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la AGENCIA NACIONAL DE PROMOCIN CIENTFICA Y


TECNOLGICA

-ResmenesMircoles 18 de diciembre
MDULO I: TRACTO REPRODUCTOR: INTERACCIN CON LAS GAMETAS.
Coordinadora: Silvina Perez-Martinez.

La apoptosis inducida por xenoestrgenos en la espermatognesis


depende la activacin de ADAM17. Ricardo D. Moreno. Departamento de
Fisiologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad catlica de Chile,
Santiago, Chile.

La apoptosis es un proceso que se manifiesta en forma constitutiva durante la


espermatognesis en todas las especies estudiadas de mamferos, pero que
tambin puede ser inducida por agentes exgenos como frmacos, radiacin y
variacin en los noveles hormonales. El mecanismo no est del todo claro,
pero datos recientes indican que la activacin de la metaloproteasa ADAM17,
es un evento temprano en este proceso. En los ltimos aos hay un aumento
en la preocupacin de cmo molculas con actividad extrognica
(xenoestrgenos), pueden afectar en forma negativa la salud reproductiva. En
particular el Bisfenol A (BPA) y Nonilfenol (NP) son dos xenoestrgenos que
estn presente en la mayora de los productos plsticos y han sido detectados
en distintos fluidos corporales. En este sentido, algunos estudios indican que
ambos compuestos inducen apoptosis durante la espermatognesis de rata y
ratn, sin embargo, no se ha estudiado este mecanismo. El objetivo de este

trabajo fue el de evaluar la participacin de la ADAM17 en la induccin de


apoptosis de clulas germinales, inducida por BPA y NP, en ratas machos.
Escogimos trabajar con ratas machos pberes (22 das de edad) como un
perodo crtico del desarrollo de la espermatognesis. Los resultados indicaron
que una dosis nica de BPA o NP (50mg/kg) inducen apoptosis solo de clulas
germinales a las 24h de tratamiento, y en distintos tipos celulares. La inhibicin
farmacolgica in vivo de ADAM17 logr prevenir significativamente la apoptosis
de clulas germinales. Otro datos in vitro usando cultivo de clulas de Sertoli o
la lnea TM4 mostraron que BPA y NP son capaces de inducir la activacin de
ADAM17. Lo ms interesante fue que BPA y NP inducen la activacin de
ADAM17 desde los 15 de tratamiento, y que esta activacin depende de la p38
MAPK. Estos estudios muestran por primera vez que esta los xenoestrgenos
son capaces de activar ADAM17 e inducir apoptosis en clulas germinales de
ratones macho durante la pubertad. Financiamiento: FONDECYT 1110778.
Secreted membrane microvesicles in the epididymal fluid and their
role in bull sperm maturation. Julieta Caballero, Clmence Belleanne, Olivier
DAmours, Gilles Frenette, Robert Sullivan. Centre de Recherche du Centre Hospitalier
Universitaire de Qubec (CRCHU de Qubec), Universit Laval, Qubec, PQ, Canada.
Centre de Recherche en Biologie de la Reproduction, Dpartement dObsttrique,
Gyncologie et reproduction, Universit Laval, Qubec, PQ, Canada.

After completing spermatogenesis in the testis, spermatozoa must transit along


the epididymis in order to acquire their fertilizing ability. During this journey,
spermatozoa will undergo many biochemical modifications modulated by the
epididymal intraluminal fluid. The composition of this fluid varies from proximal
to distal segments and is the result of a precise regulated secretion of
epididymal epithelial cells. Membrane microvesicles, called epididymosomes,
are one of the main components of this fluid. Their size, morphology and
composition vary according to the epididymal segment were they are secreted.
In addition, different populations of epididymosomes are found in the same
segment. Between their functions, the transfer of specific proteins to
spermatozoa can be mentioned. We have demonstrated that 1) different
populations of epididymosomes are able to transfer selected proteins to the
each sperm population, 2) specific localization and compartmentalization of
proteins in epididymosomes coordinate their transfer to sperm, and 3) different
epididymosomes populations transfer different sets of protein by different
mechanisms to live or dead sperm. In addition, we have recently showed that
epididymosomes contain miRNAs, selectively sorted in proximal or distal
secreted microvesicles populations with possible roles in the regulation of gene
expression of the epididymal epithelium. Taken all these results together, we
are able to demonstrate that microvesicles accomplish very important
functions in the process of sperm maturation, regulating biochemical changes
in the sperm as well as the regulation of the epithelium gene expression and its
secretion that affects sperm maturation in consequence.
Del epiddimo a la reaccin acrosmica: de qu lado juega Src? Daro
Krapf. Instituto de Biologa Celular y Molecular de Rosario, Facultad de Cs Bioqumicas
y Farmacuticas (CONICET-UNR), Rosario, Santa F, Argentina.

La capacitacin de espermatozoides de ratn involucra una serie de


alteraciones fisiolgicas entre las cuales se destacan cambios en el estado de
fosforilacin de protenas, flujos inicos que impactan en el potencial de
membrana, y prdida de colesterol de la membrana plasmtica. Entre estos
cambios fisiolgicos se distinguen temporalmente los que ocurren con el inicio
del proceso de capacitacin de los tardos que requieren ms de 30 min para
su inicio, como por ejemplo la fosforilacin de protenas en residuos de tirosina.
El resultado neto de estos procesos es un espermatozoide hiperactivado y con
capacidad de desencadenar la reaccin acrosmica, parmetros que en
conjunto definen a un espermatozoide con capacidad fecundante. Sin embargo,
la diferencia entre eventos que alteran el patrn de movilidad espermtica de
aquellos que preparan al espermatozoide para desencadenar la reaccin
acrosomica es an difcil de trazar. El grupo de las tirosina kinasas no
receptoras ha surgido como mediador importante de la capacitacin, entre los
que se encuentra la protena Src. Esta quinasa se activa a los 30 min de
iniciada la capacitacin in vitro, mientras que su inhibicin impacta
negativamente en la capacidad fecundante del espermatozoide, sin afectar la
fosforilacin de protenas en residuos de tirosina. Llamativamente, Src es
secretada por el epiddimo. Se incorpora luego al espermatozoide durante la
maduracin epididimaria, y se integra luego a las cascadas de sealizacin que
desencadenan en la capacitacin espermtica. Esto constituye un rol activo de
la secrecin epididimaria en el control de las cascadas de sealizacin que
gobiernan la capacitacin.
Rol de protenas oviductales en el proceso reproductivo.

Sergio
Ghersevich. Laboratorio de Estudios Reproductivos, rea de Bioqumica Clnica,
Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas, Universidad Nacional de Rosario,
Rosario, Santa F, Argentina.

