Aspectos gerais da reproduo assistida

Roger Abdelmassih
A esterilidade atinge aproximadamente 20% dos casais e nos ltimos anos houve intenso desenvolvimento de
tecnologias, drogas e condies laboratoriais que possibilitaram o oferecimento de maiores chances de sucesso no
tratamento deste problema. No presente trabalho faremos um breve histrico da reproduo assistida e das tecnologias
que atualmente podem ser oferecidas com o intuito de propiciar melhores condies de desenvolvimento embrionrio
e, desta maneira, maiores taxas de gravidez.
INTRODUO
Ao conjunto de tcnicas que auxiliam o processo de reproduo humana foi dado o nome de tcnicas de reproduo
assistida (TRA), as quais podem ser divididas em mtodos de baixa e mtodos de alta complexidade. Entre as tcnicas
de baixa complexidade podemos incluir o coito programado e a inseminao intra-uterina (IIU), que apresentam a
vantagem de menores custos, alm de no precisarem ser realizadas em centros de reproduo assistida. Entre as
tcnicas de alta complexidade inclumos a fertilizao in vitro (FIV) convencional e a injeo intracitoplasmtica de
espermatozide (ICSI) (em ingls, intracytoplasmatic sperm injection).
Em 1870, John Hunter descreveu a inseminao artificial como mtodo de tratamento em um casal cujo marido
apresentava hipospdia. No final da dcada de 1970, a tcnica de FIV obteve seus primeiros resultados com o grupo
de Bourn Hall, na Inglaterra, chefiado pelos pesquisadores Patrick Steptoe e Robert Edwards (1). Em 1976, obteve-se
uma gestao ectpica aps a fertilizao in vitro e transferncia de um embrio (2). Em 1978, o mesmo grupo
descreveu a primeira gestao que utilizando esta tecnologia obteve sucesso - cujo resultado foi o nascimento de uma
criana do sexo feminino batizada com o nome de Louise Brown.
A paciente apresentava obstruo tubria bilateral, e a coleta do vulo foi feita em um ciclo natural, por meio de
laparoscopia. Este embrio foi fecundado em laboratrio e transferido ao tero 76 horas aps sua coleta, com obteno
de gestao (1). A primeira gravidez obtida com essa tcnica nos EUA ocorreu no ano de 1982 (4); no Brasil, em 1984
(5). Em 1989, os procedimentos passaram a ocorrer no nvel totalmente ambulatorial, o que levou a uma diminuio
no custo do processo, mantendo os mesmos resultados obtidos anteriormente.
No incio da dcada de 90, o grupo de Van Steirteghem relatou os primeiros estudos pr-clnicos em humanos com a
utilizao da ICSI. Em 1992, Palermo e colaboradores relataram as primeiras gestaes humanas e nascimentos com
a transferncia de embries aps a ICSI, tcnica que atualmente resulta na produo de mais embries com melhores
taxas de implantao. A conseqncia desse fato que a ICSI tem sido mundialmente usada com sucesso nos casos
de tratamento da infertilidade masculina resultante de oligoastenospermia severa, teratozoospermia e, mesmo,
azoospermia.
As TRA tm se desenvolvido de maneira extraordinria, at alcanarem o nvel da tecnologia empregada nos dias de
hoje, podendo oferecer taxas de gravidez de at 50%-55% em mulheres com at 35 anos de idade. Discutiremos
alguns aspectos dos procedimentos utilizados em reproduo assistida, com enfoque especial para a ICSI, tcnica que
trouxe nova revoluo reproduo assistida, permitindo a soluo do fator masculino severo e trazendo, no geral,
melhores taxas de fertilizao com a conseqente obteno de melhor qualidade embrionria.
1. Fertilizao in vitro (FIV)
A tcnica da FIV pode ser dividida em cinco fases:
Estimulao da ovulao
Coleta dos vulos
Manipulao dos gametas
Transferncia dos embries
Suporte da fase ltea
Os procedimentos para a realizao da FIV convencional e ICSI so os mesmos, exceto, obviamente, no momento da
manipulao dos gametas para o processo de fertilizao.
1.1 Estimulao da ovulao
Muitos protocolos de estimulao controlada da ovulao foram propostos, o mais utilizado o do bloqueio hipofisrio
seguido de estimulao ovariana com doses decrescentes de gonadotrofinas (Down regulation). Para o bloqueio do
eixo, utilizam-se os agonistas do GnRH (GnRHa), o que provoca um bloqueio hormonal seletivo na secreo de FSH

e LH pela hipfise. O protocolo mais utilizado o protocolo longo com administrao de GnRHa iniciada na fase ltea
do ciclo prvio ao tratamento, durante um perodo de 14 dias.
