UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

QUMICO FARMACUTICO Y BILOGO

TESIS

DETERMINACIN DE IONES Ca++ MEDIANTE EL

MTODO DE ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN
ATMICA (EAA) EN CPSULAS DE ALGINATO

PRESENTA
OSCAR FLORES CASTAOS

DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL

DRA. MA. TERESA GONZLEZ ARNAO

ORIZABA, VER.

DICIEMBRE, 2010

AGRADECIMIENTOS
"Hoy es un gran da, porque se avanza un peldao ms en esta escalera que es la vida, pero no sin pensar que todo
termina aqu al contrario la vida continua y tal vez vengan tiempos muy difciles, con aciertos y desaciertos, pero
esperando saber campear esos temporales con sabidura, paciencia e inteligencia. Este nuevo paso que se da, brindara
las armas necesarias para poder aprovechar las oportunidades que proporcione la vida y adems, seguirse superando
como persona. Teniendo siempre presente que: "EL CONOCIMIENTO SE APRENDE POR MEDIO DEL ESTUDIO, Y LA
SABIDURIA POR MEDIO DE LA OBSERVACION".
A mis padres:
Quienes con ilusiones, sueos y esperanzas, lo dejaron todo, para dar a sus hijos lo necesario para poder crecer como
personas de bien, a quienes a pesar de los problemas supieron mantener a la familia unida, por eso y muchas cosas ms,
hago ms suyo que mo este triunfo, porque son ellos los que me brindaron las herramientas y la inspiracin para
continuar.
A mis hermanos:
Quienes compartieron conmigo un largo camino, con aciertos y desaciertos que nos proporciona la vida, pero siempre
sonriendo y proporcionndome el apoyo que aunque no se los peda, ellos me brindaban sabiendo que lo necesitaba.
A mis tos:
Quienes sin mencionar nombres, saben quines son, a ellos quienes con su apoyo, logro demostrarles que la confianza
que depositaron en m, me encuentro escribiendo esto para ellos.
A la Dra. Tere
Quien sin conocerme me brindo la confianza que de alguna forma trate de no perder, a ella que me brinda todo su
apoyo hasta altas horas de la tarde, a ella que siempre se encontraba trabajando y siempre encontr el momento para
orientarme.
A todos ustedes GRACIAS

ndice General
Pagina
INDICE DE FIGURAS

i.

INDICE DE TABLAS

ii.

I.

INTRODUCCION

1.1 Planteamiento del problema

1.2 Justificacin

II.

OBJETIVOS

III.

HIPTESIS

IV.

MARCO TERICO
4.1 Proceso de crioconservacin

11

4.2 Encapsulamiento

13

4.3 Alginatos

14

4.4 Estructura qumica de los alginatos.

15

4.5 Propiedades fisicoqumicas de los alginatos

17

4.6 Propiedades mecnico-estructurales de los alginatos

19

4.7 Geles de alginato

21

4.8 Mecanismo de formacin de los geles de alginato de calcio

22

4.9 Mtodos de liberacin

24

4.10

26

Mtodo analtico para la determinacin de elementos

metlicos o metaloides
4.11
V.

Espectroscopia de absorcin atmica en flama

26

MATERIALES Y METODOS
5.1 Preparacin de soluciones para la encapsulacin

30

5.1.1

Alginato de sodio

30

5.1.2

Cloruro de calcio

30

5.2 Obtencin y estandarizacin de las cpsulas de alginato de calcio

por peso.
5.3 Tratamientos de las cpsulas en medio lquido con altas
concentraciones de sacarosa.
5.4 Preparacin de las muestras de cpsulas de alginato de calcio
para el anlisis de absorcin atmica.
5.5 Determinacin de calcio por espectrofotometra de absorcin
atmica (EAA)
5.6 Cuantificacin de calcio por espectrofotometra de absorcin
atmica (EAA)
5.6.1 Elaboracin de curva de calibracin
5.6.2

VI.

Condiciones de trabajo en el equipo de absorcin atmica

GBC 932 AA

31
32
32
33
34
34
35

RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Efecto del tiempo de gelificacin en la concentracin de calcio de

37

cpsulas de alginato.
6.2 Efecto del tratamiento de precultivo en medio lquido

38

suplementado con sacarosa, en la concentracin de calcio de

cpsulas de alginato obtenidas a diferentes tiempos de
gelificacin.
6.3 Valoracin de la implementacin de la tcnica de absorcin

42

atmica para la determinacin de calcio en cpsulas de alginato.

VII.

VIII.

IX.

CONCLUSIONES

44

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

45

ANEXOS

50

ndice de Figuras

Figura

Descripcin

Pgina

Modelo de caja de huevos propuesta por Grant

22

Representacin esquemtica de la asociacin de las secuencias

23

poliglucornicas por quelacin por calcio

3

Componentes de equipo de espectrofotmetro de absorcin

27

atmica
4

Representacin grfica del contenido de Ca++ en cpsulas

38

gelificadas por tiempos diferentes

5

Efecto del tiempo de gelificacin de las cpsulas de alginato y de la

41

concentracin de sacarosa en el medio de precultivo sobre el peso

seco (Ps).
6

Efecto de la concentracin de sacarosa en el medio de precultivo

sobre el contenido de Ca++ de las cpsulas de alginato. ND: No
determinado.

41

ndice de Tablas

Tabla

Descripcin

Pgina

Porcentaje de cido mannurnico (M), glucornico (G), relacin

16

M/G y contenido de alginato (%), para varias especies comerciales

de algas pardas
2

Efecto del tiempo de gelificacin en la concentracin de calcio en

37

cpsulas de alginato
3

Efecto

del

precultivo

en

medio

lquido

con

diferentes

concentraciones de sacarosa (0.06, 0.5, 0.75 y 1M) , en el contenido

de calcio en cpsulas de alginato a diferentes tiempos de gelificacion
(10, 20, 30 y 60min). ND. No determinado

39

I. INTRODUCCIN

Introduccin

La tecnologa de la semilla sinttica, la cual consiste bsicamente en el encapsulado de un

explante meristemtico para su propagacin, nace como respuesta a la urgencia de
establecer mtodos que reduzcan costos y tiempo en la etapa de aclimatizacin a
condiciones in vivo de los materiales provenientes de laboratorio. La semilla sinttica
combina por un lado las ventajas de la reproduccin asexual tales como: multiplicacin de
poblaciones idnticas y crecimiento acelerado, con las ventajas de la reproduccin sexual o
por semilla: fcil manipulacin, capacidad de almacenaje, proteccin del explante, entre
otras.

Esta tecnologa aumenta la proteccin del material vegetal y facilita su manipulacin, por
otra parte, la tecnologa de las semillas sintticas es utilizada tambin para la conservacin
a largo plazo o crioconservacin, debido a que facilita la manipulacin y aumenta la
proteccin de los materiales. La crioconservacin consiste en la preservacin de cualquier
material vivo a temperaturas ultrabajas, realizado en nitrgeno lquido (-196 C). Esta es la
nica forma conocida de conservacin a largo plazo para las especies vegetales que se
propagan vegetativamente o que producen semillas recalcitrantes (Abdelnour, 2001). Como
procedimiento posee numerosas ventajas tales como: estabilidad gentica del material,
implementacin en espacio reducido, bajos costos y poca peligrosidad.

Los materiales usados para el encapsulamiento deben de cumplir con la funcin de

proteccin fsica del sistema biolgico y pueden adems contemplar la existencia de
nutrientes, antibiticos, funguicidas y microorganismos. Redenbaugh y colaboradores a
comienzos de los ochentas, y despus de diversos estudios con compuestos prominentes,
determinaron que los hidrogeles de alginato de calcio, llegaban a poseer las mejores
caractersticas (Artola, 2002; Nieves, 2000; Rodrguez, 2000). El encapsulamiento con base
en este compuesto qumico, suministra una proteccin adecuada para el tejido vegetal,
gracias a que posee una dureza idnea (Artola, 2002).

La formacin de cpsulas sintticas se logra por gotear la solucin de alginato de sodio con
o sin el material vegetal a encapsular, sobre una solucin de sal de calcio. La incubacin de

Introduccin

las cpsulas de 20 a 30 minutos, en esta ltima solucin, es necesaria para inducir una
constitucin apropiada (Muniswamy, 2000; Redenbaugh, 1990; Rodrguez, 2000).

La tcnica criognica de encapsulacin/deshidratacin se basa en la tecnologa desarrollada

para la produccin de semillas sintticas (Redenbaugh, 1993). La crioconservacin de
pices, embriones somticos o pequeos embriones cigticos bajo este procedimiento,
contempla la encapsulacin del material vegetal en la matriz de alginato, su tratamiento en
medio lquido con altas concentraciones de sacarosa, la deshidratacin parcial bajo la
corriente de aire de una cabina de flujo laminar o utilizando gel de slice, hasta alcanzar un
contenido de humedad en las cpsulas prximo al 20% y finalmente la congelacin en
nitrgeno lquido la cual suele ser por lo regular de forma rpida mediante la inmersin
directa a -196C (Engelmann, f. 1997). La reactivacin del crecimiento del material
crioconservado generalmente es rpida y directa, sin formacin de callo.

