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CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS

I.

OBJETIVOS
Estudiar las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de fruta bajo
condiciones ptimas de desarrollo.
Obtener las curvas de crecimiento para una determinada cepa e interpretar los
resultados aplicando los conocimientos de cintica de crecimiento de los
microorganismos.

II.

FUNDAMENTO TEORICO
Las curvas de crecimiento comprenden varias fases. Fase lag o de latencia: Es la
primera parte de la curva, en la que el nmero de ufc permanece constante
aproximadamente, es una fase de adaptacin al medio. Aunque no tiene lugar
divisin alguna, se da una considerable actividad bioqumica, especialmente sntesis
de protena y de ARN. La duracin de la fase lag depende de varios factores,
principalmente dela temperatura de incubacin, la composicin del medio de
crecimiento, su pH y potencial redox y del estado fisiolgico del inoculo. Fase
logartmica o exponencial: Es cuando la multiplicacin de las clulas de los
microorganismos se da a velocidad ptima, el log de los nmeros de ufc frente al
tiempo muestra una relacin en lnea recta, la velocidad de crecimiento durante esta
fase se puede calcular a partir de la pendiente de la curva de crecimiento y un
modelo matemtico. Fase estacionaria: Las ufc permanecen aproximadamente
constantes durante un tiempo variable. No hay reproduccin o el ritmo de
multiplicacin y el ritmo de muerte son ms o menos iguales. Fase de muerte: La
muerte de las clulas va seguida de autolisis. Esta libera de nuevo al medio diversos
componentes celulares que proporcionan nutrientes para que otras clulas viables
se multipliquen. Disminucin paulatina de clulas vivas.
El proceso de elaboracin de levaduras secas activas (como nutricin, secado)
podra influir en el rendimiento de la levadura, por lo que tambin se deben llevar a
cabo experimentos con levaduras secas.
La caracterizacin de levaduras incluye los aspectos de la produccin de vinos de
alta calidad, as como tambin el cumplimiento de la legislacin en trminos de
seguridad alimentaria. Los criterios relevantes para los aspectos de seguridad no se
indican de manera especial, ya que la legislacin nacional y/o internacional podra
diferir entre los estados miembros. La persona o compaa seleccionadora est, por
tanto, obligada a tomar en cuenta estos requisitos legales.

Las lneas directrices se pueden aplicar igualmente para analizar cultivos de


levaduras secas. Es necesario seguir las instrucciones del fabricante a la hora de
reactivar e inocular levaduras secas.

VIGOR FERMENTATIVO Y CINETICA


DETERMINADAS TEMPERATURAS

DE

LA

FERMENTACION

mbito de aplicacin
Criterio estndar para levaduras para vinificacin
Fundamento
El vigor fermentativo, entendido como la velocidad a la que la levadura inicia la
fermentacin, se expresa en gramos de CO2 producidos de 2 a 3das despus del
comienzo de la fermentacin. La cintica de la fermentacin se controla utilizando
una curva (gramos de CO2 producidos o gramos de azcar fermentado / tiempo)
para seleccionar las cepas que muestran un rpido inicio de la fermentacin, sin
picos debidos a las variaciones de la temperatura y buen rendimiento al trmino de
la fermentacin. Una buena cintica de la fermentacin se traduce en un menor
consumo de energa debido al control de la temperatura. La temperatura es uno de
los factores que varan entre los procesos de vinificacin. Influye en la produccin
de acidez voltil y de metabolitos durante la fermentacin, as como en la viabilidad
de la levadura.
Equipo
- Esterilizador
- Balanza analtica, precisin de 0,1 g
- Cabina de flujo laminar
- Pipetas con puntas esterilizadas
- Tubos de ensayo para sincronizacin del cultivo
- Matraces Erlenmeyer de 100 ml con vlvula Mller
Reactivos y materiales
- El medio de fermentacin se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado
hasta que la concentracin de azcar alcanza los 250 g.l-1.
- Antes de la inoculacin, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en el
medio YEPD para obtener el cultivo madre.
Procedimiento
Los cultivos de levadura que se deben analizar se obtienen al inocular 100l de
cultivo madre en 5ml demedio fresco. Se debe incubar durante 48 horas con 3
pases sucesivos. El medio definitivo para el cultivo debe contener 108 UFC ml-1. La
concentracin de levadura en el momento de la inoculacin en el medio debe ser
aproximadamente de 106 clulas vivas ml-1.

