliares y verde
brillante
Citrato frrico
Tiolsulfato sdico
Rojo neutro
Salmonella, produccin de
c. sulfdrico, lactosa (-)
Shi ll lactosa
Shigella,
l t
((-))
E. coli, lactosa (+)

Shigella flexneri

Colonias transparentes con

centro negro
C l i ttransparentes
Colonias
t
Colonias rosadas a rojas

Indicadores de pH
ROJO NEUTRO
Rango de pH: 6.8-8.0 (rojo a amarillo)
AZUL DE BROMOTIMOL
Rango de pH: 6-7.6 (amarillo a azul).
ROJO DE FENOL
Rango de pH: 6.8-8.2 (amarillo a rojo)
AZUL DE TIMOL
R
Rango
d
de pH:
H 1
1.2-2.8
2 2 8 ((rojo
j a amarillo)
ill ) y 8
8.0-9.6:
0 9 6 ((amarillo
ill a azul).
l)
PURPURA DE BROMOCRESOL
Rango de pH: 5.2-6.8
5.2 6.8 (amarillo a prpura)
ROJO DE CRESOL
Rango de pH: 7.2-8.8 (amarillo a rojo).

Tcnicas bsicas de
microbiologa
i
bi l

Siembra en placa:
Agotamiento por estra

Obtencin de colonias aisladas

Siembra en agar
g
inclinado

Inoculaciones en medio solido en tubos

Pasaje de cultivos lquidos

Siembra por extensin y por vertido de placa

Siembra por extensin con esptula de Drigalsky

Medida del crecimiento

Por masa celular

1) Determinacin del peso seco /hmedo

2) Determinacin del N total : proteico o no proteico

3) Determinacin de componentes celulares: ADN, ARN, protenas

4) Mtodos turbidimtricos (densidad ptica)

Medicin de la turbidez: mtodos espectofotomtricos

 = 600 nm

Curva de calibracin

Medida del crecimiento

Por medida del nmero de individuos

1) Recuento directo
Cmara de Petroff
Petroff-Hauser
Hauser (para bacterias)
Cmara de Thomas (para levaduras)

2) Contadores electrnicos de partculas (Contador Coulter)

3) Recuento de viables en placa

4) Recuento de viables sobre filtro en placa

Recuento directo de microorganismos al microscopio

Cmara de Petroff-Hausser

muestra

rea total: 1 mm2

Altura: 0,02 mm
Volumen: 0,02 mm3 = 0,00002 cm3
N cl/ml = promedio cl x 25 x 5 104

Recuento de clulas viables: mtodo de recuento en placa

UFC/ml= N/ ((vol x dil))

Problemas de Diluciones

DO600= 0,35
0 35
0,1 DO = 5x108 bact/ml
V final de cada dilucin ser de 0,1 ml

Un cultivo de E. coli crece en fase logartmica

g
y tiene una DO de 0,6
,
unidades. Se sabe que cuando el cultivo tiene una DO de 0,4 unidades, la
concentracin bacteriana es de 1x108 bacterias/ml. Qu dilucin hara y
qu volumen sembrara para realizar el recuento de viables cuando la DO
es 0.6 U?.

Conservacin de cultivos puros

(axnicos)
Preservar la viabilidad y estabilidad gentica. Evitar la
contaminacin
En estra sobre agar
g inclinado en
heladera (5C)
Congelados a -20 C, 70 C 196 C en caldo con 20 % glicerol u otro
crio persevante (por ejemplo leche)
Liofilizados

Solo unos meses

De meses a aos

Tiempos largos

Los repiques sucesivos NO son un mtodo de conservacin

de microorganismos