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El microscopio

La luz
La luz de acuerdo al enfoque actual, más que una onda, es considerada de
manera más exacta una oscilación electromagnética que se propaga en el
vacío o en un medio transparente y que es capaz de ser percibida por nuestro
sentido de la vista

Espectro EM y luz visible

La acción de una lente depende de los principios de refracción y reflexión . plástico u otro material transparente. que posee dos superficies pulidas y diseñadas de una manera específica para producir la convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. generalmente de diámetro circular.Lentes El término lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio.

Difracción Dispersión y curvado aparente de las ondas cuando encuentran un obstáculo Polarización Birrefringencia Las características transmitidas por una onda se «filtran» en una dirección de desplazamiento entre todas las direcciones aleatorias inicialmente posibles. Refracción Es el cambio brusco de dirección que sufre la luz al cambiar de medio.Propiedades de la luz Tipo Reflexión Definicion Cambio de dirección de un rayo o una onda que ocurre en la superficie de separación entre dos medios. de tal forma que regresa al medio inicial. Doble refracción .

Imágenes propiedades luz .

Un sistema óptico.El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo).. c.Fundamentos microscopia Se define microscopía como la técnica que permite observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) y obtener una imagen aumentada del mismo y para ello es necesario tener en cuenta estos tres elementos: a. Mecanismos iluminación Trans iluminación Epi iluminación .Una fuente de iluminación. b...

Esquema .

que las tareas produzca una imagen magnificada del espécimen b.Conceptos de microscopia óptica Los microscopios son instrumentos diseñados para producir imágenes visuales o fotográficas magnificadas de objetos pequeños. ..haga los detalles visibles al ojo o a la cámara fotográfica humano.separe los detalles en la imagen c. El microscopio debe lograr tres funciones a...

.Parámetros ópticos (I) Aumento Relacion de tamaño entre el objeto percibido a simple vista y el apreciado al microscopio. Se obtiene multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento del ocular.

Parámetros ópticos (II) Abertura numérica Es una medida de su capacidad de recolectar la luz y de resolver el detalle fino del espécimen en una distancia fija del objeto Abertura numérica ( NA ) = n(sin m) •“n” del medio de la proyección de imagen entre la lente delantera del objetivo y del cristal de la cubierta del espécime •“m” . . es la mitad del ángulo de aceptancia máximo que puede entrar o salir de la lente.

AN (ejemplo) .

Un poder de resolución de 0. tienen un valor numérico de poder de resolución lo más bajo posible ..Parámetros ópticos (III) Poder resolución El poder de resolución de un objetivo es el valor de la mínima distancia que puede haber entre dos puntos para poder identificarlos (resolverlos) como independientes: a.19 micras se verán como un punto único Un objetivo con un gran poder de resolución.2 micras quiere decir que si dos puntos están separados por una distancia de 0.

Aberraciones (Poder resolución) .

Parámetros ópticos (IV) Profundidad de campo .

el enfoque correcto requiere la correcta combinación de contraste. esta última característica se le denomina intervalo dinámico luego: a...imágenes de alto contraste sólo tienen dos colores blanco y negro.a mayor iluminación menor contraste y a menor iluminación mayor contraste..A mayor número de sombras habrá menor contraste. resolución e iluminación .a mayor contraste menor resolución b..Parámetros ópticos (V) Contraste El número de sombras que se pueden observar en una imagen: a.. pero esto permite mayor información al poner de manifiesto otras estructuras. sin matices de gris. c. b.

.Ejemplos contraste.

.produzca una imagen magnificada del espécimen b..Este grupo de instrumentos incluye no solamente diseños de la múltiple-lente con objetivos y condensadores.separe los detalles en la imagen c. pero también los solos dispositivos muy simples de la lente que son a menudo “hand-held .hacer los detalles visibles al ojo o a la cámara fotográfica humano Este grupo de instrumentos incluye no solamente diseños de la múltiple lente con objetivos y condensadores. El microscopio debe lograr tres tareas: a.. pero también los solos d Introducción Los microscopios son instrumentos diseñados para producir imágenes visuales o fotográficas magnificadas de objetos pequeños.

Tipos de microscopio Tipos Electrónicos Óptico Claro o compuesto Campo oscuro Fase Polarizacion UV TEM SEM .

distinguidos por pequeñas diferencias. aunque el principio básico de funcionamiento es el mismo . Se utilizan microscopios compuestos que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores..Óptico o fotónico Este tipo de microscopios utilizan la luz como fuente de energía y las propiedades de los lentes ópticos que permiten aumentar el tamaño de los objetos observados. Dentro de los microscopios fotónicos existen varios tipos. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta.