La microvinificacin se controla por anlisis gravimtrico, pero a diferentes


temperaturas de fermentacin (15C, 20C, 25C y 30C). Para cada temperatura se
traza una curva que muestra las variaciones de CO2 liberado al da, lo que permite
estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de fermentacin.
Clculos
Utilizando las curvas se estudian los siguientes parmetros para cada cepa: longitud
de la fase latente (retardo), pendiente de la curva en la fase logartmica, longitud de
la fase estacionaria, y longitud y pendiente de la curva en la fase final. El rango
ptimo de la cepa de muestra se halla comparando las curvas obtenidas a
diferentes temperaturas.
MEDIO DE CULTIVO YEPD
YEPD o extracto de levadura peptona dextrosa, tambin a menudo abreviado como
YPD, es un completo medio de crecimiento de levaduras. Contiene extracto de
levadura, peptona, agua doblemente destilada, y glucosa o dextrosa. Se puede
utilizar como medio slido mediante la inclusin de agar. El extracto de levadura
tpicamente contendr todos los aminocidos necesarios para el crecimiento. Por
ser un medio completo, YEPD no puede ser utilizado como un medio de seleccin
para la prueba de auxtrofos. En lugar de ello, YEPD se utiliza como un medio de
crecimiento para crecer cultivos de levaduras.
La versin de agar YEPD consiste tpicamente de 0,3% (masa / volumen) de
extracto de levadura, 1% de peptona, 1% de glucosa / dextrosa, 2% de agar, siendo
el resto agua destilada.
La versin de caldo YEPD contiene tpicamente 1% de extracto de levadura, 2% de
peptona, 2% de glucosa / dextrosa, y el resto es agua destilada.

III.

MATERIALES

Refractmetro
Mosto acondicionado
Cepa de saccharomyces cereviseae
Termmetro
pH metro
Densmetro 0.9 a 1.1 g/ml
Equipo para medir acidez titulable
Baln de 4 litros
Probeta de 250ml
Placas Petri
Pipetas de 10, 5, 2 o 1ml

Tubos de ensayo
3 matraces Erlenmeyer de 1L y de 250ml
Agua peptonada
200ml de agar patata glucosa, o OGA o agar suero naranja.

IV. PROCEDIMIENTO
1) Preparar el mosto adecuando la temperatura, Brix, pH, acidez.
2) Pasteurizar, enfriar, inocular la cepa. Iniciar el proceso de fermentacin.
3) Controlar diariamente la temperatura, pH y densidad. Airear el mosto. Realizar
la numeracin de levaduras por recuento en placas.
4) Anotar. Construir la curva de crecimiento de levadura. Hallar el tiempo de
duracin de las fases lag, logartmica, estacionaria. Hallar el tiempo de
duplicacin.

V.

RESULTADOS
PROCESO DE VINIFICACION
Curva de crecimiento de levaduras de la elaboracin de vino del curso de Enologa.
Se trabaj con 100 kg de uva. Se inici la fermentacin con 25Brix. Se utiliz
metabisulfito de potasio y pie de cuba. Las cepas son nativas propias de la cscara
de la uva.
CUADRO N1: FICHA DE CONTROL DE LA FERMENTACIN
N Muestra
Fecha
Hora
Nx106
T (C) Observaciones
1
2

9/4
10/4

9:30
9:30

1
5,5

24
24

3
4
5
6
7
8
9
10
11

11/4
12/4
15/4
16/4
17/4
18/4
19/4
22/4
23/4

14:30
16:00
9:00
9:00
9:00
10:30
10:00
11:00
---

5
3
37
57
63
64
42
19
----

20
20
21
21
21
21
21
21
----

Hongos 2x105
Hongos 1x105.
Burbujeo
Ayer se agreg pie
de cuba y
Metabisulfito.
Hongos 2x106
Hongos 1x105

Se agreg
metabisulfito para
parar la
fermentacin.