Los espermatozoides humanos que ingresan al oviducto pueden permanecer


desde horas hasta das antes de que el proceso de fecundacin tenga lugar.
Permanentemente, en modo asincrnico, los espermatozoides comenzaran el
proceso de capacitacin, mientras se desplazan hacia el sitio de la fecundacin
El xito de la fecundacin reside tanto en el encuentro efectivo de ambas
gametas en el oviducto como en las mltiples interacciones de las mismas con
factores presentes en el fluido oviductal. La informacin disponible acerca de
las molculas presentes en el oviducto humano que intervienen en estos
procesos es aun escasa. En investigaciones realizadas en nuestro laboratorio
encontramos que una protena presente en la secrecin oviductal y en el
epitelio oviductal humano, conocida como lactoferrina, se une a los
espermatozoides en zonas asociadas a la interaccin con los ovocitos y a la
zona pelcida, y es capaz de modular la interaccin entre las gametas y ciertos
parmetros de la funcin espermtica in vitro en forma dosis dependiente. La
determinacin del rol de molculas del microambiente oviductal involucradas
en la modulacin del proceso reproductivo humano podra contribuir a
establecer la etiologa de algunas patologas que llevan a la infertilidad y
quizs al diseo de teraputicas adecuadas.

Cmo seleccionar espermatozoides humanos en ptimas condiciones


fisiolgicas? Laura C. Giojalas. CEBICEM (UNC) & IIBYT (CONICET-UNC), Cordoba,
Argentina.

Los espermatozoides pueden detectar un gradiente de concentracin de una


molcula atractante y en consecuencia, orientar su movimiento hacia la fuente
del atractante. Este mecanismo se conoce como quimiotaxis espermtica. Los
espermatozoides humanos capacitados pueden ser atrados por un gradiente
de concentracin generado a partir de una concentracin picomolar de
progesterona, hormona que es secretada por las clulas del cmulus al
momento de la ovulacin. En nuestro laboratorio desarrollamos un ensayo de
seleccin
espermtica
(ESE)
que
selecciona
naturalmente
a
los
espermatozoides que se encuentran en el mejor estado fisiolgico. Este
mtodo se basa en la orientacin quimiotctica de los espermatozoides
mediada por la progesterona. El dispositivo consiste en dos compartimientos
conectados por un tubo, en uno se colocan los espermatozoides previamente
incubados bajo condiciones capacitantes y en el otro progesterona 10pM. La
hormona difunde formando un gradiente de concentracin dentro del tubo que
conecta ambos compartimentos. La eficiencia del ESE fue probada en muestras
de
semen
normal,
teratozoospermicas,
teratoastenozoospermicas,
oligozoopermicas y con esterilidad sin causa aparente. La poblacin
espermtica seleccionada con el ESE, esta significativamente enriquecida con
espermatozoides capacitados, con el ADN intacto y con bajo nivel de estrs
oxidativo. El estado de capacitacin espermtica, la movilidad y la viabilidad se
mantienen constantes al menos durante dos horas despus de la seleccin. Sin
embargo, no se observaron cambios en la morfologa espermtica despus del
ESE. Cabe hacer notar, que la exposicin a un gradiente picomolar de
progesterona adems estimula la capacitacin en espermatozoides que no
pudieron completar el proceso por s mismos. En conclusin, el ESE selecciona
espermatozoides en un estado funcional ptimo, y adems, prepara algunos
espermatozoides para la fecundacin. Resultados similares tambin fueron
observados en muestras subfrtiles. El uso de una poblacin espermtica
enriquecida con los mejores espermatozoides podra utilizarse para tratar a la
pareja infrtil y diagnosticar el estado fisiolgico de una muestra de semen.
MDULO II: MECANISMOS MOLECULARES Y FISIOLOGA ESPERMTICA
I. Coordinadora: Laura C. Giojalas.
Regulacin de la produccin y accin de las especies reactivas del
oxgeno en el espermatozoide. Cristin OFlaherty. Departamento de Urologa,
Univesidad McGill y el Instituto de Investigacin del Centro de Salud, Universidad
McGill, Montreal, Canad.

Las especies reactivas del oxgeno (ERO) son necesarias para la capacitacin
del espermatozoide de mamferos. Las ERO regulan la actividad enzimtica de
la adelnylyl ciclasa y diferentes protenas kinasas (A, C, MAPK, ERK, MEK, PI3K,
Akt y tirosinas kinasas) que generan una serie de fosforilaciones
interrelacionadas para asegurar el xito de la capacitacin espermtica 1. Si
bien se reconocen los efectos beneficios de las ERO en estos eventos asociados

a la capacitacin, los mecanismos regulatorios de la producin y accin de las


ERO en el espermatozoide son an desconocidos. Las ERO median sus efectos
a travs de la oxidacin de residuos de cistena presentes en el sitio cataltico o
regulatorio de las enzimas o de sus activadores. Las peroxiredoxinas (PRDXs)
son enzimas antioxidantes recientemente descubiertas que no solamente
protegen a las celulas contra el estrs oxidativo sino que tambin regulan la
sealizacin redox. Las PRDXs son peroxidasas selenio independientes que
reducen hydroperxidos orgnicos e inorgnicos y al peroxinitrito. Reaccionan
con bajos niveles de perxido de hidrgeno (necesarios para la capacitacion
espermatica del espermatozoide humano) y se encuentran distribuidas
diferencialmente en todos los sub-compartimentos del espermatozoide 2. Su
deficiencia e inactivacin por oxidacin ha sido asociada con la infertilidad
masculina3. La inhibicin de las PRDXs previene la fosforilacion de tirosina
asociada con la capacitacin. En conclusion, nuestras investigaciones sugieren
que las PRDXs son elementos claves de la proteccin antioxidante y de la
regulacin de los bajos niveles de ERO necesarios para la activacin del
espermatozoide de mamfero.
Citas bibliogrficas
1. de Lamirande E, O'Flaherty C. Sperm capacitation as an oxidative event. In: Aitken J,
Alvarez J, Agawarl A, eds. Studies on men's health and fertility, oxidative stress in
applied basic research and clinical practice.: Springer Science 2012; 57-94.
2. O'Flaherty C, de Souza AR. Hydrogen peroxide modifies human sperm
peroxiredoxins in a dose-dependent manner. Biol Reprod 2011; 84:238-247.
3. Gong S, San Gabriel MC, Zini A, Chan P, O'Flaherty C. Low Amounts and High Thiol
Oxidation of Peroxiredoxins in Spermatozoa from Infertile Men. J Androl 2012; 33:13421351.

Nuevo mecanismo de regulacin involucrado en la capacitacin


espermtica: participacin del proceso de exclusin de AMPc a travs
del transportador MRP4. Claudia Osycka-Salut, Federico Diez, Juliana Burdet,
Maria Gracia Gervasi, Adrin Mutto, Liliana Bianciotti, Ana Franchi, Carlos Davio y
Silvina Perez Martinez. Laboratorio de Biologa de la Reproduccin en Mamferos,
CEFYBO-CONICET, Buenos Aires, Argentina.