A presena do bloqueio identificada pela ausncia de cistos ovarianos e pela baixa dosagem de Estradiol (E2)
plasmtico (< 30 pg/ml). Uma vez instalado o bloqueio, mantm-se a administrao do GnRHa para manuteno e
inicia-se a estimulao direta dos ovrios com o uso de gonadotrofinas. Podem ser usadas as gonadotrofinas
associadas (hMG), as puras (FSHp, FSH-HP, FSHr), ou uma combinao das duas (hMG + FSH). A dose inicial
depende da idade da paciente e dos seus nveis hormonais de FSH naturais. A dose pode variar de 75 a 600 U.I. por
dia. O ajuste da dose pode ser feito de maneira progressiva (Step-up), ou regressiva (Step-down). Durante a
estimulao, o ciclo controlado diariamente utilizando dosagens sricas de E2 e USTV. A avaliao do
desenvolvimento folicular feita pela medio do dimetro mdio do folculo. Quando pelo menos dois folculos atingem
um dimetro de > 18-20 mm administra-se o hCG (10.000 U.I. IM) e 34 horas aps realiza-se a coleta dos vulos (7).
1.2 Coleta dos vulos
A coleta dos vulos realizada por via transvaginal, sob orientao ecogrfica. Aps cuidadosa antissepsia vaginal,
faz-se uma sedao leve usando um sedativo de ao ultracurta (Propofol) (8). Com a paciente anestesiada, d-se
incio puno. Aps a aspirao de todos os folculos retira-se o transdutor e a agulha, procedendo, a seguir, uma
reviso cuidadosa do fundo de saco, evitando-se hemorragias.
1.3 Manipulao dos gametas
Os tubos com lquido folicular so recebidos no laboratrio e seus contedos so colocados em uma pequena placa
de Petri estril plstica. Os vulos so identificados e classificados quanto maturidade. Posteriormente, so
transferidos para uma placa de Petri contendo meio de cultura previamente preparado e estabilizado, onde
permanecem at o momento da fertilizao.
Fertilizao in vitro convencional
O marido coleta a amostra seminal aps a aspirao, a qual preparada no laboratrio atravs da tcnica de gradiente
de Percoll (10). Faz-se uma avaliao da concentrao desta amostra, verificando-se a concentrao de
espermatozides mveis. Calcula-se o volume necessrio para inseminar uma quantidade de aproximadamente
100.000 espermatozides mveis por placa. Nos casos com baixa concentrao de espermatozides, pode ser
inseminada uma quantidade maior de espermatozoides por placa (500.000 espermatozides mveis por placa). A
amostra final adicionada aos vulos e estes permanecem em incubao pelo perodo de 16 a 18 horas.
Aproximadamente 24 horas aps a coleta dos vulos, os mesmos so examinados para verificao da fecundao.
ICSI (injeo intracitoplasmtica de espermatozide)
Os espermatozides podero ser obtidos diretamente do ejaculado, mesmo nos casos de fatores masculinos severos.
Outras tcnicas tambm foram desenvolvidas para a coleta de espermatozides, uma vez que para o uso dessas
tcnicas de micromanipulao so necessrios apenas alguns espermatozides. Assim, foram desenvolvidas a tcnica
de microaspirao do epiddimo direta (MESA) (17) e atravs da pele (percutnea - PESA) (18); aspirao direta do
testculo (TESA) (19) e extrao direta dos espermatozides do testculo (TESE) (19). Os ocitos so coletados em
lquido folicular puro e enviados imediatamente ao laboratrio de embriologia, onde so identificados e classificados
quanto ao grau de maturidade. Os ocitos no estgio de metfase II (MII) so injetados num perodo de 4 horas aps
a coleta. Os ocitos em metfase I permanecem em incubao para verificao da extruso do primeiro corpsculo
polar, num intervalo entre 4-8 horas aps a aspirao - e a microinjeo feita se isto ocorrer.
A microinjeo realizada pela utilizao das micropipetas de suco e de injeo. O dimetro externo da micropipeta
de holding (para apreender o ocito) de 60 a 80 m, e interno de 7 a 8 m; e para a micropipeta de injeo, 10 m
na parte externa e 5 a 6 m na parte interna . Ambas com um ngulo de 45, para facilitar a injeo.
