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PRIMERA SESIN PROBLEMAS

Curso 2012-13

PROBLEMA 1. Las protenas Fos y Jun son factores de transcripcin con


dominios de cremallera de leucinas que reconocen la secuencia AP-1 de ADN.
Deseas determinar si dichas protenas son capaces de formar heterodmeros
para regular la transcripcin. Para ello, vas a utilizar la tcnica de FRET.
Marcas la protena Fos con fluorescena (Fos-F) y la protena Jun con rodamina
(Jun-R). (la Fluorescena absorbe luz a 490 nm y emite luz a 530nm, mientras
que la rodamina absorbe luz a 530nm y emite luz a 603nm), las incubas en
presencia y ausencia de la secuencia AP-1 de ADN y analizas el espectro de
emisin de Fos-F slo, Fos-F con Jun-R y Fos-F con Jun-R y el ADN AP-1
(Figura 1).

Figura 1. Espectro de
emisin de Fos-F slo, FosF con Jun-R y Fos-F con
Jun-R y el ADN AP-1.

A. Forman heterodmeros las protenas Fos y Jun? Razona tu respuesta.


B. Cmo influye la presencia de la secuencia de ADN AP-1? Razona tu
respuesta.
Quieres tambin conocer si los dmeros Fos-Jun intercambian subunidades con
monmeros en solucin en presencia y ausencia de la secuencia AP-1 de
ADN. Para ello, preincubas Fos-F y Jun-R en presencia y ausencia de ADN
AP-1 a continuacin, aades a las dos soluciones Fos (en exceso) sin
fluorescena y mides la fluorescencia a 603nm tras la excitacin a 490nm
(Figura 2).

Figura 2. Anlisis del


intercambio de Fos-F y JunR en presencia y ausencia
de ADN

A. Intercambian los heterodmeros libres subunidades con la protena Fox


no marcada aadida? Razona tu respuesta.
B. Cambian los resultados en presencia de la secuencia de ADN AP-1?
PROBLEMA 2. Tenemos un detector fluorescente para estudiar la localizacin
de protenas tirosina quinasas activas. Este detector consta de una protena
hbrida formada por el pptido sustrato reconocido por la tirosina quinasa Abl y
un dominio de unin a fosfotirosinas y de dos protenas fluorescentes, una azul
(CFP) y otra amarilla (YFP) fusionadas en cada uno de los extremos de la
protena hbrida (figura 3A).
La estimulacin del dominio CFP no provoca emisin del dominio YFP cuando
estos dominios estn separados. Sin embargo, cuando los dos dominios estn
prximos, la fluorescencia por transferencia de energa mediante resonancia
(FRET) permite que la excitacin de CFP estimule la emisin de YFP. El FRET
se demuestra experimentalmente como un incremento en la emisin a 526 nm
versus 476 nm (YFP/CFP) cuando CFP es excitado por luz de 434 nm de
longitud.
Hemos incubado el detector con la protena tirosina quinasa Abl en presencia
de ATP, omitiendo el ATP o la protena Abl, o aadiendo una fosfatasa y
obtenemos los resultados que aparecen en la figura (figura 3B).
Figura 3. A. Detector fluorescente. B. Ensayo FRET. El detector es incubado
en presencia o ausencia de Abl y ATP durante los tiempos indicados.

A. Explica estos resultados.


Las clulas activan la tirosina quinasa Abl en respuesta al factor de crecimiento
PDGF. Este factor se une al receptor PDGF que activa a Src que despus
activa a Abl.
Una de las consecuencias de la estimulacin es la aparicin de pliegues de
membrana, pero se desconoce donde se localiza la protena Abl activa. Para
investigar esta cuestin, las clulas son transfectadas con el detector anterior y
a continuacin se estimulan con PDGF. Utilizando el microscopio de
fluorescencia se sigue la emisin de YFP en respuesta a la excitacin de CFP
(FRET) en diferentes partes de la clula y obtenemos los resultados que
aparecen en la figura 4.

Figura 4. Ensayo FRET en


varias partes de la clula
tras la adicin de PDGF

B. Qu puedes deducir sobre la distribucin celular de la protena tirosina


quinasa Abl activa en respuesta a PDGF?