La capacitacin espermtica se correlaciona con cambios estructurales y


bioqumicos en el espermatozoide que involucra, entre otros, un incremento en
los niveles de AMPc. A su vez, en otros tipos celulares, tanto en condiciones
fisiolgicas y patolgicas el AMPc es excluido por protenas de resistencia a
multidrogas (MRPs), en particular MRP4, regulando la homeostasis celular. El
objetivo del trabajo fue estudiar la participacin del proceso de exclusin de
AMPc, va MPR4, en el proceso de capacitacin inducida por bicarbonato en
bovinos.
Se realizaron experimentos de capacitacin in vitro de espermatozoides
bovinos criopreservados incubados con bicarbonato 40 y 70 mM, probenecid
(inhibidor de MRPs), y DPCPX (antagonista del receptor purinrgico (A1R)). La
evaluacin de la capacitacin fue realizada mediante las tcnicas de
clorotetraciclina y de induccin de la reaccin acrosomal por lisofosfatidilcolina.
Los niveles intra y extracelulares de AMPc fueron detectados mediante un
ensayo de unin a PKA y posterior dosaje de AMPc.

La incubacin de los espermatozoides con bicarbonato 40 y 70mM increment


el patrn capacitado y los niveles de AMPc a nivel intra y extracelular (p<0,01).
La exclusin de AMPc fue detectada an en ausencia de IBMX (inhibidor de
fosfodiesterasas) sugiriendo que este mecanismo ocurre durante la
capacitacin en condiciones fisiolgicas (p<0,01). La presencia de KH7
(inhibidor de adenilato ciclasa soluble) disminuy la produccin de AMPc en el
medio intra y extracelular e inhibi la capacitacin inducida por bicarbonato
(p<0,01). Asimismo, el bloqueo de MRPs, increment los niveles intracelulares
e inhibi la exclusin de AMPc en el espermatozoide y disminuy la
capacitacin inducida por bicarbonato (p<0,01).
Por otro lado, la incubacin con AMPc extracelular increment el patrn
capacitado de los espermatozoides, la liberacin de los mismos del epitelio
oviductal y la tasa de fecundacin in vitro, sugiriendo un efecto capacitante del
nucletido cclico. Adems el AMPc extracelular revirti el efecto de probenecid
sobre la capacitacin inducida por bicarbonato (p<0,01). Para evaluar el
mecanismo de accin del AMPc extracelular estudiamos la participacin de
A1R. El bloqueo de A1R disminuy el efecto capacitante tanto de bicarbonato
como de AMPc (p<0,01). Por ltimo, se evalu la expresin de MRP4 en
espermatozoides bovinos y humanos por western-blot, RT-PCR e
inmunocitoqumica. MRP4 fue localizado en la regin post-acrosomal y en la
cola del espermatozoide, al igual que la localizacin informada para A1R.
Los resultados sugieren que la exclusin de AMPc, posiblemente va MRP4, y la
activacin de A1R, regulan eventos asociados a la capacitacin inducida por
bicarbonato indicando por primera vez un rol paracrino/autocrino de AMPc en
espermatozoides bovinos.
Cascadas de sealizacin involucradas en la capacitacin del
espermatozoide humano. Mara Agustina Battistone1, Vanina G. Da Ros1, Ana M.
Salicioni2, Felipe Navarrete2, Pablo E. Visconti2, Patricia S. Cuasnic1. 1Instituto de
Biologa y Medicina Experimental (IBYME-CONICET), Buenos Aires, Argentina.
2
Veterinary and Animal Sciences, University of Massachusetts-Amherst, USA.

El proceso de capacitacin del espermatozoide se caracteriza por un aumento


de la fosforilacin de protenas en tirosina (Tyr) mediada por la activacin de
PKA. Teniendo en cuenta que en el humano, la informacin disponible sobre la
cascada de transduccin de seales que llevan a dicho aumento, es limitada,
en el presente trabajo estudiamos diferentes vas de sealizacin intracelulares
involucradas en la capacitacin del espermatozoide humano y sus posibles
cross-talks. En primer lugar, estudiamos la cintica de activacin de la va de
cAMP/PKA a lo largo de la capacitacin (18 hs), observndose la existencia de
eventos que ocurren a tiempos cortos de incubacin (1 min) tales como el
aumento en la fosforilacin de los sustratos de PKA y cAMP, como as tambin
eventos ms tardos (6 hs) como la fosforilacin en Tyr. Asimismo, observamos
que, luego de 6 hs de incubacin, los espermatozoides presentan niveles
significativamente mayores de reaccin acrosomal (RA) espontnea e inducida
por progesterona y de fertilizacin de ovocitos de hmster sin zona pellucida
(HOPT), ensayo que evala la capacidad de los espermatozoides humanos de
sufrir RA y fusionarse con el oolema. A continuacin, evaluamos la
participacin de la familia de Tyr quinasas SRC (SFK) en la capacitacin
utilizando inhibidores especficos. Los resultados mostraron que los miembros

SFK cumpliran un rol indirecto en este proceso a travs de la inactivacin de


serina/threonina (Ser/Thr) fosfatasas tales como PP12 y PP2A. La va
SFK/fosfatasas modulara positivamente la fosforilacin de los sustratos de PKA
y Tyr como as tambin parmetros funcionales del espermatozoide como la
motilidad espermtica, la RA inducida por progesterona y la capacidad
fertilizante evaluada por HOPT. Utilizando distintas estrategias experimentales
observamos que las dos vas AMPc/PKA y SFK/fosfatasas presentan un punto de
cross-talk a nivel de la fosforilacin de los sustratos de PKA. Por otro lado,
teniendo en cuenta que en ausencia de Ca2+ en el medio de capacitacin, los
espermatozoides humanos exhiben un incremento en la fosforilacin en Tyr,
estudiamos la participacin del Ca2+ como regulador de la actividad de
fosfatasas y/o quinasas. Los resultados obtenidos sugieren que el Ca2+
extracelular regulara la cascada de fosforilacin en Tyr en una etapa posterior
a la fosforilacin de los sustratos de PKA ya que los mismos no son modificados
al disminuir la concentracin de Ca2+ extracelular. Asimismo, utilizando
inhibidores especficos, observamos que el efecto causado por la ausencia de
Ca2+ dependera de la actividad de la Ser/Thr fosfatasa PP2B y de calmodulina.
Ms an, esta regulacin ocurrira a travs de una va distinta a la de
SFK/fosfatasas. En conjunto, estos resultados indican la participacin de
diferentes vas de sealizacin en la capacitacin del espermatozoide humano:
una dependiente de la activacin de PKA, otra que involucra la inactivacin de
las ser/thr fosfatasas por SFK, y otra regulada por Ca 2+, entre las cuales
existiran puntos de cross-talk a diferentes niveles. Consideramos que los
resultados obtenidos contribuirn a una mayor comprensin de los
mecanismos moleculares involucrados en la adquisicin de la capacidad
fertilizante del espermatozoide, como as tambin al futuro desarrollo de
tcnicas tanto de diagnstico y tratamiento de la infertilidad como de
regulacin de la fertilidad humana.
Evidencias de la expresin de receptores de factores de crecimiento
en el espermatozoide humano. Luca Saucedo, Natalia G Buffa, Marina Rosso,
Mnica H. Vazquez Levin, Clara I. Marn Briggiler. Laboratorio de Estudios de la
Interaccin Celular en Reproduccin y Cncer, Instituto de Biologa y Medicina
Experimental (IBYME-CONICET), Buenos Aires, Argentina.

