TRANSFERENCIA GNICA EN ANIMALES

Por:

Patricia Narbn Fernndez

Trabajo Final
Experto Universitario de Biotecnologa Aplicada a los Alimentos
UNED

Profesoras Gua:
Dra. Estrella Corts Rubio. Profesora Titular de Universidad. rea: Bioqumica y
Biologa Molecular.
Dra. Gloria Morcillo Ortega. Profesora Titular de Universidad. rea: Biologa
Celular.

Junio, 14 del 2008

INDICE

1. Introduccin, pag.3
2. Transferencia de ADN a clulas animales, pag.5
3. Vectores de transferencia gnica, pag.5
4. Transfeccin de clulas somticas animales, pag.8
5. Transgnesis en animales, pag.9
6. Transferencia gnica por microinyeccin, pag.11
7. Transferencia gnica con trasposones, pag.16
8. Transferencia gnica con vectores virales, pag.19
9. Transferencia gnica mediada por semen, pag.22
10. Transplante de ncleos y clones, pag.24
10.1. Clonacin, pag.24
10.2. Mtodos de clonacin, pag.24
10.3. Clonacin de la oveja Dolly, pag.30
10.4. Transferencia nuclear de clulas trasfectadas diploides fetales,
pag.31
10.5. Transferencia nuclear Honolulu, pag.32
10.6. Aplicaciones de la clonacin mediante la tcnica de transferencia
nuclear, pag. 33
11. Generacin de animales knockout, pag.40
11.1. Generacin de ratones knockout, pag.40
11.2. Condicional knockout, pag.42
11.3. Aplicaciones de las tcnicas knockout, pag.43
12. Modelos de animales transgnicos, pag.45
12.1. Animales transgnicos como fbricas de protenas: Vaca transgncia
productora de hormona del crecimiento, pag.45
12.2. Animales transgnicos resistentes a mastitis: Vaca resistente a la
infeccin intramamaria, pag.48
13. Bibliografa, pag.52

Introduccin

Despus de algunos problemas iniciales, el desarrollo y comercializacin de

cultivos modificados genticamente registr un crecimiento considerable, pero
los productos derivados de animales de granja modificados genticamente no
han llegado a los principales sistemas de produccin de alimentos. Aunque se
han insertado experimentalmente ms de 50 transgenes diferentes en
animales de granja, estas iniciativas requieren todava unos conocimientos
tcnicos considerables y no son tan habituales como en el caso de las plantas.
Las investigaciones iniciales en la obtencin de animales transgnicos de
granja han ido acompaadas tambin de perturbaciones manifiestas en la
fisiologa, incluidas deficiencias en el proceso reproductivo. Estas experiencias
han suscitado problemas ticos en cuanto al bienestar de los animales y han
reducido ulteriormente el inters de los consumidores.
Hasta el momento, la perspectiva de alimentos obtenidos de animales
transgnicos de granja no ha sido bien recibida por los consumidores. Las
encuestas indican sistemticamente que el pblico acepta de mejor grado las
plantas transgnicas que los animales transgnicos. La experimentacin con
animales y su alteracin es menos aceptable y tiene repercusiones ms
amplias. Diversas culturas y religiones limitan o prohben el consumo de
ciertos alimentos derivados de animales. Sin embargo, la ingestin o inyeccin
de ciertos productos farmacuticos derivados de animales transgnicos parece
ms aceptable para el pblico.
Se han llevado a cabo investigaciones con resultados muy satisfactorios sobre
peces modificados genticamente, pero ninguno de estos peces es objeto de
comercio. En la mayora de los casos se trata de especies utilizadas en
acuicultura en las que se han insertado los genes que regulan la produccin
de hormonas del crecimiento con objeto de aumentar la tasa de crecimiento y
el rendimiento de los peces cultivados. Se han planteado cuestiones ticas
relativas al bienestar y a los efectos ambientales de estos peces modificados
genticamente, pero tambin se ha sostenido que los peces modificados
genticamente comparten muchos atributos de especies y genotipos de peces
exticos seleccionados por medios convencionales, y que ambos casos
constituyen medios comprobados y aceptados de aumentar la produccin en el
entorno acutico.
Dado que uno de los principales problemas para la obtencin de animales
manipulados genticamente viables y seguros radica en las tcnicas de
transformacin gnica empleadas, este trabajo se ha centrado en el estudio de
las tcnicas disponibles y su aplicacin. Actualmente siguen presentndose
problemas en los animales manipulados genticamente, algunos de los cuales
se citan a continuacin:
-