PROBLEMA 3. Los anticuerpos se utilizan a menudo para identificar la


localizacin de una protena en una clula y as poder adelantar hiptesis sobre
su funcin. Pero debe tenerse mucho cuidado al interpretar los resultados. Un
ejemplo es el del gen Brca1, que se identific como el gen que aparece mutado
en un tipo de cncer de mama familiar. Su secuencia no permiti identificar un
homlogo con una funcin conocida. Dos grupos de cientficos obtuvieron
anticuerpos contra diferentes segmentos de la protena Brca1 (predicha a partir
de la secuencia del gen con una masa molecular de unos 220 kd) y despus
los utilizaron con clulas de cncer de mama realizando una
inmunofluorescencia. Un grupo us un anticuerpo (C20) logrado contra un
segment de 20-aminocidos de la regin C-terminal y publicaron que la
protena Brca1 se localizaba en vesculas secretoras y en la membrana
plasmtica de las clulas tumorales. Un segundo grupo, us anticuerpos
logrados contra un fragmento N-terminal (BPA1) y contra un fragmento Cterminal (BPA2), y publicaron que la protena Brca1 se localizaba en el ncleo
de las clulas tumorales.
Te han encargado que aclares esta contradiccin, para lo cual realizas un
inmunoblot utilizando los tres anticuerpos contra las protenas de lisados
obtenidos de tres lneas celulares de cncer de mama (figura 1).

Figura 1. Immunoblot de los


tres anticuerpos logrados
contra la protena Brca1

(para realizar el inmunoblot se separan las protenas obtenidas al lisar una


clula por electrophoresis en gel de poliacrilamida con SDS, despus se
transfieren a un filtro de papel y finalmente se incuban con anticuerpos contra
la protena objeto de estudio. Los anticuerpos se unirn a las protenas o
fragmentos de protenas que contengan el eptopo contra el que se han
fabricado. Una vez que el anticuerpo primario se ha unido se visualizan con un
segundo anticuerpo conjugado con un enzima que permita su visualizacin tras
una reaccin histoenzimtica)
En funcin de los resultados que has obtenido con el inmunoblot, A qu crees
que se deben los resultados contradictorios obtenidos por los dos grupos de
investigadores? cul de los dos grupos de investigadores crees que ha
localizado realmente la protena Brca1?
PROBLEMA 4. La protemica consiste en el anlisis global de la expresin de
protenas de clulas en diferentes situaciones. Para ello, las protenas se
extraen, se separan por electroforesis bidimensional en gel, se tien para poder
visualizarlas y a continuacin se comparan. Has utilizado estas tcnicas para
ver el efecto de un frmaco en un tipo celular.

a) En la figura puedes ver el esquema de los geles obtenidos y teidos (por


ejemplo con azul de Coomassie) de clulas control y clulas tratadas.

Qu puedes concluir sobre el efecto del frmaco sobre las protenas 1 a 7?


b) Sospechas que el frmaco puede estar induciendo una protein kinasa y por
eso, repites el experimento anterior en presencia de fosfato inorgnico marcado
con 32P. En este caso, los geles de electroforesis obtenidos se han expuesto a
una pelcula fotogrfica para detectar las protenas marcadas con 32P. En la
figura aparecen las pelculas obtenidas.

Qu puedes concluir de estos resultados sobre el efecto del frmaco sobre las
protenas 1 a 7?
c) Finalmente, determinas la localizacin celular de las protenas 1-7 en las
clulas control y tratadas. Para ello, mediante centrifugacin diferencial,
separas las fracciones nuclear y citoplsmica, separas las protenas por
electroforesis bidimensional y ties los geles que aparecen en la figura.

Qu puedes concluir de estos resultados sobre el efecto del frmaco en la


localizacin celular de las protenas 1 a 7?
d) Resume los resultados combinando los datos de los tres apartados.
PROBLEMA 5. Deseas comprobar si, como te han dicho en clase, en las
protenas intracelulares las cistenas no forman enlaces disulfuro, mientras que
en las protenas extracelulares s. Utilizas como fuente de protenas
intracelulares reticulocitos, y como protenas extracelulares: albmina srica
bovina, que tiene 37 cistenas e insulina, que tiene 6. En primer lugar,
desnaturalizas las protenas de un lisado de reticulocitos y las dos protenas
extracelulares. Para probar el estado de las cistenas vas a utilizar Netilmaleimida (NEM), que reacciona covalentemente con los grupos tiol de las
cistenas libres, pero no con los tomos de S de los enlaces disulfuro. Como
agente que rompe los enlaces disulfuro utilizas ditiotreitol (DTT). Con estas
herramientas realizas los siguientes experimentos:
1. Tratas las protenas desnaturalizadas con NEM marcado
radiactivamente, a continuacin rompes los enlaces disulfuro con DTT y
tratas de nuevo con NEM, en este caso no marcado.
2. Tratas las protenas desnaturalizadas con NEM no marcado, a
continuacin rompes los enlaces disulfuro con DTT y finalmente tratas
de nuevo con NEM, en este caso marcado radiactivamente.
En ambos experimentos las protenas son separadas por electroforesis en gel
de poliacrilamida. Los resultados obtenidos aparecen en la figura 6.
A. Por qu utilizas lisados de reticulocitos en estos experimentos?
B. Por qu desnaturalizas las protenas antes de realizar
experimentos?
C. Contienen las protenas citoslicas enlaces disulfuro?
D. Tienen las protenas extracelulares grupos sulfidrilo libres?