Los factores de crecimiento, y en particular los factores de crecimiento


fibroblsticos (FGFs), han sido descriptos en una amplia variedad de tejidos. Se
sabe que la sealizacin mediada por los mismos y sus receptores (FGFRs)
intervienen en numerosas funciones celulares, tales como proliferacin,
diferenciacin, adhesin, sobrevida, apoptosis, motilidad y quimiotaxis,
teniendo un rol en el mantenimiento y la remodelacin de tejidos normales, as
como en la progresin tumoral. En clulas somticas, es conocido que la
interaccin de FGFs con los FGFRs produce la fosforilacin de los receptores y
la activacin de vas de transduccin de seales, entre ellas las de MAPK/ERK,
PI3K/Akt y PLC, que llevan a la transcripcin de genes especficos. La
presencia de componentes del sistema FGFs/FGFRs ha sido descripta en el
tracto reproductor masculino y femenino, donde se les adjudic un rol en la
gametognesis y en el mantenimiento tisular; sin embargo, no hay evidencias

suficientes sobre la expresin de FGFRs en los espermatozoides ni sobre su


relevancia en la regulacin de la fisiologa espermtica. Nuestro trabajo se
centra en la caracterizacin de los FGFRs espermticos y se presentarn
resultados sobre la expresin de FGFRs tipo 1, 2, 3 y 4 en la gameta masculina
a nivel de transcripto y protena y de su activacin relacionada a la
capacitacin espermtica. Se describir la activacin de vas de transduccin
intracelulares asociadas a los FGFRs en espermatozoides expuestos al ligando
especfico y se aportarn evidencias sobre la participacin de este sistema en
el mantenimiento de la funcionalidad espermtica. Consideramos que los
hallazgos contribuirn a comprender los mecanismos moleculares de la
fisiologa espermtica. Asimismo, la caracterizacin de la sealizacin
desencadenada por FGFs y FGFRs en los espermatozoides, clulas inactivas
transcripcional y traduccionalmente, permitir ahondar en el conocimiento de
este sistema y en sus efectos no genmicos.
Compartimentalizacin de las vas de sealizacin de AMPc en
espermatozoide de mamfero. Eva Wertheimer. CEFYBO- CONICET UBA,
Buenos Aires, Argentina.
La capacidad fertilizante del espermatozoide es adquirida durante su pasaje
por el tracto femenino en un proceso conocido como capacitacin. La
capacitacin es requerida para la hiperactivacin de la motilidad y para
preparar al espermatozoide para un proceso exocittico conocido como
reaccin acrosomal. Mientras es sabido que la adenilato ciclasa soluble
dependiente de HCO3, Adcy10, juega un rol importante en la motilidad, poco se
conoce sobre el origen del cAMP en la cabeza del espermatozoide. Las
adenilato ciclasas transmembrana (tmACs)
son enzimas reguladas por
proteinas G estimulatorias (Gs) y son una posible fuente de cAMP. Sin embargo,
la presencia de Gs o tmAC en el espermatozoide de mamfero ha sido
controversial. En este trabajo, se prueba la presencia de Gs en la cabeza del
espermatozoide por medio de tcnicas de Western blot, inmunofluorescencia y
ensayos de ribosilacion de ADP dependiente de toxina colrica. Adems,
mostramos que la forskolina, un activador especifico de la tmAC, induce la
acumulacin de cAMP tanto en espermatozoides de ratones wild type como
de ratones deficientes de Adcy10. Dicha acumulacin de cAMP no es observada
en presencia del inhibidor de Adcy10, KH7, y es bloqueada por el inhibidor de
tmAC, SQ-22536. La inmunoreactividad de Gs y la actividad de tmAC son
reveladas en la cabeza del espermatozoide, mientras que PKA solo es
detectada en el flagelo, adonde tambin fue previamente localizada Adcy10.
Consistente con la localizacin acrosomal, la reactividad de Gs se pierde
cuando el espermatozoide reacciona. Es ms, forskolina es capaz de aumentar
la concentracin de Ca2+ intracelular y de inducir la reaccin acrosomal. En
conjunto, estos datos sugieren que las cascadas de sealizacin dependientes
de cAMP estn compartimentalizadas, con Gs y tmAC localizadas en la cabeza
y Adcy10 y PKA en el flagelo del espermatozoide.
Alpha4: una isoforma de la Na,K-ATPasa esencial para el
espermatozoide. Gustavo Blanco. Department of Molecular and Integrative
Physiology, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA.

El intercambio de iones entre el espermatozoide y el medio que lo rodea es


fundamental para la funcin de estas clulas. El espermatozoide posee una
isoforma especfica de la Na,K-ATPasa, el transportador inico activo de la
membrana plasmtica que intercambia Na+ intracelular por K+ del medio. Esta
variante molecular de la Na,K-ATPasa, denominada 4, se encuentra solo en
clulas germinales del testculo, donde se expresa luego del proceso de
meiosis. Na,K-ATPasa 4 abunda en el flagelo del espermatozoide, donde
predomina en la pieza media. Estudios en nuestro laboratorio demostraron que
4 exhibe propiedades bioqumicas que son diferentes a la de las otras
isoformas de la Na,K-ATPasa. De este modo, 4 posee una afinidad aparente
para los iones transportados Na+ y K+, para ATP y el inhibidor ouabana que
son especficos de esta isoforma. Debido a que Na,K-ATPasa 4 tiene una
afinidad por ouabana relativamente elevada, se puede utilizar esta propiedad
como herramienta para distinguir su funcin. Utilizando inhibicin selectiva de
4 con ouabana en espermatozoides de rata, demostramos que 4 es
imprescindible para la motilidad de estas clulas. Ms recientemente,
exploramos la funcin de Na,K-ATPasa 4 a travs de ratones transgnicos en
los cuales sobreexpresamos o anulamos la expresin de 4. Los ratones
machos homocigotas, en los que se anul 4, son totalmente estriles y los
espermatozoides extrados de estos animales no son competentes en ensayos
de fertilizacin in vitro. La ausencia de Na,K-ATPasa 4 resulta en una
reduccin severa en la motilidad espermtica. No solo la motilidad total est
alterada, sino que mltiples parmetros de movilidad celular estn afectados,
incluyendo la hiperactivacin de las clulas. Adems, los espermatozoides de
ratones sin Na,K-ATPasa 4 presentan una angulacin en el flagelo, que es
caracterstica de un desbalance osmolar en las clulas. Concomitantemente,
estos espermatozoides presentan un aumento en el Na+ intracelular. Otras
anormalidades incluyen despolarizacin de la membrana plasmtica y un
incremento en los niveles de Ca2+ intracelular. En contraposicin con esto, los
ratones que sobreexpresan Na,K-ATPasa 4 tienen un aumento en todos los
parmetros de motilidad espermtica. Estos resultados demuestran que Na,KATPasa 4 es importante para la motilidad del espermatozoide y que su
mecanismo de accin depende de la capacidad de este transportador de
controlar el potencial de membrana, pH y concentraciones de Na+ y Ca2+ en
el espermatozoide. Esto tambin demuestra la alta selectividad de las
isoformas de la Na,K-ATPasa y de que 4 es la variante molecular de este
transportador involucrado en mantener la fertilidad masculina.