Sin embargo, el tiempo de gelificacin durante el proceso de elaboracin de las capsulas de

alginato de calcio, puede influir en los fenmenos de difusin de masas, en la concentracin
del ion calcio atrapado en la matriz de alginato y repercute en la consistencia de la cubierta
sinttica que los tejidos deben atravesar para su desarrollo posterior durante la etapa de
recuperacin.

El estudio por mtodos analticos del efecto del tiempo de gelificacin puede brindar
informacin de utilidad sobre el proceso de encapsulacin. La espectroscopia por absorcin
atmica (EAA) es una forma modificada de fotometra de llama. La radiacin de una fuente
de luz espectral de un elemento especfico pasa a travs de una muestra que ha sido
disociada trmicamente en tomos y se mide la atenuacin de la intensidad de la radiacin
debido a la absorcin. La atenuacin de la intensidad es una medida de la concentracin del
metal respectivo en la muestra.

La espectroscopia de absorcin atmica se ha usado para analizar trazas de muestras

geolgicas, biolgicas, metalrgicas, vtreas, cementos, aceites para maquinaria,

Introduccin

sedimentos marinos, farmacuticas y atmosfricas, ya que es posible determinar ms de 70

elementos con ms exactitud que la fotometra de flama que ha sido desplazada casi
completamente por la implementacin de este nuevo mtodo de anlisis .

Por esta razn, para poder evaluar la cintica del proceso de encapsulacin con respecto a la
concentracin de calcio, la EAA presenta la mejor opcin para el anlisis con respecto al
tiempo de gelificacin, ya que es una tcnica demasiado sensible detectando mnimas
variaciones con respecto a las concentraciones que se presenten en las capsulas preparadas
con alginato.

Planteamiento del problema y justificacin

1.1 Planteamiento del problema

Los alginatos son uno de los polmeros ms utilizados en la encapsulacin, con base en este
compuesto qumico, suministra una proteccin adecuada para el tejido vegetal, gracias a
que posee una dureza idnea dependiendo del tiempo en que permanezca dentro de la
solucin de cloruro de calcio que aparentemente es el responsable de la consistencia del
mismo y adems, confiere un ambiente adecuado para la transferencia de masas por
osmosis durante su posterior recuperacin. Sin embargo, se desconoce si el tiempo de
gelificacin influye en este tipo de proceso, es decir, en el tamao del poro, la rigidez, la
osmosis y las condiciones que se requieren para la recuperacin de tejidos encapsulados y
que stos puedan romper la cubierta sinttica y as emerger y desarrollar una nueva planta.

1.2 Justificacin
Existen tcnicas criognicas, que ocupan la encapsulacin en alginato de calcio como
medio de proteccin de los tejidos vegetales que se desean almacenar en nitrgeno lquido a
largo plazo, sin embargo, no existen estudios previos, relativos al proceso de gelificacin
durante la formacin de las capsulas y por consiguiente al evento de la encapsulacin de los
tejidos.

Con el desarrollo de esta investigacin se pretende aportar informacin de corte bsico,

referente al proceso de gelificacin, que tiene lugar durante la encapsulacin de tejidos
vegetales sometidos al procedimiento criognico de encapsulacin-deshidratacin, en
capsulas de alginato de calcio.

II. OBJETIVOS

Objetivos

Objetivo general

Estudiar el proceso de gelificacin en capsulas de alginato de calcio utilizando la tcnica de

espectroscopia de absorcin atmica (EAA) asociado al procedimiento criognico de
encapsulacin/deshidratacin.

Objetivos particulares

Evaluar la cintica del proceso de encapsulacin por EAA, determinando el

contenido de calcio en capsulas de alginato obtenidas a diferentes tiempos de
gelificacin.

Determinar por EAA el contenido de calcio en capsulas obtenidas a diferentes

tiempos de gelificacin y sometidas al tratamiento de precultivo en medio lquido
suplementado con sacarosa a diferentes concentraciones.

III. HIPTESIS

Hiptesis

El proceso osmtico de penetracin de solutos a las cpsulas de alginato sometidas al

precultivo en medio lquido suplementado con sacarosa, reduce el contenido de calcio por
el incremento de los slidos totales.

IV. MARCO TERICO

Marco terico

4.1 Proceso de crioconservacin

El cultivo de tejidos vegetales es una rama ms desarrollada de la biotecnologa. Esta
disciplina incluye un conjunto de tcnicas de cultivo in vitro, donde se le proporciona a un
explante (seccin de hoja, raz, brote, meristema u otras) las condiciones ideales, tanto
nutricionales como fsicas, para que alcance un desarrollo ptimo y se pueda establecer
entonces, la multiplicacin clonal (Artola, 2002; CIAT, 1991; Dixon, 1991; George y
Sherrington, 1984; Hartmann y Kester, 1987).

La aplicacin de las tcnicas de cultivo in vitro para la propagacin de germoplasma, parte

de la necesidad de introduccin de materiales a condiciones aspticas, y luego de la
multiplicacin de este material dentro del laboratorio, que termina el ciclo con la
aclimatizacin a condiciones nuevamente in vivo. Para garantizar la sobrevivencia del
material proveniente de laboratorio, es necesario practicar ciertos cuidados en la etapa de
acondicionamiento a condiciones de invernadero o in vivo, adems, esta etapa del cultivo
de tejidos requiere de un tiempo considerable de adaptacin a las nuevas condiciones
ambientales.

La tecnologa de la semilla sinttica, consiste bsicamente en el encapsulado de un explante

para su propagacin, nace como respuesta a la urgencia de establecer mtodos que reduzcan
costos y tiempo en la etapa de aclimatizacin a condiciones in vivo de los materiales
provenientes de laboratorio. La semilla sinttica combina por un lado las ventajas de la
reproduccin asexual tales como: multiplicacin de poblaciones idnticas y crecimiento
acelerado, con las ventajas de la reproduccin sexual o por semilla: fcil manipulacin,
capacidad de almacenaje, proteccin del explante, entre otras (Navarro, 2002).

Por otra parte, est tecnologa es utilizada tambin para la conservacin a largo plazo o
crioconservacin de clulas y tejidos vegetales, debido a que facilita la manipulacin y
aumenta la proteccin del sistema biolgico. La crioconservacin consiste en la
preservacin

de

cualquier

material

vivo

temperaturas

ultrabajas,

realizado

11

Marco terico

preferentemente en nitrgeno lquido (-196 C). Esta es la nica forma conocida de

conservacin a largo plazo para ciertas especies de plantas que no producen semillas, o
cuyas semillas no pueden ser almacenadas en bancos por presentar un comportamiento
recalcitrantes o de aquellos materiales que usualmente se propagan vegetativamente
(Abdelnour, 2001). Como procedimiento posee numerosas ventajas tales como: estabilidad
gentica del material, implementacin de un mtodo seguro de almacenamiento en espacios
reducidos, a bajos costos y con poca peligrosidad.

Las semillas naturales tienen, en su mayora, un contenido de humedad bajo, un

metabolismo a nivel reducido y no presentan actividad aparente de crecimiento sino hasta
la germinacin. La semilla sinttica mantiene muchas de estas caractersticas, pero adquiere
otras nuevas gracias a su naturaleza de propagacin vegetativa (Hartmann y Kester, 1987).

Inicialmente los investigadores utilizaron el concepto de semilla sinttica desde un punto de

vista estricto, definiendo a esta aplicacin, como la ingeniera de los embriones somticos,
donde es utilizado el encapsulamiento como forma de propagacin. No obstante, en la
actualidad esta definicin ha sido revolucionada debido a la posibilidad del encapsulado de
otros tejidos con capacidad meristemtica (Artola, 2002; Muniswamy et al, 2000).

La tecnologa de la semilla sinttica (TSS) se define como el revestimiento de cualquier

material vegetal meristemtico tal como: embriones somticos, meristemas, brotes o
microestacas. El revestimiento debe constar de dos partes: una lmina externa la cual
fortalece y protege la semilla y una solucin interna con nutrientes requeridos por el
explante para su desarrollo (endospermo artificial). Por lo general esta solucin interna
contiene reguladores del crecimiento, pero tambin pueden ser incorporados otros
componentes como: funguicidas, antibiticos y microorganismos (Gray y Purohit, 1991;
Redenbaugh, 1990; Rodrguez, 2000).

Diversos investigadores plantean que para controlar el crecimiento y facilitar la

germinacin del embrin somtico, el endosperma sinttico puede simular a un endosperma

12

Marco terico

de origen sexual, conteniendo uno o varios compuestos como: nutrientes, reguladores del
crecimiento,

agentes

protectores

contra

patgenos,

herbicidas,

biocontroladores,

biofertilizantes, entre otros con el fin de asegurar la conversin a planta y el desarrollo en

campo (Castillo et al., 1998; Kumar et al., 2004; Malabadi y Van Staden, 2005). Por otro
lado, la composicin de la matriz protectora debe permitir el crecimiento de los embriones
encapsulados otorgando una resistencia mecnica acorde a la energa disponible del
embrin, ya que un endospermo excesivamente duro ocasiona una prdida de energa y un
crecimiento dbil o nulo de los embriones somticos encapsulados (Jimnez y Quiala,
1998; Gonzlez et al., 2004). Se seala en la literatura la utilizacin de diversas sustancias
(agar, gelrite, gomas) para encapsular embriones somticos, siendo la manipulacin de la
concentracin de alginato de sodio y los tiempos de exposicin al agente gelificante, el
cloruro de calcio, los que reportan mejores resultados de germinacin y conversin a planta
en ciertos tipo de especies (Patel et al., 2000; Maruyama et al., 2003; Utomo et al., 2008).
Es por ello que el estudio de la composicin del endosperma sinttico, variando el
contenido de alginato de sodio y/o regulando el tiempo de exposicin al agente
acomplejante, permitir generar una matriz sinttica que garantice la normal germinacin
de los embriones encapsulados y/o la recuperacin de un tejido despus de someterlo a un
proceso de estrs como la crioconservacin.