Integracin mltiple del transgen

Lugar de integracin indeterminado
Mutilacin y falta de expresin

Mosaicismo (germinal y somtico)

Expresin especfica/ectpica
Expresin variable
Expresin variable dentro de lneas (variegacin)
Elevada mortalidad durante el desarrollo embrional inicial y tasas de
xito de slo el 1-3 por ciento.
De los animales transgnicos nacidos, es posible que los genes
insertados no funcionen como se esperaba, lo que frecuentemente da
lugar a anormalidades anatmicas, fisiolgicas y de comportamiento.

En la medida en que se vayan perfeccionando las tcnicas de transferencia

gnica en animales, junto con otras tcnicas del proceso igualmente
importantes (mejoramiento de los constructos), se podrn obtener mayores y
ms seguras aplicaciones en las diferentes reas en las que se ha venido
trabajando los ltimos aos:
-

Mejora de caracteres productivos

Resistencia a enfermedades
Modelos animales de enfermedades humanas (ratones knockout)
Animales transgnicos como biorreactores para la sntesis de las
protenas de alto valor (protenas teraputicas): granjas farmacuticas o
granjas moleculares
Donacin de rganos a partir de animales transgnicos:
Xenotransplantes
Produccin de alimentos ms saludables a partir de animales
transgnicos en los que se vara la composicin nutricional de los
animales y/o los productos que generan
Modificacin gentica de insectos vectores de enfermedades
Produccin animal ms limpia para el medioambiente: que puedan
digerir ciertas formas de fsforo vegetal (fitatos) que les permite crecer
ms con raciones de menor calidad y con una eliminacin menor de
fsforo en sus excretas (lo que representa menor contaminacin
hdrica).
Controladores biolgicos modificados: consiste en la mejora mediante
ingeniera gentica de invertebrados depredadores o parasitoides que
han sido tradicionalmente usados como agentes de control biolgico.
Otras aplicaciones: Corresponden a propsitos ornamentales o
estticos. Se han incorporado protenas fluorescentes de medusa en
peces de acuario o incluso en conejos, para hacerlos ms atractivos o
generar hechos artsticos (arte transgnico).

Transferencia de ADN a clulas animales

Las clulas animales pueden incorporar ADN por distintos mtodos como
microinyeccin directa, electroporacin, encapsulacin de ADN en membranas
artificiales (liposomas) seguido de su fusin con membranas celulares,
vectores basados en virus, YAC o mediada por clulas germinales. En general,
el ADN introducido por cualquiera de estos mtodos se integra en el genoma
del hospedador.
La transferencia de genes depende de la introduccin de secuencias de ADN
en el ncleo de una clula somtica, germinal, clula huevo fecundada o una
clula madre embrionaria, seguido de la integracin del ADN en un sitio del
cromosoma.

Vectores de transferencia gnica

Un vector de transferencia gnica es el vehculo empleado para introducir ADN
en una clula u organismo.
Existen dos grandes grupos de vectores, virales y no virales. Los primeros
incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus tratando de
eliminar sus caractersticas patolgicas y de adaptarlos a su nueva funcin
como transportadores de material gentico heterlogo. Pretenden aprovechar
la ventaja que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido
procesos de evolucin complejos a lo largo de millones de aos para optimizar
la funcin de introductores de material gentico en las clulas que invaden.
Los vectores no virales siguen una estrategia de sntesis en lugar de
modificacin. Parten de estructuras sencillas conocidas e intentan reconstruir
desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el transporte
efectivo de genes en el interior de la clula. Existen tambin vectores
biolgicos no virales (bacterianos) como portadores de genes teraputicos, pero
son los menos estudiados.

Fig1. Tipo de vectores y proceso esquematizado de obtencin.