Jueves 19 de Diciembre de 2013


MDULO III: NUEVOS ASPECTOS MOLECULARES Y FISIOLGICOS DE
LOS OVOCITOS DE MAMFEROS. Coordinadora: Patricia Cuasnic.
Rol esencial de los RNA pequeos durante la meiosis en ovocitos de
ratn. Paula Steina, Fabin L. Crdenasa, Nikolay V. Rozhkovb, Olga Davydenkoa, Fan
Lia, Brian D. Gregorya, Gregory J. Hannonb, and Richard M. Schultza. aDepartment of
Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA; bHoward Hughes Medical
Institute, Watson School of Biological Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, NY, USA.

La RNasa III Dicer es responsable de la biosntesis de los microRNAs (miRNAs) y


los pequeos RNAs de interferencia (siRNAs). La inactivacin de Dicer
especficamente en ovocitos de ratn resulta en infertilidad. Los ovocitos
deficientes en Dicer se detienen en la primera divisin meitica y poseen husos
meiticos desorganizados y defectos en la alineacin de los cromosomas.
Este fenotipo podra ser causado por la ausencia de los miRNAs o de los siRNAs
o de ambos. Estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio y en otro
laboratorio sugieren que la funcin de los miRNAs est suprimida en los
ovocitos de ratn, lo cual indicara que los siRNAs endgenos son responsables
del fenotipo de los ovocitos deficientes en Dicer.
Para evaluar esta posibilidad, generamos ratones conteniendo un alelo de la
protena Argonauta 2 (Ago2) catalticamente inactivo (Ago2ADH). Las protenas
Argonauta (AGO) son socias indispensables de los RNAs pequeos para
silenciar la funcin gnica. En mamferos hay cuatro protenas AGO (AGO1-4).
Si bien las cuatro pueden mediar los efectos de los miRNAs, solamente AGO2
posee actividad endonucleoltica y, por lo tanto, es esencial para la accin de
los siRNAs. Las hembras Ago2ADH, al igual que las hembras deficientes en Dicer,
poseen una morfologa ovrica normal y producen un nmero similar de
ovocitos por ratn que los controles. Sin embargo, estas hembras son infrtiles
y, como era de esperar, los siRNAs no funcionan en los ovocitos mutantes. El
anlisis de la maduracin ovocitaria, usando inmunofluorescencia e imgenes
en tiempo real, indica una progresin anormal de la meiosis, con defectos en la
primera divisin meitica. Tambin encontramos extensos cambios en el
transcriptoma de los ovocitos mutantes, incluyendo una expresin aumentada
de ciertos transposones. En resumen, nuestros estudios identifican una funcin
esencial de los siRNAs endgenos durante la meiosis en ovocitos de ratn.

Organizacin de la membrana celular de ovocitos de ratn en la


fecundacin: Cmo se comportan los rafts de membrana? Jorgelina
Buschiazzo. Laboratorio de Biotecnologa de la Reproduccin. Estacin Experimental
Agropecuaria Balcarce INTA, Buenos Aires, Argentina.

Una drstica reorganizacin de la membrana tiene lugar cuando el


espermatozoide de mamferos se une y fusiona con la membrana del ovocito.
Hasta ahora, la tetraspanina CD9 y una o varias, aun no identificadas,
protenas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI-APs) son las nicas protenas
en la membrana del ovocito que se consideran esenciales para la fecundacin.
Mientras que las tetraspaninas tienen la habilidad de asociarse lateralmente en
microdominios enriquecidos en tetraspaninas (TEM), las GPI-APs estn
enriquecidas en los rafts lipdicos, microdominios caracterizados por un alto
contenido de colesterol y esfingolpidos. En este estudio, se utiliz la metil-ciclodextrina (MCD) para modular el colesterol del ovocito de ratn y evaluar
la participacin de los rafts de membrana en la fecundacin. La remocin de
colesterol mediada por MCD caus: (1) una disminucin en el ndice y en la
tasa de fecundacin; y (2) un retraso en la emisin del segundo cuerpo polar.
La replecin de colesterol recuper la habilidad para la fecundacin de los
ovocitos previamente depletados de este lpido indicando la reversibilidad de

estos efectos. Estudios de tiempo-captura in vivo usando un anlogo


fluorescente del colesterol (BODIPY-colesterol) permitieron establecer el
momento en el cual la sonda se localiza preferentemente en la membrana
plasmtica posibilitando la estimacin del grado de deplecin de colesterol.
Confirmamos que el ovocito de ratn est enriquecido en rafts de acuerdo con
la presencia del marcador lipdico de rafts, el ganglisido GM1, en la membrana
de ovocitos vivos e identificamos la coexistencia de dos tipos de
microdominios, rafts planos y estructuras caveolares, a partir de dos protenas
diferenciales marcadoras de rafts, flotillina-2 y caveolina-1, respectivamente.
Por otra parte, mediante microscopa electrnica se visualizaron invaginaciones
tipo-caveolares en el ovocito de ratn. La disrupcin de los rafts de membrana
por deplecin del colesterol alter la localizacin subcelular de la molcula
seal c-Src mientras que, por otro lado, la inhibicin de protenas quinasas Src
impidi la emisin del segundo cuerpo polar, consistente con un rol de estas
quinasas en la fecundacin va complejos de sealizacin. En conclusin, estos
resultados destacan la importancia funcional de rafts de membrana intactos
para la fecundacin en ratn y su dependencia del colesterol.
Impacto del metabolismo de colesterol HDL sobre la biologa del
ovocito. Dolores Busso. Departamento de Nutricin, Diabetes y Metabolismo,
Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica, Santiago, Chile.

La foliculognesis ovrica culmina en la generacin de ovocitos viables y


haploides, que puedan ser ovulados y posteriormente fecundados para dar
origen a un embrin diploide. Recientemente determinamos que el contenido
de colesterol del ovocito puede modular su biologa. En el plasma sanguneo, el
colesterol es transportado por lipoprotenas, las cuales tambin se encuentran
presentes en el fluido folicular (FF). En humanos, la composicin lipdica de las
lipoprotenas de alta densidad (HDL) del FF se ha relacionado con la calidad de
los ovocitos. La homeostasis del colesterol en plasma es mantenida
principalmente por la expresin heptica del receptor Scavenger Clase B Tipo I
(SR-BI), cuya funcin es captar el colesterol transportado por las HDL (HDL-c)
desde los tejidos perifricos hacia el hgado y excretar su exceso en la bilis. En
nuestro grupo contamos con un modelo de ratn deficiente en SR-BI (SR-BI -/-)
que presenta niveles elevados de HDL-c y varias alteraciones metablicas
asociadas, tales como predisposicin a aterosclerosis, deficiencia adrenal y
defectos en la maduracin de los eritrocitos. Hace ya varios aos se demostr
que las hembras SR-BI-/- son infrtiles debido a una mayor labilidad de los
ovocitos y a la incapacidad de generar embriones ms all del estadio de dos
clulas. La infertilidad en las ratonas SR-BI -/- se debe al un defecto metablico
general de las HDL, ya que el transplante de ovarios SR-BI -/- en hembras
silvestres (con HDL normales) re-establece la fertilidad. Recientemente
describimos por primera vez cuales son los defectos en los ovocitos de las
ratonas SR-BI-/-. En primer lugar, observamos que los ovocitos SR-BI -/- presentan
un nivel elevado de colesterol comparado con los ovocitos silvestres,
determinado por fluorescencia usando filipina, un marcador fluorescente
especfico de colesterol. Segundo, un porcentaje significativo de los ovocitos
SR-BI-/- exhiben activacin espontnea in vitro, es decir un defecto en el arresto
en MII propio de los ovocitos silvestres luego de la ovulacin. Y finalmente, el