Por las razones anteriormente citadas, la evaluacin de la composicin de la cubierta en lo

referente a la determinacin del in calcio, el cual se vincula directamente a la consistencia
de la estructura que adquieren las cpsulas sintticas, es de gran importancia en trmino de
propagacin y de conservacin de germoplasma.

4.2 Encapsulamiento
Los materiales usados para el encapsulamiento deben de cumplir con la funcin de
proteccin fsica del material vegetal y adems deben permitir la disponibilidad de
nutrientes, antibiticos, funguicidas y microorganismos. Redenbaugh y colaboradores a
comienzos de los ochentas, y despus de diversos estudios con compuestos prominentes,

13

Marco terico

determinaron que los hidrogeles de alginato de calcio, llegaban a poseer las mejores
caractersticas (Artola, 2002; Nieves, 2000; Rodrguez, 2000).

El encapsulamiento con base en este compuesto qumico, suministra una proteccin

adecuada para el tejido vegetal, gracias a que posee una dureza idnea. La informacin que
estos estudios generaron sent las bases para la bsqueda de nuevas alternativas que hacen
el concepto de "semilla somtica " cada vez ms cercano (Artola, 2002).

Generalmente la tcnica de formacin de semillas sintticas, permite adems de servir

como una cubierta protectora, servir como una membrana semipermeable, para que en ella
pueda existir un intercambio osmtico necesario durante la crioconservacin de los tejidos
encapsulados.

4.3 Alginatos
Son polisacridos extrados de algas marinas pardas (macromolculas naturales). Los
polisacridos ms importantes extrados de las algas son: alginatos, agar, laminarina,
fucoidina, galactanos y carragenina que tienen diferentes usos, pero entre estos
polisacridos destacan los alginatos y el agar por sus mltiples aplicaciones prcticas e
industriales.

Los alginatos de mayor uso comercial son en forma de sales hidrosolubles, libres de
celulosa, blanqueadas y purificadas: alginato de sodio, alginato de potasio, alginato de
amonio y su ster de propilenglicol. Tambin se producen compuestos combinados como
alginato de amonio- calcio, alginato sodio-calcio.

Entre estos compuestos, principalmente el cido algnico y sus sales de sodio, calcio y
potasio, se comercializan en tres calidades diferentes debido a los procesos de purificacin
y blanqueado durante su produccin.

14

Marco terico

Estas calidades son:

Calidad alimentaria. Productos completamente libres de celulosa, de coloracin blanca o

ligeramente amarilla.
Calidad farmacutica. Productos blancos, libres de celulosa.
Calidad tcnica. Productos que pueden contener cierta proporcin de celulosa, de color
que vara desde el blanco a amarillo marrn.

Estos son empleados en la industria textil, pinturas, papeles, maderas aglomeradas, etc.

Los alginatos son uno de los polmeros ms utilizados en la microencapsulacin. Ellos son
extrados primariamente de tres especies de algas marrones. Los alginatos son una familia
de polisacridos lineales no ramificados, conteniendo cantidades variables de cido (1,4) D-mannurnico y de cido -L-glucornico.

La composicin y extensin de las secuencias y el peso molecular determinan las

propiedades fsicas de los alginatos. Posee la propiedad nica de formar un gel en presencia
de acciones divalentes, como el calcio (Oliveira, 2003).

4.4 Estructura qumica de los alginatos

Los alginatos son sales del cido algnico. El cido algnico es un polisacrido complejo
(biopolmero) que se obtiene de las algas pardas especialmente de las divisiones
Phaeophyceae (feofitas) y Rhodophyceae (rodofitas) por reaccin alcalina y est compuesto
por el cido mannurnico y el cido glucornico con enlaces -1,4.
Los alginatos estn constitudos por dos unidades monomricas, el cido-D-mannurnico
(M) y el cido unidas por enlaces glucosdicos (1-4) y secuencias GG, GM, unidas por
enlaces glucosdicos (1-4).Las proporciones relativas de este tipo de secuencias o bloques
varan con la fuente botnica, con el grado de madurez del alga y con el hbitat del alga.

15

Marco terico

La cadena polimrica constituyente del cido algnico y sus sales se componen de tres tipos
de bloques. Los bloques G que contienen slo unidades derivadas del cido L-glucornico,
los bloques M los cuales se componen de cido D-mannurnico y las regiones MG
compuestas de unidades alternadas de ambos cidos.

Como se ha mencionado las propiedades de los geles de alginato difieren de acuerdo a la

relacin del cido mannurnico (M) y el cido glucornico (G). Si el cido (M) est en
mayor proporcin, el gel es suave, elstico, fuerte pero quebradizo. Esta relacin vara en
las distintas especies de algas, tal como el alginato obtenido de por el tipo Laminaria
hyperborea con un alto porcentaje de segmentos GG o cido glucornico, que forma geles
rgidos, con baja capacidad de retencin de agua y tendencia a la sinresis. No as con el
alginato obtenido del alga Macrocystis pyrifera con un alto porcentaje de segmentos MM o
cido mannurnico, el cual forma geles elsticos y tiene una gran capacidad de retencin de
agua y baja deformacin.
Tabla 1. Porcentaje de cido mannurnico (M), glucornico (G), relacin M/G y contenido de alginato
(%), para varias especies comerciales de algas pardas.

Especie
Laminaria hyperborea
Laminaria digitata
Macrocystis pyrifera
Ascophyllium nodosum
Lessonia nigrescens
Ecklonia mxima

M
(%)
30
55
60
65
60
55

G
(%)
70
45
40
35
40
45

M:G
0.45
1.20
1.50
1.85
1.50
1.20

Contenido de alginato
(% sobre algas secas)
25-27
20-26
26
26-28
35
40

16

Marco terico

4.5 Propiedades fisicoqumicas de los alginatos

Estas propiedades estn referidas al cido algnico y a sus sales (Oliveira, 2003).
Estabilidad:

Alginatos slidos: La estabilidad de los productos algnicos comerciales (cido algnico y

sus sales) dependen de su grado de polimerizacin es decir de la cantidad de unidades
monomricas de cidos urnicos en la cadena polimrica.

El grado de polimerizacin de los alginatos tiene una relacin directa con su peso molecular
y la viscosidad de sus soluciones. Los alginatos que comercialmente se producen
(primordialmente el alginato de sodio) son de alta, media y baja viscosidad (referida a la
viscosidad de sus soluciones acuosa sal 1%).Generalmente los de alto grado de
polimerizacin son menos estables y los de menor grado de polimerizacin son ms
estables.

Los alginatos con mayor grado de polimerizacin con largas cadenas de cidos urnicos
pueden degradarse a unidades menores (despolimerizarse) en pocos meses a la temperatura
del medio ambiente. Es por ello que todos los compuestos derivados del cido algnico
deben almacenarse a la temperatura de 25C y humedad entre 10-13% a fin de evitar la
despolimerizacin. El proceso de despolimerizacin afecta las propiedades comercialmente
tiles como la viscosidad y la fuerza de los geles.

Soluciones de alginato: Las sales del cido algnico que son solubles en agua son las de
los metales como Na+, K+, Mg+2, Fe+2; iones monovalentes como el amonio, tambin la de
las aminas y bases orgnicas y su ster de propilenglicol.
Las sales del cido algnico formadas por metales como el Ca, Al, Zn, Cu, Cr, Fe+3 son
insolubles en agua as tambin el cido algnico. Las soluciones neutras de alginatos de baja
a media viscosidad es decir de bajo a medio grado de polimerizacin o de bajo a medio

17

Marco terico

peso molecular se pueden mantener a 25C por varios aos, sin sufrir prdida de viscosidad
apreciable y muy bajo ataque microbiano. Las soluciones de alginato con alto grado de
polimerizacin son inestables an a temperatura del medio ambiente y a medida que se
incrementa la temperatura el proceso de despolimerizacin se acelera.

Las soluciones de alginato pueden reaccionar con cationes divalentes formando geles
insolubles. En presencia de lcalis fuertes las cadenas de polisacridos se rompen y en
presencia de cidos fuertes se precipita el cido algnico.

La solubilidad de los alginatos en agua depende del tamao de partcula, partculas

pequeas se hidratarn con mayor rapidez pero podran aglomerarse. Partculas grandes
suelen ser ms fciles de dispersar y suspender pero tienen una baja velocidad de
hidratacin. La solubilidad del alginato en agua tambin depende de la naturaleza fsica de
las soluciones.