Um nico espermatozide imobilizado mecanicamente, com uma batida na cauda usando a micropipeta de injeo
(Etapa I). A cauda aspirada primeiro para dentro da pipeta de injeo (Etapa II). O primeiro corpsculo polar
colocado na posio de 6 ou 12 horas, dependendo da posio da abertura da agulha de injeo. O ocito fixado
com uma pequena presso exercida pela micropipeta de suco. O espermatozide injetado dentro do ooplasma
com a micropipeta na posio de 3 horas (Etapas III e IV). Os ocitos so observados no dia seguinte, para verificao
da presena ou ausncia de proncleos e/ou corpsculos polares. Os embries selecionados para a transferncia (com
a menor taxa de fragmentao) so transferidos para uma placa de cultura previamente aquecida, e se mantm na
incubadora at a hora da transferncia.
Os embries excedentes so preparados para serem congelados e armazenados em nitrognio lquido. Em novembro
de 1992, o Conselho Federal de Medicina (CFM) publicou as normatizaes referentes aos tratamentos com
reproduo assistida. Uma das normas sugere que o nmero total de embries formados seja informado ao casal, para
que o mesmo possa optar por quantos embries sero transferidos. O nmero mximo de embries transferidos deve

ser quatro, para evitar uma alta taxa de gestaes mltiplas. Ainda segundo o CFM, os embries excedentes no
podem ser desprezados e devero ser criopreservados (11).
1.3.1 Tcnicas auxiliares
Assisted Hatching
O procedimento do assisted hatching (AH) foi introduzido no final de 1980. A observao de que os pr-embries que
se desenvolviam aps a PZD (disseco parcial da zona pelcida) possuam algo que aumentava as taxas de
implantao trouxe a idia de se criar um furo artificial na zona pelcida antes da transferncia intra-uterina. O AH pode
ser realizado nos embries em qualquer estgio de clivagem, de duas clulas at blastocisto. O melhor estgio celular
de desenvolvimento ainda no foi determinado. A maioria dos grupos realiza o procedimento no dia da transferncia
intrauterina, entre 65-72 horas aps a inseminao.
A tcnica pode ser realizada utilizando-se o cido de Tyrodes, ou com laser. As principais indicaes do assisted
hatching so:
Pacientes com idade avanada
Pacientes com diminuio da reserva ovariana
Espessamento da zona pelcida
Colorao anormal da zona pelcida
Fragmentao citoplasmtica excessiva
Embries com morfologia pobre e baixas taxas de crescimento
Remoo de fragmentos dos embries
Os fragmentos citoplasmticos so componentes da membrana do citoplasma que foram expelidos das superfcies dos
ocitos fertilizados e blastmeros dos pr-embries. Os pr-embries com excessiva fragmentao (>20%) tm uma
taxa de implantao mais baixa do que aqueles sem fragmentao. Vrios fatores podem ser responsveis pela
formao de fragmentos: condies de cultivo, competncia citoplasmtica, integridade gentica, cromossomos nobalanceados e alteraes da cariocinese e citocinese.
Fragmentos de citoplasma podem ser removidos, atravs de suco delicada, aps a abertura de um furo na zona
pelcida. No h evidncias de que a remoo de fragmentos interfere com o subseqente desenvolvimento dos prembries, desde que realizada de modo adequado; pelo contrrio, esse procedimento beneficia os pr-embries com
fragmentao.
A fragmentao dos pr-embries representa um dos principais fatores de falha da FIV, pois reduz a quantidade de
citoplasma disponvel para as sucessivas divises dos blastmeros e faz com que os fragmentos sem ncleo possam
sofrer um processo apopttico, potencialmente prejudicial para os blastmeros viveis. Por essas razes, as tentativas
de remoo precoce dos fragmentos ajudam alguns embries a manifestar todo o seu potencial de crescimento. A
remoo de fragmentos tenta imitar o processo natural de eliminao de clulas apoptticas pelas clulas do sistema
imune (remoo assistida de clulas apoptticas), j que os pr-embries e os fragmentos expressam precocemente
os marcadores apoptticos na membrana celular. Esses marcadores sinalizam, fisiologicamente, sua iminente
remoo. Na realidade, o papel dos processos apoptticos durante o desenvolvimento dos pr-embries humanos
precisa ser mais bem estudado.
2. Diagnstico gentico pr-implantacional
Consiste na realizao de uma bipsia embrionria, ou seja, a retirada de um ou mais blastmeros que sero
posteriormente analisados para a deteco de alteraes genticas. Para o sucesso dessa tcnica preciso obedecer
alguns pontos, tais como:
O blastmero removido deve estar intacto e apropriado para o procedimento de diagnstico;
O embrio biopsiado deve manter o potencial para desenvolver-se e implantar-se dentro do endomtrio.