tratamiento de los ovocitos SR-BI-/- con SrCl, un agente que induce activacin,
induce su muerte. En conjunto, el fenotipo de los ovocitos SR-BI -/- sugiere que el
exceso de colesterol puede alterar la cronologa de la meiosis y de alguna
manera llevar a la muerte de los ovocitos. Apoyando esta hiptesis, cuando
ovocitos ovulados obtenidos de ratones C57BL/6 silvestres son cargados con
colesterol in vitro mediante el tratamiento con ciclodextrina-colesterol estos se
activan y luego mueren, actuando como fenocopias de los ovocitos SR-BI -/-. Por
otra parte, el tratamiento de los ovocitos SR-BI -/- con ciclodextrina, que remueve
colesterol de las clulas, los protege de la muerte inducida por SrCl.
Recientemente otros autores reportaron que la remocin de colesterol de
ovocitos silvestres con niveles elevados de ciclodextrina induce un retardo en
la extrusin del segundo cuerpo polar y una reduccin de su capacidad
fertilizante. En conjunto, los antecedentes descriptos sugieren que el contenido
de colesterol en los ovocitos debe ser mantenido dentro de un rango fisiolgico
relativamente estrecho para asegurar su viabilidad y su potencial de generar
un embrin. Esta evidencia resulta interesante en particular dada su potencial
aplicacin clnica, ya que anormalidades en el metabolismo del colesterol
podran ser la base de algunos casos de infertilidad femenina humana de
etiologa desconocida.
La fertilizacin induce una exposicin transitoria de fosfatidilserina en
el ovocito de ratn. Claudio A. Curia1, Juan I. Ernesto1, Paula Stein2, Dolores
Busso3, Richard M. Schultz2, Patricia S. Cuasnicu1 y Dbora J. Cohen1.1IBYME-CONICET,
Buenos Aires, Argentina; 2Department of Biology, University of Pennsylvania,
Philadelphia, PA; 3Departamento de Nutricin, Diabetes y Metabolismo, Facultad de
Medicina, Pontificia Universidad Catlica, Santiago, Chile.

El fosfolpido fosfatidilserina (PS) se localiza normalmente en la cara interna de


la bicapa lipdica y en los ltimos aos se ha demostrado que su translocacin
a la cara externa de la bicapa es necesaria en distintos procesos celulares
diferentes a la apoptosis. En el presente trabajo hemos investigado la
ocurrencia de movilizacin de PS en ovocitos de ratn, los cuales expresan, de
acuerdo a ensayos de RT-PCR, la flipasa Atp8a1 y las escramblasas Plscr1 y 3,
enzimas responsables de la distribucin de PS en la membrana celular. Hemos
observado que luego de la fertilizacin o de la activacin partenogentica
inducida por tratamiento con SrCl2, los ovocitos presentan un importante
aumento en la unin de Anexina 5 fluoresceinada, la cual se une
especficamente a PS, respecto de los ovocitos no fertilizados. Este aumento en
la marcacin fluorescente no se observa cuando los ovocitos son previamente
tratados con el quelante intracelular de Ca 2+ BAPTA-AM, indicando que es
necesario un aumento en la concentracin intracelular de Ca 2+ para la
exposicin de PS. La fluorescencia se observa en toda la superficie del ovocito
con excepcin de las regiones que recubren en huso meitico y el sitio de
entrada del espermatozoide. La exposicin de PS tambin es observada en
ovocitos activados provenientes de hembras deficientes para la enzima
CaMKII (KO), los cuales no pueden salir del arresto en metafase II a pesar de
presentar oscilaciones de Ca2+ normales. Por el contrario, la exposicin de PS
no se observa en ovocitos activados con el quelante de Zn 2+ TPEN, los cuales
salen del arresto meitico en ausencia de liberacin de Ca2+. La exposicin de
PS tambin se observa cuando los ovocitos son activados con etanol, pero no

as cuando son activados con ionforo de Ca 2+, sugiriendo que la fuente y


concentracin citoplasmtica de Ca2+ son relevantes para la movilizacin de
PS. Finalmente, el tratamiento de los ovocitos con cytochalasin D, que
desorganiza los microfilamentos de actina, o con jasplakinolide, que estabiliza
microfilamentos, previamente a la activacin muestra que la externalizacin de
PS en un proceso dependiente de actina. En resumen, el aumento de Ca2+ que
ocurre durante la activacin del ovocito induce una exposicin transitoria de PS
en los ovocitos fertilizados que no est asociada a apoptosis.
Anlisis molecular de la reaccin cortical en ovocitos de ratn. Marcela
A. Michaut. Laboratory of Reproductive Biology-IHEM-CONICET, Mendoza, Argentina.

En mamferos, el mecanismo primario para prevenir la fecundacin


poliesprmica involucra la exocitosis de grnulos corticales, tambin conocida
como reaccin cortical.
Varios estudios han sugerido que este proceso exoctico es una va de
sealizacin mediada por las protenas SNAREs; sin embargo, la caracterizacin
molecular de la exocitosis de grnulos corticales todava es incompleta.
Nosotros hipotetizamos que el ovocito utiliza la misma maquinaria conservada
de fusin de membranas que las descriptas en neuronas y espermatozoides
humanos. Asimismo, hipotetizamos que el complejo regulatorio SNAP/NSF est
presente en ovocito de ratn y participa en la fusin de los grnulos corticales
con la membrana plasmtica durante la reaccin cortical. Para ello,
investigamos la expresin de las isoformas SNAP: , , y , y NSF por RT-PCR.
Los resultados mostraron que slo - y -SNAP se expresan en ovocitos de
ratn como as tambin NSF.
El anlisis por Western blot indic que estas protenas estn presentes durante
la maduracin y la activacin ovocitaria y no presentan variaciones entre los
diferentes estadios analizados. El estudio de la inmunolocalizacin demostr
que -SNAP y NSF localizaron principalmente en la regin cortical de dichos
estadios. Si bien -SNAP tiene una distribucin similar a la de -SNAP, esta
protena tambin mostr una distribucin citoplasmtica tanto en ovocitos
inmaduros como en estadios postactivacin. Todas las protenas identificadas:
-SNAP, -SNAP, y NSF fueron predominantemente observadas en la regin
cortical, la cual est enriquecida en grnulos corticales en el estadio de ovocito
maduro, sugiriendo que estas protenas pueden estar involucradas en la
exocitosis de grnulos corticales. Esto fue confirmado parcialmente, ya que la
microinyeccin
de
un
anticuerpo
especfico
anti--SNAP
inhibi
significativamente la exocitosis de grnulos corticales en un ensayo funcional.
No obstante, ms estudios son necesarios para corroborar la participacin de
NSF y dilucidar si -SNAP y -SNAP son igualmente importantes para la
reaccin cortical o tienen diferentes funciones en la fisiologa del ovocito.
Novel aspects of Ca2+ homeostasis in mouse oocytes and eggs. Rafael
Fissore. Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Massachusetts,
USA.