Cuando en el agua que se usa para disolver el alginato se encuentran presentes compuestos
que compiten con las molculas de alginato por el agua, entonces el proceso de disolver el
alginato ser muy difcil. As por ejemplo la presencia de protenas, almidn, azcares en el
agua reducir la hidratacin del alginato.

Las sales de cationes monovalentes como el NaCl ejercen el mismo efecto a

concentraciones cercanas a 0.5%, as que es mejor solubilizar todo el alginato y despus
aadir estos compuestos.

Tambin cuando hay pequeas cantidades de iones polivalentes se inhibe la hidratacin de

los alginatos y si estos se encuentran en grandes cantidades se precipitan. Cuando se quiere
disolver alginato de sodio en agua esta no tiene que ser dura pues se formara el alginato de
calcio insoluble en agua.

18

Marco terico

En los procesos de disolucin de polmeros como el alginato de sodio se observan las

siguientes etapas:

1). Difusin de las molculas del disolvente hacia la parte interna del polmero que se
encuentra en estado slido.

2). Separacin del polmero por accin de molculas del disolvente mediante la formacin
de la capa de solvatacin, lo que da lugar al hinchamiento del polmero. En el caso de
polmeros lineales el fenmeno de hinchamiento puede ser ilimitado es decir que el
polmero pasa hacia el disolvente junto con su capa de solvatacin (La entropa total
aumenta y las molculas son muy flexibles).

3). Si el polmero est formado por estructuras espaciales que forman mallas tal como los
alginatos, el grado de hinchamiento es limitado. En este caso la entropa del disolvente
disminuye debido al ordenamiento de las molculas del disolvente alrededor de las
molculas del polmero. Es necesario sealar que cuando las molculas del polmero se
hinchan la presin aumenta considerablemente debido a la absorcin de molculas de bajo
peso molecular.

4.6 Propiedades mecnico- estructurales de los alginatos

Las propiedades mecnico-estructurales de los alginatos son variables y se describen a
continuacin (Oliveira, 2003).

Viscosidad: Como se ha descrito anteriormente la viscosidad es una propiedad

fundamental de las soluciones de alginato as como tambin su reactividad frente al calcio y
esta propiedad es la que permite que estos compuestos sean usados como espesantes,
estabilizantes, gelificantes, etc.

19

Marco terico

En las soluciones de alginato, de concentracin usada en la mayora de las aplicaciones, la

viscosidad disminuye con la agitacin o bombeo y es reversible de acuerdo al grado de
agitacin. Esta propiedad es llamada tixotropa y es propia de las soluciones de polmeros
(la tixotropa es la transicin de gel a solucin y viceversa).

La viscosidad de los alginatos es variable debido a factores fsicos y qumicos tales como:

Peso molecular: A mayor grado de polimerizacin del alginato, mayor ser su peso
molecular y la viscosidad de sus soluciones.

Industrialmente se pueden variar las condiciones de extraccin y manufactura de los

alginatos a fin de obtenerlos segn las condiciones requeridas (grado de polimerizacin
deseado). Se comercializan productos con grado de polimerizacin entre 100 y 1000
unidades cuyas viscosidades estn en el rango de 10-1000 mPas (solucin al 1%).

Concentracin: Se comercializan los alginatos en diferentes grados de viscosidad (alta,

media, baja) y esta puede controlarse variando las concentraciones empleadas dentro de un
rango reducido.

Temperatura: A medida que la temperatura aumenta, la viscosidad de las soluciones de

alginato disminuye, este decrecimiento es aproximadamente del 2.5% por grado de
temperatura. Este proceso es reversible y la solucin recupera su viscosidad inicial por
enfriamiento. Por otro lado si se mantiene una temperatura elevada (50C) durante periodos
extensos, la viscosidad disminuye irreversiblemente esto debido a un proceso de des
polimerizacin.

Es por ello que es muy importante conservar los productos algnicos en condiciones
adecuadas durante el almacenamiento.

20

Marco terico

pH: La viscosidad de las soluciones de alginato de sodio presenta un valor mayor cerca de
la neutralidad (pH 6-8) debido a que la molcula est extendida por los efectos repulsivos
de los grupos carboxlicos cargados negativamente (COO-). Este rango es ptimo para la
disolucin. Por debajo del pH 4-5 la viscosidad tiende a incrementarse por la disminucin
de la solubilidad del cido algnico libre que precipita en forma de gel a un pH en el rango
de 3-3.5.En la industria alimentaria conviene emplear algina con intervalo de pH 4-10.

Fuerza inica: Al adicionar sales de cationes monovalentes a las soluciones de alginato de

sodio, la viscosidad de stas decrece. El polmero en solucin tiende a contraerse al
aumentar la fuerza inica de la solucin; este efecto se hace mximo a concentraciones
salinas cercanas a 0.1N. Por el contrario, al agregar iones de metales polivalentes a las
soluciones de alginato sodio, como es el caso del in Ca++, la viscosidad se incrementa al
aumentar la concentracin de estos.

4.7 Geles de alginato

Las soluciones de alginato a concentraciones bajas como 0.25% a 0.5% se utilizan para
estabilizar emulsiones, espumas, suspensiones, etc., mientras que las soluciones con mayor
concentracin de alginato y en presencia de ciertos cationes (principalmente el calcio)
forman geles de tipo qumico, no reversibles al calentarlos, de gran tensin superficial y de
dureza variable segn los pesos moleculares de los polisacridos componentes.

Las soluciones de alginato tambin forman geles en medio cidos y condiciones

controladas; mayormente esos son ms dbiles que los geles de calcio por lo que dan una
sensacin de fusin en la boca y tienen muchas aplicaciones en la industria alimentaria.
Estos geles se forman al protonarse un nmero creciente de grupos carboxlicos en la
cadena del polmero debido a que el pH desciende, esto reduce la repulsin elctrica entre
las cadenas del polmero y se generan enlaces tipo puente de hidrgeno.

21

Marco terico

4.8 Mecanismo de formacin de los geles de alginato de calcio

Si a una solucin de alginato de sodio de concentracin definida se le aade una solucin
de un metal divalente como el calcio a alta concentracin se forma un gel insoluble de
alginato de calcio y por consiguiente, queda constituida una matriz sinttica.

Se ha mencionado que las sales del cido algnico estn formadas por tres bloques: bloques
M, bloques G y bloques MG.

Cuando dos cadenas de bloque G se alinean, se forma sitios de coordinacin debido a la

forma de bucles de estas cadenas, las cavidades permanecen entre ellas y stos tienen el
tamao adecuado para acomodar al in Ca++ y adems estn revestidos con grupos
carboxlicos y otros tomos de oxgenos electronegativos los cuales son ligandos favorables
y permiten un alto grado de coordinacin de los iones calcio. Por esta razn este modelo es
llamado el modelo de la caja de huevos (Figura 1).
COOH
HO
OX

COOH

HO
O

HO

2+

Ca

O OC
O

COO

OX

2+

Ca

Ca

2+

2+

OX

COO

HO

2+

Ca

Ca

2+

O OC
O

Ca

Ca

2+

O OC

O OC
O

COO

HO
HO

Ca

2+

COO

OX

OX

Ca

2+

COO

O OC

O
-

O OC
O

O
COOH

O OC

O
COO

2+

HO

COO

COOH

HO

HO

O
COOH

O OC

O OC

COO
HO

Ca

COO

O
OX

O OC

COOH

HO

O
-

COO

O
O OC

HO

COO

O
-

COOH

HO

Ca

2+

O OC

COO
HO

HO

OX

OX

O
COOH

HO

Figura 1. Modelo de caja de huevos propuesta por Grant.

Este modelo fue propuesto por Grant (1973) para dar explicacin a las propiedades
gelificantes de los alginatos al reaccionar con sales clcicas. Tal es el caso del alginato de
sodio en solucin, al reaccionar con el in Ca++. Se produce un intercambio inico y la

22

Marco terico

correspondiente formacin de la unidad dimrica entre los iones Ca++ y las cadenas del
polmero en forma de bucles (regiones de bloque GG), estas cadenas ricas en cidos
glucornicos generan distancias entre los grupos carboxlicos e hidroxlicos y permiten un
alto grado de coordinacin con los iones calcio formndose la estructura de la caja de
huevos, es decir, cambia la estructura original del gel (Figura 2).

Figura 2. Representacin esquemtica de la asociacin de las secuencias poliglucornicas por quelacin

por calcio.

Se puede aseverar que hay enlaces Ca++ con las secuencias poliglucornicas por los
cambios de dicrosmo circular que son vistos. Un cambio ms pequeo se observa en las
secuencias alternadas y ningn efecto en los bloques polimannurnicos.
El cambio ocurre en las regiones de transicin n del espectro del grupo carboxlico
conforme los orbitales n en las secuencias poliglucornicas son comprometidos
especficamente en la quelacin de los iones Ca++. El modelo de la caja de huevos provee
una base convincente para la explicacin de estos cambios porque sita al in en la
posicin correcta para la coordinacin con los orbitales n carboxlicos y en la misma regin

23

Marco terico

de simetra espacial que el O-4 y O-5 que normalmente determinan la seal de la banda
n.