Las caractersticas de un vector ideal para poder adaptarlo luego a situaciones

concretas seran las siguientes:
-

Que sea reproducible

Que sea estable
Que permita la insercin de material gentico sin restriccin de tamao
Que alcance concentraciones elevadas (> 108 partculas/ml)
Que permita la transduccin tanto de clulas en divisin como
quiescentes
Que posibilite la integracin especfica de gen
Que reconozca y acte sobre clulas especficas
Que la expresin del gen pueda ser regulada
Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune
Que pueda ser caracterizado completamente
Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios
Que sea fcil de producir y almacenar a coste razonable

El vector es una parte importante en el sistema de transferencia gnica, pero

el sistema consta de dos componentes: el vector (vehculo de transporte) y el
cargo (material a ser transportado). El cargo a su vez se subdivide en: el
efector (gen a introducir) y el soporte (los elementos que condicionan su
expresin).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmdico (ADN bicatenario y
circular), aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un
simple oligonucletido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar
una cantidad elevada de material gentico con capacidad de perpetuacin en
el tiempo.
El efector que se utilice depender del efecto que se persiga. Si se pretende
compensar, sustituir o reparar un gen daado, el efector debe ser una copia
del gen intacto o un elemento que permita su reparacin. Si se pretende
inducir un efecto biolgico concreto (eliminar especficamente un tipo de
clulas, bloquear la expresin de un virus, inducir una respuesta inmune),
se pueden introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que
originen nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido.
El soporte es la base para el control de la expresin del transgen e incluye
distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el
promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de
transcripcin. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulacin de
la expresin gnica. Se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
promotores especficos, que slo son activos en un tipo celular concreto. De la
misma manera se pueden emplear promotores inducibles, que requieren la
presencia de un elemento concreto para ejercer su funcin. ste puede ser un
agente de adiccin exgena (control externo) o un agente determinado por
caractersticas fisiolgicas especiales (como por ejemplo promotores activos
ante situaciones de hipoxia). Otros elementos del soporte que pueden ser
importantes dependiendo de la funcionalidad perseguida son los potenciadotes
y represores de los promotores, secuencias de aislamiento (insulators) que
impiden las influencias de secuencias reguladoras prximas, secuencias de

integracin (para permitir la inclusin del material exgeno dentro del genoma
de la clula hospedadora), secuencias de recombinacin homloga (para
permitir el intercambio de material gentico con el genoma hospedador con
una regin especfica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el
material gentico en el interior de un vector viral), secuencias
inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas
que sirven como coadyuvantes en las vacunas de ADN)
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material
gentico transportado y de vencer todas las barreras biolgicas hasta alcanzar
su destino final, el ncleo de la clula diana, donde tiene lugar la regulacin
gnica. Tambin de ellos va a depender la va de administracin a utilizar.
En los casos de transferencia gnica en individuos postnatales, el vector ha de
solventar barreras en su camino hacia su destino funcional. Entre estas
barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su
degradacin y eliminacin), el reconocimiento de la clula diana (generalmente
mediante un receptor especfico), su unin a la membrana, su internalizacin
en la clula (normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como
la endocitosis), el escape de los sistemas de degradacin intracelular
(lisosomas) y su entrada final al ncleo, donde debe desmantelarse para
permitir que el material gentico que transporta gane acceso a su ubicacin
final y a la maquinaria de transcripcin.

Fig2. Puntos clave para regular la eficacia de un vector de transferencia gnica

que se introduce en el individuo

Transfeccin de clulas somticas animales

La transfeccin de clulas somticas es til para el cuidado medico y
veterinario de enfermedades genticas, y para otros propsitos teraputicos o
de mejoramiento de animales.
La transferencia de genes a clulas somticas puede hacerse en el laboratorio
(ex vivo) o directamente a las clulas en el cuerpo (in vivo). En la forma ex vivo,
se extraen clulas del individuo para ser transformadas (proceso por el cual se
transfiere exitosamente un gen a una clula) con el vector que contiene la
versin normal del gen. Este mtodo tiene la ventaja de que la transferencia de
genes es ms eficiente y permite la propagacin de las clulas transformadas
para generar grandes cantidades. La desventaja es que slo es utilizable para
el individuo especfico del cual se extrajeron esas clulas, adems de ser
costoso por la gran manipulacin y control de calidad requeridos. En el
mtodo in vivo se administra el vector (que contiene el gen normal) a los
individuos. Este mtodo puede utilizarse con muchos individuos, lo que
disminuye su costo y la infraestructura necesaria, pero resulta complicado de
controlar y la eficiencia es mucho menor.

