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Tcnicas Imunolgicas

Testes sorolgicos no laboratrio








deteco e quantificao de antgeno e anticorpo:


diagnstico de doenas infecciosas, diferenciao da
fase da doena, avaliao de prognstico, critrio de
cura
dosagem de hormnios
reagentes no marcados ou marcados
uso de peptdeos sintticos e anticorpos monoclonais

Hemoaglutinao
Hemoaglutinao direta:
Ex: grupo sangneo ABO e Rh

Hemoaglutinao indireta: hemcias usadas


como um suporte
Ex: pesquisa de Ac anti- Toxoplasma gondii

Reao de hemoaglutinao

ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)




fase slida: poliacrilamida, agarose, dextran,


poliestireno, polivinil, polipropileno

Placa de ELISA

Etapas do ELISA





sensibilizao (ou cobertura) da fase slida:


adio de Ag ou do Ac
bloqueio (protena inerte: soro fetal bovino,
leite desnatado)
adio da amostra (em diluente) *
adio do conjugado: anticorpo purificado
marcado com enzima (ex: peroxidase)

lavagens

Etapas do ELISA
adio do substrato cromognico:
peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD
(ortofenilenodiamina)
 interrupo da reao: SDS ou cido
 leitura: leitor de ELISA


lavagens

Etapas do ELISA

Reao de imunofluorescncia direta


- A reao Ag-Ac detectada pela emisso de
fluorescncia
Pesquisa de antgeno
amostra (Ag??) + Ac especfico conjugado a
substncia fluorescente (conjugado)*
microscpio de fluorescncia

Reao de imunofluorescncia direta

Reao de imunofluorescncia indireta


A- pesquisa de antgeno
amostra (Ag??) + Ac especfico Ag-Ac *
Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
microscpio de fluorescncia

* lavagens

Reao de imunofluorescncia indireta


B- pesquisa de anticorpos
Ag (lmina) + soro do paciente (Ac??) Ag-Ac *
Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina *
microscpio
determinao do ttulo e classe do Ac

Reao de imunofluorescncia indireta

RIFI para pesquisa de Ac anti -T. cruzi

Citometria de fluxo



citmetro de fluxo ou FACS ( fluorescent-activated cell sorter)


fonte de excitao: lmpada de argnio raio laser (488 nm)
caractersticas detectadas: tamanho da clula, granulosidade e
fluorescnica emitida




tamanho da partcula: detectores situados frente do raio laser


granulosidade: detectores a 900 do raio laser
intensidade de fluorescncia:

FL1: emisso na regio de 530 30 nm (isotiocianato de


fluorescena - FITC)
FL2: emisso na regio de 585 26 nm (ficoeritrina - PE)
FL3: emisso acima de 630 nm (peridina-clorofila)

ETAPAS DA CITOMETRIA DE FLUXO








coleta e processamento da amostra (sangue total)


incubao das clulas com anticorpos
monoclonais conjugados com fluorocromo
aquisio de dados no aparelho
anlise dos dados: tamanho, granulosidade e
emisso de fluorescncia

Expresso dos resultados




grfico de tamanho x granulosidade (FSC x


SSC): seleo da populao a ser analisada
(linfcitos, moncitos, neutrfilos e
eosinfilos)
Grfico de fluorescncia (FL1 x FL2):
avaliao de caractersticas da clula

Grficos de citometria de fluxo


FSC x SSC

FL1 x FL2

Aplicaes da citometria de fluxo




infeco pelo HIV: contagem de linfcitos T


CD4+ e CD8+
classificao das imunodeficincias e
leucemias
diagnstico da hemoglobinria paroxstica
noturna