4.9 Mtodo de liberacin

Los mecanismos de liberacin de las cpsulas se pueden llevar a cabo por una disolucin
normal en agua, por esfuerzos de cizalla, por temperatura, por reacciones qumicas y
enzimticas o por cambios en la presin osmtica. La liberacin de componentes de una
cpsula puede ser controlada por difusin de la pared de la cpsula o por una membrana
que cubre la pared. La permeabilidad a travs de la matriz y la solubilidad del componente
de la pared de la cpsula influyen en la velocidad de difusin.

El compuesto que va a difundir debe ser soluble en la matriz; aunque la presin de vapor de
sustancias voltiles en cada lado de la matriz puede ser la fuerza que determine la difusin.
La seleccin de una matriz o membrana es importante; la naturaleza qumica, morfologa y
temperatura de transicin, el grado de hinchamiento y de entrecruzamiento tambin
influyen en la difusin de la membrana aunque pueden disminuir la velocidad de
liberacin.

El gel de alginato clcico formado es permeable a molculas solubles en agua, cuyos pesos
moleculares sean menores a 5000 Dalton. Molculas mayores tambin pueden difundir a
travs del gel, pero si el peso molecular excede los 10.000 Dalton, la difusin no ocurre. La
excepcin a esto, la constituyen los lpidos, que permanecen en la matriz aun cuando sean
de peso molecular bajo.

Es esencial que las cpsulas constituyan una matriz semipermeable que favorezcan los
fenmenos de transporte hacia ambas direcciones (hacia dentro y fuera de la cpsula),
cuando se est considerando que est cubierta sinttica proteger a un material a
crioconservar. En la tcnica criognica de encapsulacin/deshidratacin, es necesario por
ejemplo realizar una fase de precultivo en medios que contienen concentraciones elevadas

24

Marco terico

de sacarosa, ya que es importante que esta azcar penetre y a su vez, remueva alguna
fraccin del agua congelable presente. De esta forma, las clulas y los tejidos se volvern
ms tolerantes a las condiciones de estrs generadas por la deshidratacin y la congelacin.
Esta induccin de resistencia es necesaria lograrla tanto en tejidos encapsulados como no
encapsulados, debido a que en la naturaleza, pocas especies son resistentes al fro y sobre
todo, aquellas que son originarias de climas tropicales, que presentarn por tanto una mayor
sensibilidad.

La inhibicin de cristales de hielo en el medio intracelular por medio de la vitrificacin, que

es el evento trmico producido por el paso directo de la fase lquida a slido amorfo (Fahy,
1984), se propicia en presencia de altas concentraciones de sacarosa aun cuando el sistema
biolgico puede encontrarse a temperatura ambiente. En materiales desecados como las
semillas biolgicas, el estado vtreo acta principalmente como un estabilizador fsico y
asociado a la proteccin contra las reacciones de deterioro. La ocurrencia de la vitrificacin
de los solutos internos y del medio intracelular durante un proceso de congelacin evita los
daos provocados por la formacin de los cristales de hielo que afectan a los componentes
de la membrana y producen la lisis celular, pero para que ocurra la vitrificacin completa,
es necesario igualmente propiciar la ocurrencia de la transicin vtrea en el medio o agente
crioprotector. Existen numerosas prcticas de tratamientos con sacarosa segn el protocolo
de crioconservacin a considerar, pero en todos los casos el precultivo con sacarosa resulta
en una reduccin lenta del contenido de humedad (Uragami 1991, Engelmann y Duval
1986) debido a su efecto osmtico y la absorcin de sacarosa, reduce a su vez el punto de
congelacin y la cantidad de agua a congelar. Estudios histocitolgicos realizados con
banano revelan la acumulacin o la sntesis de almidn dentro del citoplasma despus del
precultivo con esta azcar (Panis et al. 1996). Los azcares tambin mantienen el estado
cristalino lquido de las capas dobles de membranas y estabilizan las protenas bajo
condiciones de congelacin (Kendall et al. 1993).

25

Marco terico

4.10

Mtodo analtico para la determinacin de elementos metlicos o

metaloides
Una de las tcnicas analticas que, debido a su gran sensibilidad, permite hacer un anlisis
de metales contenidos en una muestra es la espectroscopia de absorcin atmica (EAA. Es
una tcnica muy especfica debido a que los tomos absorben radiacin en un intervalo muy
estrecho de longitudes de onda caractersticas; de esta manera se evita la interferencia de
otros elementos.

Por ms de cincuenta aos esta tcnica ha tenido una gran aplicacin en el anlisis
elemental llegndose a cuantificar alrededor de 60 elementos metlicos y metaloides, con
distinto grado de xito.

4.11 Espectroscopia de absorcin atmica en flama

La espectroscopia de absorcin atmica (EAA) en flama, tiene como fundamento la
absorcin de radiacin de una longitud de onda determinada. Esta radiacin es absorbida
selectivamente por tomos que tengan niveles energticos cuya diferencia en energa
corresponda en valor a la energa de los fotones incidentes. La cantidad de fotones
absorbidos, est determinada por la ley de Beer, que relaciona sta prdida de poder
radiante, con la concentracin de la especie absorbente y con el espesor de la celda o
recipiente que contiene los tomos absorbedores.

Los componentes instrumentales de un equipo de espectrofotometra de absorcin atmica

son los similares a los de un fotmetro o espectrofotmetro de flama, excepto que en EAA
se requiere de una fuente de radiacin necesaria para excitar los tomos del analito (Figura
3).

26

Marco terico

Figura 3. Componentes de equipo de espectrofotmetro de absorcin atmica

La funcion de los componentes de un espectrofotmetro de absorcin atmica son muy

especificas para cada funcion, descritas a continuacion:

Una fuente de radiacin que emita una lnea especfica correspondiente a la

necesaria para efectuar una transicin en los tomos del elemento analizado.

Un nebulizador, que por aspiracin de la muestra lquida, forme pequeas gotas

para una atomizacin ms eficiente.

Un quemador, en el cual por efecto de la temperatura alcanzada en la combustin y

por la reaccin de combustin misma, se favorezca la formacin de tomos a partir
de los componentes en solucin.

Un sistema ptico que separe la radiacin de longitud de onda de inters, de todas

las dems radiaciones que entran a dicho sistema.

Un detector o transductor, que sea capaz de transformar, en relacin proporcional,

las seales de intensidad de radiacin electromagntica, en seales elctricas o de
intensidad de corriente.

27

Marco terico

Una amplificador o sistema electrnico, que como su nombre lo indica amplifica la

seal elctrica producida, para que en el siguiente paso pueda ser procesada con
circuitos y sistemas electrnicos comunes.

Por ltimo, se requiere de un sistema de lectura en el cual la seal de intensidad de

corriente, sea convertida a una seal que el operario pueda interpretar (ejemplo:
transmitancia o absorbancia). Este sistema de lectura, puede ser una escala de aguja,
una escala de dgitos, un graficador, una serie de datos que pueden ser procesados a
su vez por una computadora, etc.

La EAA en flama es a la fecha la tcnica ms ampliamente utilizada (aunque cada vez ms

competida por la Espectrofotometria de Emision de Plasma) para determinar elementos
metlicos y metaloides. Esta tcnica tienen grandes convenientes y es de costo
relativamente bajo, pudindose aplicar tal tcnica a una gran variedad de muestras.

Acoplado un instrumento de absorcin atmica a un horno de Grafito y a un generador de

hidruros se alcanzan lmites de deteccin hasta de ppb, lo cual lo hace indispensable en
reas como son: estudios de contaminacin ambiental, anlisis de alimentos, anlisis de
aguas potables y residuales, diagnstico clnico, etc.

28

V. MATERIALES Y MTODOS

Materiales y mtodos

5.1 Preparacin de soluciones para la encapsulacin

El presente trabajo de investigacion se realizo en el Ladiser de Biotecnologia y
Criobiologia de la Facultad de Ciencias Quimicas perteneciente a la Universidad
Veracruzana y en el laboratorio de Quimica Organica y Biotecnologia.

5.1.1 Alginato de sodio

Para estudiar el proceso de encapsulacin se prepar inicialmente una solucin de medio de
cultivo conteniendo las sales minerales propuestas por Murashige-Skoog (Anexo 1), pero
libre de calcio, la cual se suplement con alginato de sodio al 3% (SIGMA, baja
viscosidad). Para disolver el alginato sdico, la solucin de medio de cultivo se prepar a
temperatura ambiente y se aadi cuidadosamente el alginato bajo agitacin constante,
cuidando todo el tiempo de que no llegara a formar demasiados grumos. Con la ayuda de
un agitador de vidrio se retiraron los grumos que se forman al disolver el alginato de sodio,
una vez obtenida una solucin homognea y transparente, se ajust el pH a 5.7 y se
esteriliz en una autoclave vertical (EVAR) a 121 C durante 15min.

5.1.2 Cloruro de calcio

La solucin de cloruro de calcio necesaria para cumplir con el proceso de encapsulacin,
fue utilizada en una nica concentracin (0.1M) en el desarrollo de esta investigacin, al
igual que el alginato, se le adicionaron sales minerales y con ayuda de un agitador
magntico se disolvi el calcio, una vez obtenida una solucin homognea y transparente,
se ajust el pH a 5.7 y se esteriliz en una autoclave vertical (EVAR) a 121C durante
15min.