Fig. 1. Sistemas para transferir genes a clulas somticas en individuos

Los vectores son los vehculos microscpicos que se utilizan para transferir
genes a las clulas, a continuacin se exponen sus caractersticas y su
relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales, no virales y fsicos.
Virales: El mtodo ms eficaz para llevar genes sanos a las clulas daadas
es por medio de virus que han sido adaptados como vectores. Los virus son
tiles ya que pueden penetrar naturalmente las clulas, insertando en ellas su
material gentico.

Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para
eliminar los genes virales que les permiten replicarse y causar enfermedad. A
estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y entre los ms
utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus
adeno-asociados. Tambin se han desarrollado poxvirus (especialmente el
virus de la vaccinia) para vacunas y terapias gnicas. Actualmente, los
vectores virales son los ms eficientes para transformar clulas, aunque no
carecen de desventajas: son de manufactura costosa, hay lmites a la cantidad
de genes (es decir, la longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser
insertados en los vectores y que pueden llegar a desencadenar una respuesta
inmune (inmunogenicidad).
No virales: Bsicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que
contiene el gen de inters directamente a las clulas o empacado dentro de
otras molculas como son los liposomas (pequeas vesculas de grasa que
pueden transportar sustancias al interior de las clulas). Los vectores no
virales son menos eficientes para transformar clulas, pero no tienen limites
para el tamao del inserto (el tamao del ADN que se va a inyectar), son
menos inmunognicos y ms fciles de elaborar.
Fsicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporacin. Los
inyectores sin aguja utilizan alta presin para insertar el ADN en clulas de la
piel o en clulas en cultivo, mientras que la electroporacin utiliza pulsos
elctricos que abren temporalmente agujeros en las membranas de las
clulas, permitiendo insertar el ADN. Los mtodos fsicos an son ineficientes
en la transformacin y tienen un rango limitado de aplicacin.
Los riesgos de la terapia gnica continan siendo difciles de cuantificar. Por
ello cada ensayo debe comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de
la dosis de vectores que contengan los genes que se pretende insertar. Estos
riesgos tomaron una nueva dimensin en el otoo de 1999, cuando un joven
de 18 aos muri cuatro das despus de haber iniciado un tratamiento con
terapia gnica. Los mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies
animales manipuladas genticamente.

Transgnesis
La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un
genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a
todas las clulas en los organismos multicelulares. Generalmente, en
animales, el ADN extrao, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los
embriones que hayan integrado el ADN extrao en su genoma, previamente a
la primera divisin, producirn un organismo transgnico; de modo que el
transgn pasar a las siguientes generaciones a travs de la lnea germinal
(gametos).
Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y

su regulacin.
Manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo.
Estudiar la funcin de genes especficos.

Poder utilizar a mamferos como biorreactores para la produccin de

protenas humanas.
La correccin de errores innatos de metabolismo mediante terapia
gnica.

La transgnesis se puede efectuar siguiendo dos estrategias comunes,

microinyeccin de zigotos y la manipulacin de clulas embrionarias, las
cuales se describen brevemente a continuacin:
1. Transgnesis por microinyeccin de zigotos
Desde que en 1982 se obtuviera un ratn transgnico, la produccin de
animales transgnicas es cada vez ms cotidiana, existiendo ya
animales transgnicos de las siguientes especies: ratn, rata, conejo,
cerdo,
vaca,
cabra
y
oveja.
La tcnica se realiza, fundamentalmente por microinyeccin y se realiza
de la siguiente forma:
o

En la primera fase, se aslan un nmero grande de vulos

fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un
tratamiento hormonal para provocar una superovulacin.
La fertilizacin puede hacerse in vitro o in vivo.
En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a
uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una
solucin que contiene ADN.
En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en hembras
que actuarn como nodrizas permitiendo la gestacin hasta
trmino.