Os embries mais indicados para o diagnstico de pr-implantao so os embries em diviso celular com 8 clulas.
Inmeros estudos demonstram que um embrio com 8 clulas, biopsiado, tem o mesmo potencial de um embrio nobiopsiado de chegar ao estgio de blastocisto, aps dois ou trs dias em cultura in vitro.
Trs diferentes procedimentos de bipsia tm sido mostrados para a remoo de um ou dois blastmeros de um
embrio com 8 clulas:

Afinamento qumico da zona pelcida (zona drilling) e aspirao dos blastmeros;

Disseco parcial da zona pelcida, retirada do blastmero por presso no embrio e aspirao do blastmero exposto;
Introduo da agulha diretamente no embrio e aspirao do blastmero.
Ressalte-se que estes trs tipos de procedimentos s podero ser realizados com as tcnicas de micromanipulao.
At agora, as trs maiores aplicaes do PGD (Pre-implantacional Genetic Diagnostic) so: O sexo de um pr-embrio
pode ser confiavelmente determinado atravs da FISH (fluorescente in situ hibridization) usando probes especficos
para os cromossomos X ou Y. Dessa forma, doenas ligadas ao sexo podem ser determinadas e evitadas; A
enumerao da composio cromossmica pode ser conseguida atravs da FISH, permitindo, assim, a determinao
da ploidia exata do pr-embrio concomitante com o diagnstico de certas aneuploidias mais comuns. A FISH pode
ser tambm usada para detectar anomalias cromossmicas estruturais em casos de translocaes balanceadas;
Defeitos genticos envolvendo um nico gene (tais como fibrose cstica, anemia falciforme, doena de Tay-Sachs) e
outras doenas comuns com alteraes genticas podem ser detectadas pela PCR (Polymerase Chain Reaction).
2.1 Transferncia de embries
A transferncia dos embries feita 48 horas, 72 horas ou 5 dias (transferncia de blastocisto) aps a coleta dos
vulos, e segue o mesmo procedimento independente da tcnica de manipulao utilizada nos gametas.
Uma vez preparada a paciente, solicita-se o cateter de transferncia, contendo os embries, ao laboratrio de
gametas.Ocateter deve ser posicionado no interior da cavidade uterina, tcnica que parece obter maior sucesso quando
acompanhada por ultra-sonografia plvica. Uma vez posicionado o cateter, injetam-se os embries, delicadamente,
mantendo-se o mbolo pressionado durante 40 segundos, at a retirada do cateter a manuteno do mbolo
pressionado evita o retorno dos embries ao cateter. No 12o dia aps a transferncia realizada a dosagem da
subunidade Beta do hCG (B-hCG) para diagnstico da presena de gravidez.
Confirmando-se a gravidez, solicita-se que a paciente retorne por volta do trigsimo dia ps transferncia para
avaliao das presenas de sacos gestacionais, plo embrionrio e batimentos cardacos fetais. Outros exames ultrasonogrficos so agendados para avaliao da evoluo da gravidez.
2.2 Suporte da fase ltea
Em ciclos que utilizam os agonistas do GnRHa pode ocorrer durante a fase ltea uma falha na produo hormonal de
Progesterona (P4) e Estradiol (E2) (21). Nestas falhas hormonais a dose de progesterona plasmtica pode cair a nveis
mnimos, provocando descamao e sangramento endometrial.
Devido a esses fatos, recomenda-se a utilizao de suporte hormonal na fase ltea, visando a manuteno dos nveis
hormonais e a manuteno da estimulao ovariana para produo hormonal (Progesterona e Estradiol).
CONCLUSES
Desde o desenvolvimento das tcnicas de reproduo assistida, obtivemos importantes vitrias no sentido da resoluo
do problema do casal infrtil. No final da dcada de 70 e incio da dcada de 80, obtinha-se 5% de taxa de gravidez
por ciclo (nesta poca o ocito era obtido em ciclos naturais). Com o advento das gonadotrofinas na primeira metade
da dcada de 80, estas taxas de gravidez elevaram se para aproximadamente 12% por ciclo. No incio dos anos 90, a
melhoria das condies laboratoriais elevou estas taxas para 30% por ciclo. Atualmente, o mtodo de ICSI associado
a todas estas novas tecnologias pode oferecer 45%-50% de taxa de gravidez por ciclo de tratamento.