Campo claro o compuesto Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes. transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria . o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista Partes Función Mecánico constituido por una serie de piezas en las que van. Óptico conjunto de lentes que aumentan la muestra Iluminación partes del microscopio que reflejan. que permiten el movimiento para el enfoque.

Pinzas Sujetar la preparación Revólver Pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos .Sistema mecánico Partes Pie Función Base sobre la que se apoya el microscopio Columna Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Tubo Extremidad superior se colocan los oculares y en extremo inferior el revólver de objetivos Macrométrico Enfoque rápido preparación Micrométrico Enfoque exacto Plátina Coloca la preparación u objeto que se va a observar.

10X.Sistema óptico Partes Función Ocular Tiene como función aumentar la imagen formada por el objetivo. la abertura numérica y otros datos 6X. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. 20X. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen. 45X y 60X Secos Objetivos Inmersión objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior Existe una clasificación alternativa .

Clasificación objetivos
Tipos

Correccion

Naturaleza

aberraciones

medio

Acromático

Apocromático

Semi
apocromático

Seco

Inmersión

Oculares y Objetivos

Ocular características

Objetivo características (I) .

Objetivo características (II) .

Códigos color objetivos .

Definiciones (I) Objetivos acromáticos Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrigen para el azul. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro. . rojo y verde) . son más costosos. Corrección de esfericidad para el verde. el rojo y en cierto grado para el verde Objetivos apocromáticos Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello. Objetivos semi-apocromáticos Elaborados a partir de cristales de fluorita. azul.

Valores para objetivos acromáticos .

Esquema objetivos .

5). en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada. . La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo. mientras que en los objetivos secos. Objetivos inmersión. El medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. que posee un índice de refracción (n=1.33) o mejor aún aceite de cedro. Este líquido puede ser agua destilada (n=1.Definiciones (II) Objetivos secos El medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1. está disminuida.515) casi idéntico al del vidrio.

Objetivos inmersión. .

Sistema iluminación (I) Partes Función Fuente iluminación Lámpara incandescente de tungsteno sobrevoltada. Por delante se sitúa el diafragma Espejo Necesario si la fuente de iluminación no está construida dentro del microscopio Condensador (*) Finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo (*) La abertura numérica máxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado. formando un cono de luz con el mismo ángulo que el del campo del objetivo Diafragma Está provisto de un diafragma-iris. o no se logrará aprovechar todo su poder separador .

4 en modelos de tres lentes. Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad. Se emplea para observación de rutina y con objetivos de modesta apertura numérica y amplificación. Acromático: Corrige aberraciones cromáticas.Tipos condensadores Condensador de Abbe: Es el más simple. Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede llegar a tener una apertura numérica de 1. sin corrección de aberraciones y el más económico. Compuesto de dos o más lentes. .

Condensador tipo Abbe .

.Microscopio campo oscuro (MCO) Es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados. la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. A causa de esta disposición. de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace visible.

..Microscopio campo oscuro (MCO) La iluminación de campo oscuro se puede realizar tanto: a.luz incidente (epi-iluminación). .luz transmitida (trans-iluminación) b. en cuarto decreciente). Modelos de filtros de fácil realización para lograr la técnica de campo oscuro (izquierda y centro) e iluminación oblicua (derecha.

Ejemplos (I) .

Ejemplos (II) .

Alto costo. b.Visualiza los bordes destacados delas muestras...Ventajas-desventajas MCO Ventajas a. e.... solo bordes celular. espiroquetas con diámetros superior a 0.Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear.. b..Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum.Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas c. Inconvenientes a. . d. c.2 um.Permite ver partículas dipersas en un medio homogéneo.Inadecuada preparación de la muestra.No deja visualizar estructuras celulares especificas..

T. pallidum (MCO) .

situado dentro o debajo del condensador. que permite diferenciarlos del resto de la muestra y observar con mayor detalle su estructura interna .Microscopio de fase (MCF) El microscopio de contraste de fase permite observar células transparentes y sin colorear. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. Consta de un dispositivo. que produce una diferencia de un cuarto de longitud de onda en unos rayos luminosos con respecto a otros Origina unas variaciones de luminosidad en los elementos estudiados. resultando especialmente útil para células vivas.