In oocytes and eggs, regulation of intracytoplasmic Ca2+ levels is required for


maturation and fertilization. In the case of maturation, Ca2+ store content,

Ca2+ ER levels, increase and this increase is required for egg activation.
Likewise, after fertilization, the persistence of oscillations requires
replenishment of Ca2+ ER levels. Curiously, filling or refilling of Ca2+ ER
requires external Ca2+, although how Ca2+ enters oocytes and eggs is
presently unknown. In this presentation, we will describe some of the changes
that occur in Ca2+ homeostasis in oocytes and eggs during maturation and
fertilization. We will provide evidence how Ca2+ ER levels are impacted by
Ca2+ oscillations and how different agonists impacts Ca2+ homeostasis
differently. Lastly, will show how alteration of Ca2+ homeostasis compromises
both oocyte maturation and initiation of development.
MDULO IV: MECANISMOS MOLECULARES Y FISIOLOGA ESPERMTICA
II. Coordinadora: Mnica Vazquez-Levin.
Diacilglicerol, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato y cido fosfatdico: lpidos
esenciales en la exocitosis acrosomal. Silvia A. Belmonte. Laboratorio de
Biologa Celular y Molecular, IHEM-CONICET, Mendoza, Argentina.

La reaccin acrosomal (RA) es la exocitosis calcio dependiente de la nica


vescula secretoria del espermatozoide, el grnulo acrosomal, que rodea al
ncleo como un capuchn apical. Es absolutamente requerida para la
penetracin de la zona pelcida del ovocito y por lo tanto, para la fertilizacin.
El mecanismo molecular de la RA es complejo y est sujeto a una fina
regulacin. En etapas tempranas del proceso, glicoprotenas de la zona
pelcida causan un aumento inicial y transitorio de calcio citoslico que
finalmente lleva a la apertura de canales operados por reservorio en la
membrana plasmtica. Esto eleva la concentracin de calcio en forma
sostenida disparando la exocitosis. Nuestro grupo ha integrado y relacionado
protenas indispensables para la exocitosis acrosomal con molculas lipdicas
que afectan la fusin de membranas y ha demostrado una cooperacin
funcional entre las mismas. Para que ocurra la RA se deben activar dos vas de
sealizacin luego de la apertura de los canales de calcio operados por
reservorio: a) una que conduce a la sntesis de inositol-1,4,5-trifosfato (IP 3) y
salida de calcio del acrosoma, y b) otra que conduce a la activacin de la
GTPasa Rab3A y posterior ensamble de las SNAREs (SNAP Receptors).
Recientemente, hemos publicado que el diacilglicerol (DAG) promueve la
exocitosis acrosomal en espermatozoides humanos permeabilizados induciendo
un ciclo de retroalimentacin positiva, dependiente de la activacin de PKC y
PLD1, que provee fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) continuamente durante el
proceso exoctico. El PIP2 producido es requerido para incrementar la sntesis de
IP3 y promover la salida de calcio del acrosoma. DAG, adems, activa Rab3A,
quien inicia una cascada de interaccin de protenas que conduce finalmente al
ensamble de los complejos SNAREs, acercamiento y fusin de membranas.
Dada la intervencin de PLD1 en esta cascada, es necesario destacar que la
funcin del cido fosfatdico (PA), producto de su actividad enzimtica, es
fundamental en este ciclo porque acta modificando la curvatura de las
membranas y activando la fosfatidilinositol 4-fosfato 5-kinasa (PI4P5K) que
cataliza la sntesis de PIP2 a partir de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI4P) y ATP.
Hemos demostrado la existencia y requerimiento de esta quinasa en la

exocitosis acrosomal. Nuestros resultados indican que el ciclo de


retroalimentacin positiva iniciado por DAG est regulado por la pequea
GTPasa monomrica, ARF6, que promueve la exocitosis por regular el
contenido de PA y PIP2 de las membranas. Concluimos que los lpidos no solo
constituyen los componentes estructurales de las membranas sino que
participan activamente en el proceso de fusin de las mismas cumpliendo un
rol especfico.
Nuevos conceptos sobre la exocitosis acrosomal. Aspectos
moleculares y celulares. Mariano Buffone. Biologa Celular y Molecular de la
Reproduccin, IBYME-CONICET, Buenos Aires, Argentina.

Los espermatozoides de mamfero adquieren capacidad fecundante durante su


paso por el tracto femenino en un proceso denominado capacitacin
espermtica. Durante este proceso, el espermatozoide adquiere la capacidad
de realizar la exocitosis acrosomal que permite penetrar la zona pellucida
(matriz extracelular que rodea al ovocito). Uno de los dogmas centrales del
proceso de fertilizacin en mamferos, postula que los espermatozoides
intactos se unen a la zona pellucida del ovocito, y que esta interaccin gatilla
el comienzo de la exocitosis acrosomal. Sin embargo, utilizando un modelo de
animales transgnicos, se demostr claramente que el espermatozoide que es
capaz de fertilizar el ovocito es aquel que realiz la exocitosis acrosomal previo
a la interaccin con la ZP. Es por ello que actualmente, no se conoce cul es el
sitio donde el espermatozoide realiza la exocitosis acrosomal y, por ende, cul
sera el o los estmulos fisiolgicos que la inducen. Dado que la exocitosis
acrosomal no se produca por la interaccin con la ZP, evaluamos la posibilidad
de que esta se est produciendo en el pasaje a travs de las clulas del
cumulus.
Sin
embargo,
sorprendentemente
no
hemos
encontrado
espermatozoides que realicen la exocitosis acrosomal y que eventualmente,
fertilicen al ovocito en las vecindades de las clulas del cumulus. Utilizando los
espermatozoides con EGFP en los acrosomas, hemos observado que los
espermatozoides que se encuentran en distintas reas del oviducto no han
sufrido la reaccin acrosomal, excepto en la regin cercana a la ampulla, previo
a la penetracin del complejo cumulus-ovocito. El 100% de los
espermatozoides acceda a esa rea luego de haber sufrido la reaccin
acrosomal. Debido a este nuevo marco de resultados, la progesterona, que ha
sido postulada como uno de los inductores fisiolgicos de la reaccin acrosomal
ha tomado nuevamente relevancia como potencial estimulo de la exocitosis
acrosomal espermtica. Sin embargo, para poder observar niveles
significativos de reaccin acrosomal, hemos incubado los espermatozoides por
4 h y sorprendentemente, se observ una redistribucin de la protena
acrosomal EGFP hacia la zona ecuatorial. Este fenmeno no se da cuando los
espermatozoides son incubados en condiciones no capacitantes. Los
espermatozoides con este patrn, tienden a reaccionar ante el estmulo de
progesterona con mayor facilidad. En resumen, la utilizacin de modelos
transgnicos para monitorear la exocitosis acrosomal in vivo es importante
para poder dilucidar las implicancias fisiolgicas de este proceso.