Por ltimo, tras el destete de los recin nacidos, stos se chequean,

para ver si ha ocurrido la incorporacin del transgn.
2. Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias.
Una estrategia ms poderosa para la transgnesis implica la
introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias totipotentes
(clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas EM).
Estas clulas se toman del interior de la blstula en desarrollo y se
pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se
conseguir que las clulas no se diferencien, y se mantiene su estado
embrionario.
El ADN extrao se introduce en las clulas ES mediante diversas
tcnicas, posteriormente las clulas transfectadas son reintroducidas
en una blstula y sta reimplantada en una hembra.
Con esta tcnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de
stas se consiguen animales transgnicos con aquellas quimeras que
hayan incorporado el transgn en su lnea germinal

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El ganado transgnico que se emplea para producir protenas teraputicas,

debe contener en el ADN extrao de sus clulas, adems del gen codificante de
la protena, una secuencia o promotor que haga que se exprese dicho gen en
unas
determinadas
clulas
solamente.
Por ejemplo, si se quiere que la protena se produzca junto con la leche, el
transgn se fusiona con una secuencia reguladora de una protena de la leche,
con lo que la protena slo se formar en las clulas de glndulas mamarias.
Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo
una protena humana, la alfa-antitripsina bajo la direccin del promotor ovino
de la beta-lactoglobulina. Dicha protena se produce en una cantidad de 35
g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.
Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la
protena C humana que controla la coagulacin sangunea y es necesaria para
los hemoflicos.
Adems de estas tcnicas existen otras alternativas que se describirn ms
adelante, y algunas de las cuales son una combinacin.

Transferencia gnica por microinyeccin

Microinyeccin pronuclear: pequeas cantidades del ADN de inters

(transgen) eran inyectadas en el proncleo de un embrin al estado de
dos clulas. Aunque ampliamente aceptada y utilizada en forma
rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy poco progreso para
mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%,
dependiendo de la especie considerada.

En la dcada del 80 ocurri un importante avance en la tecnologa de

animales transgnicos que marc el curso de la investigacin en este campo
por al menos dos dcadas. Gordon y colaboradores describieron una tcnica
donde el ADN desnudo fue inyectado en el proncleo de un ovocito de ratn
recientemente fertilizado, el que posteriormente se transfiri a hembras
receptoras sincronizadas. Este experimento demostr que era posible usar un
plsmido recombinante como vector para transferir genes forneos
directamente hacia el embrin. El ADN inyectado de esta forma se integr en
el genoma y pudo ser heredado por la descendencia de los animales
transgnicos fundadores. La inyeccin de embriones al estado de una clula
fue clave para obtener una integracin temprana del transgen, permitiendo al
ADN forneo contribuir en el genoma de todas las clulas somticas y la lnea
germinal.
Generacin de los ratones transgnicos:
En una primera fase se aslan un nmero grande de ovocitos fertilizados, los
que se consiguen sometiendo a la hembras a un tratamiento hormonal para
provocar una mayor ovulacin.
En una segunda fase los ovocitos recin fertilizados se manipulan uno a uno,
y con una micropipeta a modo de aguja se introduce una solucin que
contiene ADN. El ADN purificado es inyectado directamente en el pronucleo

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masculino de un zigoto, utilizando para ello un micromanipulador acoplado a

una pipeta con presin negativa y otro manipulador a acoplado a una aguja de
inyeccin

Fig3. Instrumental para microinyeccin pronuclear

Fig.4

Fig.5

Fig. 4 y 5. La figura de la izquierda (4) representa un dibujo esquemtico de

cmo se introduce el ADN por microinyeccin en el pronucleo del zigoto. A la
derecha (5) hay una foto tomada en tiempo real es la que se observa lo descrito
anteriormente.
En la tercera fase estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn
como nodrizas permitiendo el trmino de la gestacin. Se implantan de 20-30
zigotos en el oviducto de una hembra semipreada (recientemente apareada
con un macho vasectomizado. Alrededor de 19 das ms tarde se nacen de 5-8
cras. Los animales transgnicos se identifican mediante anlisis de PCR a
partir de ADN extrado de las colas de los ratones de tres semanas de vida. Los
transgnicos son verificados posteriormente por Southernblots.