30

Materiales y mtodos

5.2 Obtencin y estandarizacin de las cpsulas de alginato de calcio por

peso
Para estandarizar el proceso de formacin de las cpsulas se ocup para todos los
experimentos una misma pipeta automtica de capacidad de 1000L con una punta que se
cort en el extremo a un dimetro de 4mm.

La obtencin de las cpsulas se llev a cabo goteando el alginato de sodio sobre la solucin
de cloruro de calcio (ambas soluciones preparadas con anterioridad como se describi
previamente), y se produjeron 6 cpsulas por cada 10mL de solucin de calcio. Para
homogenizar el tamao, se elaboraron lotes de aproximadamente 210, de las cuales se
seleccionaron cuidadosamente aproximadamente 200 con tamaos y pesos muy similares.
Para la estandarizacin del proceso de encapsulacin, se utiliz una balanza analtica digital
(Denver Instrument) con la cual se registraron los pesos individuales de las cpsulas.

Siguiendo el procedimiento de estandarizacin descrito, se obtuvieron cpsulas a seis

tiempos de gelificacin diferentes (10, 20, 30, 60, 180 y 1440min), ajustando la
permanencia de las gotas de alginato, en los volmenes de solucin de cloruro de calcio
pre-establecidos (10mL).

Una vez realizada la seleccin de las muestras a cada tiempo de gelificacin y acorde a sus
respectivos pesos frescos (Pfr), las cpsulas se pasaron a una estufa regulada a 90C por 24
horas y transcurrido este tiempo, se pesaron nuevamente para obtener el valor de peso seco
(Ps) de las mismas.

31

Materiales y mtodos

5.3 Tratamientos

de

las

cpsulas

en

medio

lquido

con

altas

concentraciones de sacarosa
Se obtuvieron cpsulas de alginato de calcio a los seis tiempos de gelificacin en estudio
(10, 20 y 30, 60, 180 y 1440min), estandarizadas convenientemente por peso acorde a la
metodologa descrita en el apartado anterior.

Los lotes con un total de 200 cpsulas por cada tiempo de gelificacin, se colocaron en
frascos con 50mL de solucin de sacarosa a las concentraciones de 0.06, 0.5, 0.75 1M
preparadas en el medio base de Murashigue-Skoog. Los frascos con las muestras
permanecieron durante 24 horas en precultivo y transcurrido este tiempo, las cpsulas se
secaron superficialmente utilizando papel filtro y se pesaron (Pprec), considerando este valor
representativo del proceso de transferencia de masas durante los tratamientos en sacarosa.
Seguidamente las muestras de cpsulas se transfirieron a una estufa regulada a 90C
durante 24 horas.

5.4 Preparacin de las muestras de cpsulas de alginato de calcio para el

anlisis de absorcin atmica
Las muestras de cpsulas secas obtenidas a los diferentes tiempos de gelificacin (con o sin
tratamiento en sacarosa), se colocaron en matraces micro-Kjeldhal en los cuales se
colocaron pesos similares para cada muestra y se adicionaron 10mL de HNO3 concentrado.
Los matraces se transfirieron al digestor con una temperatura de 120C en donde
permanecieron el tiempo necesario hasta obtener muestras totalmente digestadas, es decir,
cuando la solucin contenida en cada matraz se torn totalmente transparente. Al finalizar
el proceso de digestin de cada muestra, se prosigui a aforar cada una de ellas con agua
desionizada, iniciando con un volumen de 25mL y teniendo especial cuidado al ajustar el
volumen, ya que si se presentan errores durante este paso, los resultados obtenidos tambin
presentaran variacin por la alta sensibilidad del equipo de EAA.

32

Materiales y mtodos

El aforo inicial de 25mL, solamente se aplic a la primera muestra, ya que el equipo por si
slo, condicionar el volumen que deben cubrir las muestras que sern analizadas
posteriormente.

5.5 Determinacin de calcio por espectrofotometra por absorcin

atmica (EAA)
Para un correcto funcionamiento del equipo de analisis son necesarias tener encuenta las
especificaciones tcnicas, al igual que las recomendaciones ya preestablecidas (Anexo 2) en
el LADISER de Quimica Orgnica, ubicado en la Facultad de Ciencias Qumicas de
Orizaba, .

Anlisis de absorcin atmica en el equipo GBC 932 AA

Las determinaciones de calcio en cpsulas de alginato por la tcnica analtica de absorcin

atmica se realizaron acorde al protocolo establecido en el LADISER de Orgnica y
Biotecnologa, ubicado en la Facultad de Ciencias Qumicas de Orizaba (Oliver, 2008).

Para la calibracin del equipo se construy una curva tomando como base un estandar de
cobre a una concentracin establecida, a partir de la cual se realizaron nuevas diluciones a
varias concentraciones. Las soluciones preparadas se ingresaron en el equipo para
determinar los valores de absorbancia correspondientes a cada una y se graficaron contra la
concentracin de cobre expresada en mg/L o ppm. La curva de calibracin construida,
permiti, optimizar ademas de estandarizar el equipo y establecer posteriormente las
condiciones de trabajo pero ahora con el elemento a analizar, en este caso el Ca++, con el
que igualmente se elabor una curva de calibracin tal y como la elaborada con el cobre
para iniciar el anlisis de las cpsulas de alginato segn la variante experimental en estudio.

Para la verificacin del estado de funcionamiento del equipo es necesaria la calibracin

peridica esto para demostrar que no han cambiado las condiciones del instrumento en una

33

Materiales y mtodos

forma significativa. La verificacin debe realizarse cada

vez que se utilice el

espectrofotmetro.

Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que este responda
de igual manera a los patrones al igual que la muestra, aunque estas tengan una matriz
relativamente diferente. Si estas diferencias son relativamente grandes, puede llegar a
invalidar el proceso de calibracin. Es necesario estar completamente seguro de que el
calibrado es vlido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentracin especifico para
cada muestra analizada (Anexo 3).

5.6 Cuantificacin de calcio por espectrofotometra de absorcin atmica

(EAA)
Para el analisis y cuantificacin de Ca++ en las cpsulas de alginato fue necesario
estandarizar el equipo de EAA, verificando su funcionamiento elaborando curvas de
calibracion no solo del anlito a cuanficar si no tambien del especificado en su manual de
funcionamiento (Cu) para su correcto funcionamiento (Mrquez, 2009).

5.6.1 Elaboracin de curva de calibracin

Para llevar a cabo la estandarizacin del equipo de EAA, es necesario preparar una curva de
calibracin, que se construye a partir de diferentes concentraciones de un elemento a
analizar en este caso el Ca++. El grfico resultante tiende a ser lineal, mientras progrese
segn la ley de Lambert Beer, pero si este no llegara a obtenerse, es necesario realizar una
calibracin completa del equipo, con analitos especificados para cada equipo, en este caso
el equipo utilizado fue el modelo GBC 932 AA, el cual se calibra en su totalidad utilizando
una solucin de cobre, especificadas en su manual de funcionamiento, y as poder lograr
obtener resultados confiables en el anlisis de cualquier analito, que este pueda detectar.
Para la cuantificacin de minerales es necesaria la preparacin de soluciones a diferentes

34

Materiales y mtodos

concentraciones (Anexo 4), con el hecho de construir una curva de calibracin que cumpla
con una linealidad (r2 0.98) y una reproducibilidad antes de analizar las muestras.

5.6.2 Condiciones de trabajo en el equipo de absorcin atmica GBC 932

AA
Elaborada la curva de calibracin se procedi a realizar las mediciones de la concentracin
de calcio en las muestras de cpsulas acorde a las condiciones experimentales de este
estudio. Los resultados se expresaron en mg/g de muestra seca para todas las muestras
analizadas. Los resultados se obtuvieron multiplicando: la concentracin obtenida en el
equipo (A) expresado en mg/L, por el volumen obtenido (B) expresado en litros, entre el
peso de la muestra (C) expresado en gramos.

de Ca++= AB
C

35

VI. RESULTADOS Y DISCUSIN

Resultados y discusin

6.1 Efecto del tiempo de gelificacin en la concentracin de calcio de

cpsulas de alginato
En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos respecto al contenido de calcio en
cpsulas de alginato formadas a diferentes tiempos de gelificacin y analizadas por EAA.

Tabla 2. Efecto del tiempo de gelificacin en la concentracin de calcio en cpsulas de alginato.

Tiempo de gelificacin
(min)
10
20
30
60
180
1440

Peso fresco Pfr

(g)
13.33
13.08
12.46
12.23
10.83
11.40

Peso Seco Ps
(g)
0.62
0.67
0.66
0.67
0.59
0.66

mg de Ca++/g de
muestra seca
146.84
186.20
204.56
214.16
218.15
219.92

Como se puede apreciar, se obtuvieron valores de concentracin de calcio que oscilaron

desde de 146.84 mg de Ca++ a los 10 min de gelificacin, hasta la concentracion mxima de
219 mg a los 1440 min. Esto nos indica que mientras ms tiempo contine en contacto la
gota de alginato de sodio con la solucin de cloruro de calcio, se atraparn ms los iones
Ca++ que contribuyen a la formacin de la matriz sinttica de la cpsula, hasta llegar a un
punto en la que se estabiliza el proceso de gelificacin y se puede considerar que la
polimerizacin es completa. Este efecto se hace claro a partir de los 60 min, en el que el
contenido de calcio en las cpsulas permanece prcticamente invariable alrededor de 217
mg de Ca++/g de muestra seca (Figura 4).