Mecanismos moleculares y vas de transduccin de seales que


gobiernan la exocitosis del acrosoma. Claudia Tomes. Laboratory of Fusion
and signaling molecules involved in sperm exocytosis, IHEM, CONICET, Mendoza,
Argentina.

El acrosoma es un grnulo secretorio de gran tamao ubicado en la regin


anterior de la cabeza de los espermatozoides maduros de mamferos. En
respuesta a estmulos fisiolgicos o farmacolgicos, sufre un tipo especial de
exocitosis regulada denominada reaccin acrosomal (RA); este fenmeno es un
prerequisito esencial para la fertilizacin del ovocito. Morfolgicamente, la RA
procede a travs de una serie de estados que comienzan con el hinchado del
contenido acrosomal, el cual empuja la membrana acrosomal externa (la
porcin ms prxima a la membrana plasmtica) hacia la periferia de la clula
hasta formar aposiciones con la membrana plasmtica, un fenmeno definido
como anclado (del ingls, docking); posteriormente se abren poros de fusin
entre ambas membranas en estas zonas de contacto estrecho, estos poros
conectan directamente el interior del acrosoma al medio extracelular. En este
momento comienza la liberacin del contenido acrosomal, eventualmente toda
la matriz se dispersa y la membrana acrosomal interna se convierte en la
nueva membrana celular. Molecularmente, los pasos finales de la exocitosis
requieren una maquinaria proteica de fusin muy conservada que incluye
miembros de las familias Rab y SNAREs as como molculas que interactan
con ellas. Adems, para completarse exitosamente la RA necesita sntesis de
cAMP y su accin sobre Epac, un factor intercambiador de nucletidos de
guanina (GEF) para la GTPasa monomrica Rap. Por ltimo, la exocitosis del
acrosoma depende de dos fuentes de calcio: el que ingresa del medio
extracelular y el que se moviliza de reservorios intracelulares sensibles al IP 3
(principalmente el acrosoma); la primera fuente se puede bypassear
farmacolgicamente, pero la segunda no. En nuestro laboratorio utilizamos
abordajes bioqumicos y morfolgicos, estos ltimos por microscopa de
fluorescencia y electrnica de transmisin. Adems hemos desarrollado dos
mtodos que se aplican a ensayos funcionales: la permeabilizacin controlada
de la membrana plasmtica con estreptolisina O y el cargado de
espermatozoides con protenas permeables que atraviesan la membrana
plasmtica por un mecanismo conocido como "protein transduccion".
Rol del canal de K+ SLO3 en la regulacin del potencial de membrana y
en la fisiologa del espermatozoide. Celia M. Santi. Washington University,
School of Medicine, USA.
Los canales inicos juegan un rol fundamental en la determinacin del
potencial de membrana de los espermatozoides, el cual a su vez afecta
aspectos esenciales de la funcin espermtica como ser la capacitacin, la
hiperactivacin y la reaccin acrosomal (RA). Recientemente hemos
demostrado que la ausencia del canal selectivo a K + (SLO3) produce infertilidad
masculina en los roedores sin afectar la produccin de espermatozoides ni su
morfologa y motilidad iniciales. El canal SLO3 es un canal de K + de alta
conductancia perteneciente a la familia de los canales SLO que se expresa
solamente en espermatozoides y se activa por depolarizacin del potencial de

membrana y alcalinizacin intracelular. La hiperpolarizacin del potencial de


membrana es un evento clave tanto en la capacitacin como en la reaccin
acrosomal. Mediante el uso de colorantes sensibles al voltaje hemos
demostrado que la activacin de los canales SLO3 es la principal responsable
de la hiperpolarizacin del potencial de membrana de los espermatozoides
asociada a dos eventos: 1) la capacitacin 2) la alcalinizacin del medio
extracelular. En ambos casos la activacin de los canales SLO3 probablemente
responde a un aumento del pHi. Modelando nuestros datos con la ecuacin de
Goldman-Hodgkin-Katz encontramos que la permeabilidad al K + a travs de
SLO3 aumenta 3 veces durante la capacitacin y 5 veces cuando los
espermatozoides no capacitados se incuban en un medio alcalino (pH =8),
mientras que las permeabilidades al Na + y al Cl- se mantienen prcticamente
incambiadas. Nuestros resultados muestran que los espermatozoides
provenientes de los ratones nulos para SLO3 estn depolarizados y presentan
dficits en la hiperactivacin y RA, probablemente por una disminucin del
gradiente electroqumico del Ca2+ y consecuentemente del influjo de Ca2+.
Dicha hiperpolarizacin es independiente de otros procesos asociados a la
capacitacin como ser la fosforilacin en tirosina y la disminucin de la
concentracin de Na+ intracelular.
Experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio indican que en el
bovino, al igual que en el ratn, los espermatozoides se hiperpolarizan durante
el proceso de capacitacin y cuando se incuban en un medio alcalino. Dicha
hiperpolarizacin parece ser tambin dependiente de la presencia del canal de
K+ SLO3. Estos hallazgos sugieren que la regulacin del potencial de
membrana a travs de SLO3 es un mecanismo conservado en espermatozoides
de mamfero. Revelar los mecanismos de regulacin del potencial de
membrana relevantes en la fisiologa del espermatozoide, ya sea estn o no
conservados en las diferentes especies de mamfero, puede conducir a un
mayor xito reproductivo en humanos, y a su vez abrir las puertas a nuevos
mtodos anticonceptivos.
Crosstalk between Ca2+ and cAMP pathways during sperm
capacitation. Pablo E. Visconti. Department of Veterinary and Animal Sciences,
University of Massachusetts, USA.

Mammalian sperm become fertilization competent in the female tract in a


process known as capacitation. This process is correlated with functional
changes in sperm parameters such as the activation of sperm motility known
as hyperactivation and the preparation to undergo a physiologically induced
acrosome reaction. Taking into consideration the highly differentiated and
compartmentalized nature of sperm, it can be postulated that the molecular
basis of capacitation should account for independent changes occurring in
different sperm compartments such as the flagellum (e.g. hyperactivation) and
the head (e.g. preparation for the acrosome reaction). At the molecular level,
capacitation is associated with the activation of a PKA-dependent
phosphorylation cascade and with hyperpolarization of their membrane
potential. It has been shown in multiple species that activation of PKA is
needed for hyperactivation and to prepare the sperm for the acrosome
reaction. Capacitation is also associated with the increase in intracellular Ca2+
concentrations. There is a crosstalk between the cAMP and the Ca2+ pathway.
On one hand Ca2+ regulates cAMP synthesis and also its degradation. On the

other hand, cAMP and PKA are upstream of the increase in Ca2+ needed for
hyperactivation.