12

Fig.6. Implantacin de vulos transfectados e Identificacin de ratones

transgnicos nacidos mediante la tcnica de PCR
Los ratones positivos para la prueba PCR son cruzados con animales controles
para identificar a los fundadores, es decir, aquellos que tienen el transgen
insertado en su lnea germinal.
La eficiencia de transgnesis con este mtodo es menor al 5%. La integracin
del transgen en el genoma del ratn es al azar y los niveles de expresin son
variables.
En ciertos casos la integracin del transgen tambin ocurri despus de la
primera divisin del zigoto, lo que result en animales fundadores mosaicos.
Estos animales mosaicos an transmiten el transgen a la descendencia pero lo
hacen a una frecuencia menor al 50%. Desgraciadamente, la eficiencia para
generar animales transgnicos utilizando esta tecnologa es baja,
particularmente en animales de granja. La eficiencia de la inyeccin
pronuclear est controlada por una serie de factores como quedara
demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores en 1985, quienes
entregaron valiosa informacin sobre la integracin de los transgenes y
permitieron establecer que la concentracin y la forma (circular o linear) del
ADN eran los factores ms crticos para una eficiente integracin. No se
encontraron diferencias significativas cuando el proncleo femenino o
masculino era utilizado para la inyeccin, aunque este ltimo es preferido por
ser ms grande. Por otro lado, el cruzamiento de ratones hbridos (por ejemplo
C57BL x SJL) fue ms exitoso en la produccin de animales transgnicos que
las lneas consanguneas (C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyeccin
de proncleos como un nuevo mtodo para modificar el genoma de los
animales revolucion la forma en que los investigadores pudieron analizar la
expresin de los transgenes y paviment el camino para la generacin de los
primeros animales transgnicos de granja en 1985.
Desde entonces, la tecnologa ha sido implementada con xito en la mayora
de los animales domsticos como en conejos, por Buhler y colaboradores en
1990, ovejas, por Wright y colaboradores en 1991, cabras por Ebert y
colaboradores en 1991, vacas por Krimpenfort y colaboradores en 1991 y
cerdos por Wall y colaboradores en 1990. Sin embargo, adems de los
problemas asociados con la integracin de los transgenes hay ineficiencias
asociadas con la recoleccin, cultivo de los huevos fertilizados y transferencia

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de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores como el largo
perodo de gestacin y el bajo nmero de animales por generacin, sumado al
costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta adopcin de
estas tecnologas, especialmente en los pases menos desarrollados.
Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el
uso de genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de
la hormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la
eficiencia de conversin por Pursel y Rexroad en 1993. Estos estudios
mostraron los problemas de la inyeccin pronuclear con relacin al control de
los niveles de expresin del transgen. Se encontr una gran variacin de
expresin en las lneas de animales transgnicos generados, siendo sta en
general muy pobre, especialmente si no todos los elementos reguladores del
transgen eran incluidos en la construccin gentica (plsmido). Esto llev a
que muchos investigadores dedicaran mayores esfuerzos a entender la forma
en que los transgenes se insertan en el genoma del animal y los factores que
afectan la expresin de los mismos. Esto explica por qu la mayora de los
experimentos dirigidos a alterar la composicin de la leche han sido realizados
principalmente en el ratn, aunque existen algunas notables excepciones tales
como la secrecin de protenas de valor teraputico como el factor IX de la
coagulacin en la leche de ovejas por Wright y colaboradores en 1991, el
activador de plasmingeno de tejido en la leche de cabras por Ebert y
colaboradores en 1991 y la lisozima humana en la leche de bovinos por
Krimpenfort y colaboradores en 1991. Sin embargo, dada la baja eficiencia de
esta tecnologa, sumado a los costos involucrados, es que ha habido una
bsqueda constante por nuevas alternativas.
En trminos generales, a continuacin se presenta una grfica con los niveles
de eficiencia de la tcnica para diferentes especies de animales:

Fig.7. Niveles de eficiencia de la microinyeccin pronuclear para diferentes

especies de animales.