tus

E. Cmo hubieran cambiado estos resultados si se hubieran utilizado lisados de


clulas con membranas intracelulares?

Figura 6. Resultados
obtenidos en los
experimentos a) y b). Los
tratamientos aplicados estn
indicados en la parte
superior.

PROBLEMA 6. DnaK y el factor TF son las dos chaperonas hsp70 ms


importantes de E. coli, aunque ninguno de los dos genes es imprescindible
para la supervivencia a 37C. Para investigar su importancia a diferentes
temperaturas se han construido tres cepas mutantes para compararlas con la
cepa salvaje (wild type: wt). Uno de estos mutantes lleva una deleccin del gen
TF (tig); el segundo lleva una versin alterada de dnaK, en la que se ha
alterado el promotor, y se ha sustitudo por un promotor inducible por IPTG (IdnaK); y el tercero contiene ambas mutaciones. Siembras varias diluciones de
los cuatro tipos de bacterias (10-2 a 10-5) en placas suplementadas o no con
IPTG y las haces crecer a diversas temperaturas (desde 15C a 42C)
obteniendo los resultados que aparecen en la figura 7.
A) Compara el crecimiento de las cepas tig y I-dnaK que expresan slo
una hsp70. Interpreta los resultados
B) Compara el crecimiento de los mutantes sencillos con los del doble
mutante (I-dnaK tig), que no expresa ninguna de las dos chaperonas.
Sugiere una explicacin para las diferencias encontradas.

Figura 7. Crecimiento de colonias de E. coli a diferentes temperaturas.


.PROBLEMA 7. La ciclina B de levaduras, conocida como Cdc13, debe ser
destruida para que tenga lugar la transicin metafaseanafase y pueda
proseguir normalmente el ciclo celular. La destruccin de Cdc13 se debe al
reconocimiento por parte del complejo promotor de la anafase (APC) de una
secuencia de degradacin de 9 aminocidos llamada caja de destruccin
situada cerca del extremo N terminal de Cdc13, que permite la adicin de una
cadena de poliubiquitinas que destina a Cdc13 al proteasoma.
Si esto es as, la sobreexpresin en la clula de un polipptido formado por los
70 aminocidos N terminales (N70) de la ciclina Cdc13, que contenga la caja
de destruccin bloquear la destruccin de Cdc13

Para comprobar esta hiptesis, analizas experimentalmente a 0, 12 y 14 horas


los efectos de la sobreexpresin de N70 sobre la concentracin celular de
Cdc13, como controles, introduces en el estudio otra protena ( Cut2) que
contiene tambin la caja de destruccin, dos protenas (Rum1 y Cdc18) que no
dependen de APC para su ubiquitinilacin y la protena Cdc2 que no es
ubiquitinilada. La deteccin de las protenas se realiza mediante
immunoblotting con anticuerpos especficos. Los resultados obtenidos
aparecen en la columna de la izquierda de la figura 8.

Figura 8. Niveles de cada una de


las protenas tras la expresin de
distintos segmentos N-terminales
de la protena Cdc13. Cada
versin de estos segmentos se
expresaba en levaduras en fisin a
partir del promotor nmt1 que
puede ser inducido aadiendo
tiamina al medio. La induccin
requiere aproximadamente 12
horas.

A) Describe los resultados.


B) Has obtenido algn resultado inesperado?
Para clarificar la situacin, preparas dos versiones diferentes de N70: una
(K0-N70) en la que has reemplazado las lisinas por argininas; Otra (dm-N70)
con una mutacin en la caja de destruccin y analizas los resultados que se
obtienen con la sobreexpresin de estas versiones. Los resultados obtenidos
aparecen en las columnas del centro y de la derecha de la figura 7.
C) Cmo pueden interpretarse estos resultados?
D) A la vista de estos nuevos datos, se te ocurre alguna explicacin para
los resultados obtenidos con N70?