37

Resultados y discusin

mg de Ca++/ g de muestra

250
200
150
100
50
0
10

20

30

60

180

1440

Tiempo de gelificacin (min)

Figura 4. Representacin grfica del contenido de Ca++ en cpsulas gelificadas por tiempos diferentes.

6.2 Efecto del tratamiento de precultivo en medio lquido suplementado

con sacarosa, en la concentracin de calcio de cpsulas de alginato
obtenidas a diferentes tiempos de gelificacin
Cuando las cpsulas de alginato de calcio se sometieron al precultivo en medio liquido con
altas concentraciones de sacarosa, se obtuvieron los resultados que se presentan
individualmente por tiempos de gelificacin en la Tabla 3.

38

Resultados y discusin

Tabla 3. Efecto del precultivo en medio lquido con diferentes concentraciones de sacarosa (0.06, 0.5,
0.75 y 1M) , en el contenido de calcio en cpsulas de alginato a diferentes tiempos de gelificacion (10, 20,
30 y 60min). ND. No determinado.

Sacarosa (M)
Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

Peso fresco Pfr

(g)
13.33
18.70
19.17
19.18
19.62

Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

13.08
19.83
18.75
17.77
19.00

Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

12.46
16.55
15.16
14.53
13.22

Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

12.23
14.04
15.17
13.83
13.51

Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

10.83
12.78
13.03
13.22
13.50

Sin precultivo
0.06
0.50
0.75
1

11.40
13.81
12.38
17.32
13.91

Cpsulas (10 min)

Peso fresco prec
(g)
17.66
18.72
18.15
18.58
Cpsulas (20 min)
17.60
18.59
17.63
19.58
Cpsulas (30 min)
15.55
14.69
15.09
14.23
Cpsulas (60 min)
13.34
15.29
15.12
15.99
Cpsulas (180 min)

12.93
14.08
15.07
15.76
Cpsulas ( 1440min)
14.35
13.17
18.49
16.36

Peso Seco Ps
(g)
0.62
1.00
2.80
4.17
5.17

mg de Ca++/g de
muestra
146.84
77.20
55.21
41.70
31.07

0.67
1.04
2.85
4.23
5.54

186.20
74.45
45.63
20.99
16.48

0.66
0.90
2.16
3.28
4.32

204.56
172.44
76.06
45.40
40.90

0.67
0.80
2.33
3.64
5.00

214.16
203.75
115.33
63.07
23.39

0.59
0.83
2.31
3.94
4.91

218.15
ND
142.41
69.85
65.93

0.66
0.97
4.56
4.84
5.14

219.92
ND
145.05
108.61
78.62

Al realizar el anlisis en cpsulas precultivadas y obtenidas previamente a diferentes

tiempos de gelificacin, se observa el efecto del tratamiento con sacarosa sobre el

39

Resultados y discusin

contenido de Ca++, comparado con las muestras no sometidas al precultivo (Tabla 3). Como
se aprecia, al ir incrementando el contenido de sacarosa en el medio de precultivo, el
contenido de Ca++ disminuye gradualmente. Si se toma como ejemplo las cpsulas
gelificadas por 10min sin y con precultivo, se observa que el contenido de calcio inicial se
reduce progresivamente desde 146.84 mg de Ca++/g de muestra seca hasta 77.20mg/g
despus del tratamiento con 0.06M de sacarosa y contina disminuye finalmente hasta
31.07 mg, despus del precultivo con la concentracin de 1M.

Esto puede estar relacionado con dos eventos:

En un inicio con el lavado del Ca++ superficial que de lo contrario, permanece en las
muestras que no se someten al precultivo, mantenindose retenido sobre la cubierta
sinttica de la matriz (Ca++ superficial). Esta misma dinmica ocurri con el resto de las
cpsulas gelificadas a los diferentes tiempos en estudio. De esta forma, podemos
igualmente analizar que de un contenido inicial de calcio de 219 mg/g de muestra seca en
cpsulas obtenidas al mayor tiempo de gelificacin y no precultivadas, disminuy el
contenido hasta 78.62 mg despus del precultivo en 1 M de sacarosa. Sin embargo, la razn
fundamental que incide en la disminucin del calcio total en las muestras, parece estar
relacionado principalmente con el incremento progresivo experimentado en los slidos
totales de las cpsulas despus del tratamiento con sacarosa, asociado directamente, a la
penetracin de este azcar a las cpsulas.

La Figura 5 ilustra como ocurre ese incremento de slidos en las cpsulas de alginato de
calcio, expresado por el valor de peso seco (Ps), al ir incrementndose la concentracin de
sacarosa en el medio de precultivo. Tambin se observa, como se reduce el contenido del
in Ca++ en las cpsulas en la medida en que aumenta la penetracin del azcar al interior
de la matriz de alginato y consecuentemente, incrementa el contenido de slidos totales
(Figura 6).

40

Resultados y discusin

Concentracin de sacarosa (M)

Sin precultivo

0.06

0.5

0.75

Ps (g)

4
3
2
1
0
10

20

30

60

180

1440

Tiempo de gelificacn (min)

Figura 5. Efecto del tiempo de gelificacin de las cpsulas de alginato y de la concentracin de sacarosa
en el medio de precultivo sobre el peso seco (Ps).

Concentracin de sacarosa (M)

250

Sin precultivo

0.06

0.5

0.75

mg de Ca++/g de muestra

200

150

100

50

0
10

20

30

60

180

1440

Tiempo de gelificacin (min)

Figura 6. Efecto de la concentracin de sacarosa en el medio de precultivo sobre el contenido de Ca ++ de
las cpsulas de alginato. ND: No determinado.

41

Resultados y discusin

Por consiguiente, las Figuras 5 y 6 constituyen una evidencia clara de cmo al

incrementarse el contenido de slidos en las cpsulas por el efecto osmtico del precultivo,
la concentracin de Ca++ disminuye directamente proporcional al aumento de la
concentracin de sacarosa en el medio.

Por otro lado, la influencia del tiempo de gelificacin se vio reflejada en que cpsulas ms
gelificadas tuvieron un poro ms pequeo y ofrecieron una mayor resistencia a la
penetracin de la sacarosa a las mismas, por lo que el incremento de slidos fue menor en
las muestras ms rgidas, en comparacin con las cpsulas menos gelificadas y por
consiguiente, el contenido inicial de calcio se mantuvo a niveles ms elevados.

6.3 Valoracin de la implementacin de la tcnica de absorcin atmica

para la determinacin de calcio en cpsulas de alginato
Los resultados obtenidos con el desarrollo de esta investigacin demostraron la factibilidad
de utilizar la tcnica de espectrometra de absorcin atmica en la determinacin de
elementos (metlicos u organometalicos) que forman parte de los compuestos utilizados
dentro de la prctica de un laboratorio de investigacin, en este caso de Biotecnologa y
Criobiologa Vegetal, aportando informacin de utilidad sobre la composicin de
materiales de encapsulacin para la conservacin de tejidos vegetales.

42

VII. CONCLUSIONES

Conclusiones

En la realizacin de esta investigacin, se obtuvo informacin de corte bsico, acerca del

proceso de gelificacin, y las valoraciones del contenido de calcio en las cpsulas de
alginato, asociado a la metodologa criognica de encapsulacin/deshidratacin.

Hasta el momento no existan estudios previos relativos al proceso de gelificacin y su

influencia en la concentracin de calcio en las cpsulas de alginato.

Los resultados obtenidos permitieron comprobar:

Que el mtodo de anlisis cuantitativo de EAA, es una herramienta instrumental
til para determinar el contenido de calcio en cpsulas de alginato.
Que a mayor tiempo de gelificacin, mayor contenido de calcio en las cpsulas.
Que el proceso de polimerizacin comienza a estabilizarse a partir de los 30 min de
retencin de las gotas de alginato de sodio en la solucin de cloruro de calcio y se
completa a los 60 min de gelificacin.
Que el tratamiento de precultivo en medio lquido produjo una reduccin del
contenido de calcio en las cpsulas de alginato producto del lavado superficial de
las muestras.
Que a mayor concentracin de sacarosa en el medio de precultivo, menor contenido
de calcio en las cpsulas de alginato debido al incremento progresivo de los solutos
por la penetracin de sacarosa al interior de la matriz sinttica.

44

VIII. REFERENCIAS
BIBLIOGRFICAS

Referencias bibliogrficas

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Cell Tiss. Organ Cult. 92:281-291.

49

IX. ANEXOS

Anexos

Anexo 1
Composicin y preparacin del medio Murashige y Skoog

51

Anexos

Anexo 2
Especificaciones tcnicas del equipo de espectrofotometra de absorcin
atmica (GBC 932 AA)

Equipo

Absorcin atmica.

Modelo

932 AA

Software

GBC Avanta Ver. 1.32

Elemento

Calcio

Gases

Aire-acetileno-oxido nitroso.

Tipo de Flama

Oxidante

Temperatura Flama

Alcanza 3200 C.

Longitud de Onda

0 - 422.7 nm
4 - 285.2 nm

52

Anexos

Anexo 3
Calibracin del equipo de EAA modelo GBC 932 AA
Objetivo

Que el alumno tenga la seguridad de que el equipo este funcionado correctamente antes
de iniciar el anlisis.