Partes MCF .

c.cultivos celulares b.sedimento de orina .cortes histológicos sin teñir...Utilidad MCF a..

Cristales orina .

Microscopio polarización (MP) Se basa en el empleo de dos filtros polarizadores. a. . se encuentra entre la muestra y el ocular. sirve para generar un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace incidir en la muestra.El segundo.. denominado analizador. Si la muestra contiene sustancias que presentan anisotropía.el primero de ellos.. se produce birrefringencia y esta puede detectarse Las sustancias anisótropas presentan distintos valores de sus índice de refracción en función de la dirección en que vobre la luz al atravesar el cristal. el polarizador propiamente dicho. b.

Partes de los filtros polarizantes (I) .

Filtros polarizante .

.cristales de uratos e..sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto) b. .queratina f.colágeno d..Utilidad MP a.sustancia amiloide c.otras de origen exógeno....

absorben una luz de una longitud de onda determinada . en otras palabras.Microscopio fluorescencia Fluorescencia Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa.

f.la fluorescencia es pasajera c..También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser..Requerimientos (I) Fuente de luz: a.las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación d.. la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. e.la luz debe ser de una longitud de onda corta.. b.. g. ..Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo..Muchos modelos funcionan con epi-iluminación Filtros Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda.se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes.

solo la luz azul.Requerimientos (II) La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azu .

Utilidad (I) .

..Utilidad (II) Se emplearon tres fluorocromos: a. .. b.DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas.GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) c.rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos.

que es una radiación cuya longitud de onda es de aproximadamente 200 nm y en consecuencia permite un mayor poder de resolución que la luz visible. con fuente de luz. La estructura del microscopio es básicamente igual a la del microscopio de fluorescencia. filtros. La fuente luminosa corresponde a lámparas de arco de mercurio o xenón. objetivos y espejos especiales.Microscopia ultravioleta Es un microscopio en el que se usa la luz ultravioleta. . estos últimos son aluminizados.

tanto por encima como por debajo del plano enfocado. la imagen que se enfoca se ve contaminada por la superposición de los elementos del tejido que están fuera de foco. la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas .Microscopia confocal (laser barrido) Si una muestra gruesa es observada al microscopio fotónico.

así como también un filtro con un agujero que se coloca en el trayecto del rayo de luz .Características El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una fuente de luz muy potente.

luz visible e infra-roja) adaptados a los tipos de marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares Sistema óptico El sistema óptico de los microscopios está basado en los principios fundamentales que se mantienen inalterados. Se pueden utilizar sistemas de rayos laser multi-frecuencia (en el rango ultravioleta.Configuración CONFOCAL (I) Fuente de luz: Generalmente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser o lámpara de arco). . sin embargo están complementados con los avances en óptica moderna y la tecnología electrónica.

análisis y procesamiento de imágenes . tarjetas de video de alta resolución. Para los microscopios con múltiples rayos generalmente se usan cámaras CCD (charge. Detectores Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida.coupled device) Computadora Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador. complementadas con software de captura. barreras con agujero de diámetro variable y diversos filtros de excitación (para seleccionar la longitud de onda de excitación del fluorocromo).Configuración CONFOCAL (II) Filtros de interferencia Incluyen espejos dicromáticos o dicroicos.

Micrografías comparativas .

1 nanómetros . La gran diferencia de los dos tipos de microscopios es la potencia T.2 micrones 1000000 de veces con una resolución de 0.Microscopia electrónica Los principios básicos de los microscopios electrónicos son similares a los microscopios ópticos.microscopio Óptico Electrónico Característica aumentar unas 2000 veces y una resolución de 0. las diferencias están dadas en la fuente de luz (electrones ) y en el tipo de lente. ya que los electrónicos emplean lentes electromagnéticas.

Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas con un grosor entre 50 a 200 nanómetros.Microscopio electrónico transmisión Se utiliza para ver secciones o cortes de tejidos. que luego pueden ser plasmadas en fotografías . dirige un haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Éste microscopio obtiene imágenes en dos dimensiones. una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

mayor será el brillo del píxel en la pantalla . de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones.Microscopio electrónico barrido Permite la observación de superficies sin la necesidad de realizar cortes microscópicos. explorando la superficie de la imagen punto por punto. cuanto mayor sea el numero de electrones contados por el dispositivo.

Diferencias entre microscopios .