De la placa 10-6 se pic una colonia aislada y se sembr en caldo YEPD (Caldo
extracto de levadura, ms glucosa y peptona) en un tubo de ensayo. Se observ
que el proceso de fermentacin dur de 3 a 5 das. Luego se sembr en un matraz
Erlenmeyer se observ un buen crecimiento en 3 a 4 das. Se observ al
microscopio levaduras, Gram positivas, elpticas y en proceso de reproduccin
formando grupos y algunas clulas en proceso de gemacin.
Se sembr en otro matraz en iguales condiciones y en el caldo YEPD, y se analiz
el recuento de levaduras todos los da a las 12 del da para obtener la curva de
crecimiento, todo a 25 C. Esto se realiz del 27 de mayo al 3 de junio.

CUADRO N2: REGISTRO DE RECUENTO DE LEVADURAS


Fecha de anlisis de
Millones de
recuento de levaduras.
ufc/ml
27/5
2
28/5
14
29/5
65
30/5
60
31/5
60
3/6
30
4/6
No medido

CURVAS DE CRECIMIENTO DE LEVADURA (S. cerevisiae elipsoideus)


DURANTE LA VINIFICACION
CUADRO N3: TABULACION DE DATOS
Tiempo (T) Tamao de
(horas)
clulas (X)
Nx10^6
0
1
24
5.5
53
5
78.5
3
143.5
37
167.5
57
191.5
63
217
64
288.5
42
313.5
19

X (tamao de celulas) Nx10^6

GRAFICA N1: CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURAS EN LA VINIFICACION


70
60
50
40
Nx10^6
30
20
10

(tiempo de
crecimiento)
(horas)

0
0

50

100

150

200

250

300

350

Hallando el tiempo de duracin de las fases lag, logartmica y estacionaria.

Hallando la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo.

Hallando el tiempo de generacin o duplicacin del microorganismo.

CURVAS DE CRECIMIENTO DE LEVADURA (S. cerevisiae ellipsoideus)


DURANTE LA FERMENTACION EN CALDO YEPD.
CUADRO N4: TABULACION DE DATOS
Tiempo (T) Tamao de
(horas)
clulas (X)
Nx10^6
24
2
48
14
72
65
96
60
120
60
192
30
GRAFICO N2: CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA (s.c.ellipsoideus) EN CALDO
YEPD

X (tamao de celulas) Nx10^6

80
70
60
50

millones de ufc/ml

40
30
20
10
0
0

50

100

150

200

250

T (tiempo de
crecimiento)
(horas)

Hallando el tiempo de duracin de las fases lag, logartmica y estacionaria.

Hallando la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo.

Hallando el tiempo de generacin o duplicacin del microorganismo.

VI. CONCLUSIONES
Se estudi y conoci las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de
fruta bajo condiciones ptimas de desarrollo.
Se obtuvo las curvas de crecimiento para la cepa mencionada.

VII. BIBLIOGRAFIA
1. Boned, F.; Colomo, B.; Surez, J. A. Seleccin de levaduras vnicas en la D. O.
Bierzo. Vitivinicultura, 1992, 3, 37.
2. Caldern, F.; Gutirrez-Granda, M. J., Surez-Lepe, J. A. Isolation, identification
and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes
from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368.
3. Kunkee, R. E.; Goswell, R. W. Table wines. In: Alcoholic beverages. Ed. A. H.
Rose. Academia Press, London, 1977, pp. 315-386.