Fundamento

Una verificacin de calibracin peridica es para demostrar de que no han cambiado las
condiciones del instrumento en una forma significativa. La verificacin debe realizarse
cada vez que se utilice el espectrofotmetro.

Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que este responda
de igual manera a los patrones al igual que la muestra, aunque estas tengan una matriz
relativamente diferente. Si estas diferencias son relativamente grandes, puede llegar a
invalidar el proceso de calibracin. Es necesario estar completamente seguro de que el
calibrado es valido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentracin. Importancia
de la calibracin.

El envejecimiento de los componentes, los cambios de temperatura y el estrs mecnico

que soporta los equipos deterioran lentamente sus funciones. Cuando esto sucede, los
ensayos y las medidas aumentar su intervalo de incertidumbre y se refleja tanto en el diseo
como en la calidad del producto final ya que durante el proceso de produccin es
importante que cada parte sea realizada con calidad para obtener los resultados deseados.

53

Anexos

Material
Limpieza del material.
o Pipeta Volumtrica de 5 mL
o Pipeta graduada de 5 mL 60
o Matraz aforado de 100 mL
o Probeta de 100 mL
o Pizeta
o Perilla

Reactivos

Seguridad (Anexo 5)

Solucin Estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L

Acido Ntrico (HNO3) Concentracin.

Agua desionizada o tridestilada.

Espectrofotomtrica de Absorcin Atmica

Lmpara de Ctodo Hueco de Cobre (Cu)

Equipo

Preparacin de soluciones

Para la realizacin la verificacin se debe preparar una solucin de cobre (Cu) de 5 mg/L y
preparar un blanco de acido ntrico (HNO3)

Preparacin de la Solucin de Cobre 5 mg/L

Medir una alcuota de 5mL del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L en
pipeta volumtrica y llevarlo a un matraz aforado de 100 mL.

Adicionar 2 mL de acido ntrico (HNO3) con pipeta graduada.

54

Anexos

Llevar al aforo con agua desionizada o tridestilada.

Cuidar el aforo.

Preparacin del Blanco

Medir una alcuota de acido ntrico (HNO3) conc. Con pipeta graduada,
llevar a la

probeta graduada.

Aforar a 100 mL con agua desionizada o tridestilada.

Cuidar el aforo.

Desarrollo experimental

Encender el equipo y conectar la lmpara de Cobre (Cu).

Alinear la lmpara hasta obtener la mxima energa.

Seleccionar el ancho de banda espectral ptimo, el cual depende de cada

elemento en particular.

Seleccionar la longitud de onda para el metal de inters.

Optimizar la longitud de onda ajustndola hasta obtener la mxima energa.

Esperar de 10 min a 20 min para que se estabilice el equipo, una vez

encendida la lmpara.

Encender la flama. Permitir que el sistema alcance el equilibrio de

temperatura.

Aspirar un blanco (matriz libre de analitos a la cual se le agregan todos los

reactivos en los mismos volmenes y proporciones usadas en el
procesamiento de la muestra). El blanco en absorbancia debe de ser 0.0000

Aspirar una disolucin estndar de Cobre de 5 mg/L,

Buscar una absorbancia de 0.6 a 0.7 unidades de absorbancia

Si en caso de que no se obtenga la absorbancia mencionada, ajustar la

velocidad de flujo del nebulizador hasta obtener la mxima sensibilidad, as
como ajustar el quemador horizontal y verticalmente hasta obtener la
mxima respuesta.

55

Anexos

Anexo 4
Elaboracin de una curva de calibracin
Objetivo

Que el alumno aprenda a elaborar una curva de calibracin para el desarrollo del anlisis en
muestras.

Fundamento

Es una curva que se construye a partir de diferentes concentraciones de un analito y su

respuesta frente a una reaccin. Este grfico tiende a ser lineal, mientras progrese segn la
ley de Lambert Beer.

Factores que determinan la calidad de una calibracin son:

La precisin de las medidas estimadas atravs de la repetibilidad y la reproducibilidad de
las medidas. La repetibilidad se evala atravs del calculo de la desviacin estndar relativa
(RSD%) de la medida de los patrones de calibrado.

Exactitud de los patrones el valor de la concentracin o masa designado a cada patrn trae
aparejado un error pequeo si es preparado a partir de reactivos puros (grado analtico) con
estequiomtria bien definida este error en lo general se desprecia, frente al error de las
medidas de las seales producidas por el instrumento.

Material
Limpieza de material

Pipeta Volumtrica de 10, 5, 2, 3, 1 mL

Pipeta graduada de 10 mL

Matraz aforado de 100 mL

Pizeta

56

Anexos

Perilla

Frascos de boca ancha

Etiquetas

Solucin Estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L

Acido Ntrico (HNO3) Conc.

Agua desionizada o tridestilada.

Espectrofotomtrica de Absorcin Atmica

Lmpara de Ctodo Hueco de Cobre (Cu)

Reactivos
Seguridad

Equipo

Desarrollo experimental
Calcular los volmenes que necesitamos de la solucin estndar para la elaboracin de la
curva. Para la preparacin utilizaremos un estndar de Cobre (Cu) de 1000mg/L de esta
solucin tomaremos una alcuota para preparar una concentracin de 100mg/L y de esta
partiremos para preparar los dems puntos para la curva.

Nota: Cuidar de no contaminar el estndar de Cobre (Cu) de 1000mg/L

Calculo para la preparacin de los puntos de la curva.

Calculo para la preparacin de la solucin Cobre 100 mg/L:

57

Anexos

Preparacin de la solucin de Cobre 100 mg/L:

Tomar una alcuota de 10 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un
matraz aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3)
concentrado y llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Calculo para la preparacin de la solucin de Cobre 6 mg/L:

Preparacin de la solucin de Cobre 6 mg/L:

Tomar una alcuota de 6 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Calculo para la preparacin de la solucin de Cobre 4 mg/L:

Preparacin de la solucin de Cobre 4 mg/L:

Tomar una alcuota de 4 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Calculo para la preparacin de la solucin de Cobre 3 mg/L:

58

Anexos

Preparacin de la solucin de Cobre 3 mg/L:

Tomar una alcuota de 3 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Calculo para la preparacin de la solucin de Cobre 2 mg/L:

Preparacin de la solucin de Cobre 2 mg/L:

Tomar una alcuota de 2 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Calculo para la preparacin de la solucin de Cobre 1 mg/L:

Preparacin de la solucin de Cobre 1 mg/L:

Tomar una alcuota de 1 ml del estndar de Cobre (Cu) de 1000 mg/L, llevarlo a un matraz
aforado de 100 mL, igualar la matriz agregndole 2 mL de Acido Ntrico (HNO3) conc y
llevarlo al aforo. Transvasar a un frasco y etiquetar.

Despus de la preparacin de la curva, se analiza o se guarda en refrigeracin.

59

Anexos

Anexo 5
Seguridad
Para el muestreo se necesita tener los cuidados que se establecen en la norma mexicana
NMX-AA-003.

No se ha determinado la carcinogenicidad de todos los reactivos con precisin, por lo que

cada sustancia qumica debe tratarse como potencialmente peligrosa para la salud. La
exposicin a estas sustancias debe reducirse al menor nivel posible. Este mtodo puede no
mencionar todas las normas de seguridad asociadas con su uso. El laboratorio es
responsable de mantener un ambiente de trabajo seguro y un archivo de las normas de
seguridad respecto a la exposicin y manejo seguro de las substancias qumicas
especificadas en ste mtodo.

Debe tenerse un archivo de referencia de las hojas de informacin de seguridad el cual debe
estar disponible a todo el personal involucrado en estos anlisis.

Los gases oxidantes deben separarse de los gases reductores mediante una pared a prueba
de fuego. Seguir cuidadosamente las guas de operacin del fabricante del equipo para
optimizar la velocidad del flujo de gas. Si no se emplean las precauciones adecuadas, puede
resultar una combustin peligrosa dentro de la cmara de mezcla de los gases.

Para evitar explosiones en la lnea, no permitir que la presin de llegada del acetileno a
instrumento exceda 1,06 kg/cm2.

Cuando se usa xido nitroso como oxidante, debe utilizarse una cabeza de quemador de
50,8 mm de dimetro, ya que utilizando una cabeza de 101,6 mm (4-in) ocurre un regreso
de la flama. La flama de xido nitroso debe encenderse usando primero una combinacin
de aire-acetileno y luego cambiar a xido nitroso-acetileno. El xido nitroso nunca debe

60

Anexos

pasarse a travs de lneas que contengan residuos de aceites o grasas, ya que puede causar
una explosin.

Revisar que el tubo del desage de la cmara de mezcla de gas est lleno con agua antes de
comenzar cualquier anlisis. Se recomienda el uso de una trampa de seguridad o de
cualquier vlvula. Siga las instrucciones del fabricante para mantener una presin positiva
en el sello del lquido.

Dada la alta toxicidad del berilio, plomo, cadmio, nquel, mercurio, antimonio, plata, bario,
cromo, as como todos los pasos de preparacin y digestin de las muestras, extremar las
precauciones de manejo de todas las disoluciones y utilizar un cuarto bien ventilado.

61