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- Microinyeccin de ADN en clulas embrionarias: manipulacin de las

clulas madre embrionarias de ratn (ES cells) apareci como una potencial
solucin para muchos de los problemas encontrados con la tcnica de
microinyeccin pronuclear.
Transformacin gentica mediante recombinacin homloga en clulas madre
embrionarias (ES cells). El aislamiento de clulas madre embrionarias de
ratn, en 1989 por Thompson y colaboradores, abri nuevas posibilidades
para estudiar la funcin gnica en animales transgnicos. Las clulas madre
embrionarias se obtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se
pueden mantener en cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la
presencia en el medio de cultivo de factores inhibitorios de la diferenciacin.
Estas clulas pueden ser manipuladas in vitro va recombinacin homloga,
permitiendo as alterar la funcin de genes endgenos. Las clulas as
modificadas pueden ser entonces reintroducidas en blastocistos receptores
contribuyendo eficientemente a la formacin de todos los tejidos en un animal
quimrico incluyendo la lnea germinal. Esta tecnologa posibilita
modificaciones genticas muy finas en el genoma del animal, tal como la
introduccin de copias nicas de un gen. La incorporacin de una copia nica
de un gen en un sitio predeterminado del cromosoma tiene las ventajas de
permitir controlar el nmero de copias del transgen y se puede controlar la
insercin de este en un sitio favorable (transcripcionalmente activo) para su
expresin tejido-especfica.
Utilizando esta tecnologa ha sido posible anular la funcin de genes
endgenos del ratn mediante la integracin de un marcador de seleccin, lo
que ha permitido la generacin de varios cientos de ratones llamados knock
out que han servido como modelos de enfermedades genticas en humanos y
como modelos para analizar la funcin de genes endgenos (Melton, 1994;
Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).

Fig.8. Representacin de las tcnicas de microinyeccin pronuclear y

microinyeccin de clulas embrionarias

15

Transferencia gnica con transposones

Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen
genes adicionales a parte de los necesarios para la transposicin y estn
dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta categora se encuentran los
trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de
Drosophila, secuencias Alu de mamferos, retrotrasposones

CLASE I: MEDIANTE DNA

Elementos IS (Is1, IS2, IS3, IS30,
IS200, etc)
Transposones compuestos (Tn5, Tn10,
etc)
I.I PROCARIOTAS
Transposones de la familia Tn3
Bacterifagos (Mu, lambda, P22, etc)
Sistemas de inversin
I.II. EUCARIOTAS

Elementos controladores del Zea mays

(Ac, Mu, Sm, etc)
Elementos P de Drosophila

CLASE II: MEDIANTE RNA

Superfamilia vrica
Retrovirus, LINE, Ty, ...
II.II EUCARIOTAS

Superfamilia no vrica
SINE Alu y B1 de mamferos,
pseudogenes procesados derivados de
la polimerasa II

Fig.9. Clasificacin de los elementos transponibles

16

Fig.10. Estructura bsica de los trasposones

Los trasposones son secuencias de material genmico que tienen la

capacidad del saltar fuera y dentro del genoma. Son capaces de
autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios dentro del
genoma (trasponerse o saltar). Pueden entrar en plsmidos y ser
propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la capacidad de ser
transferidos exitosamente en clulas y genomas extraos.
La ingeniera gentica puede manipular estos trasposones para llevar a
cabo transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de
genes es la transferencia de material gentico entre clulas y genomas que
pertenecen a especies no relacionadas, por procesos distintos a la
reproduccin. Un ejemplo de ello es el uso de los trasposones de
salmnidos para la transferencia gnica en vertebrados. Los trasposones
de vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mnimo un gen
nico que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos repeticiones
terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de
20-30 p.b. de interaccin con la trasposasa. La trasposasa interacciona
con estos sitios para cortar el trasposn, luego interacciona con secuencias
presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposn en el nuevo
locus. En vertebrados todos los trasposones que se han detectado estn
inactivados por mutaciones. Sin embargo recientemente se ha obtenido un
trasposn activo de salmnidos mediante mltiple mutagnesis dirigida.
Dicho transposn denominado Bella durmiente o Sleeping beauty (SB)
se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como
vehculo de incorporacin de nuevos genes y para inactivar genes en el
genoma por insercin.

17

Fig.11. Esquema de un procedimiento para integrar genes en clulas

usando trasposones.

18

Transferencia gnica con vectores virales

Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de
un virus, tratando de eliminar sus caractersticas patolgicas y adaptarlos
a una nueva funcin como transportadores de material gentico
heterlogo. Pretenden aprovechar las ventajas que aportan los virus como
vectores naturales que han sufrido procesos de evolucin complejos a lo
largo de millones de aos para optimizar su funcin de introductores de
material gentico en las clulas que invaden. Para modificar un virus y
transformarlo en un vector de transferencia gnica en animales, el primer
paso es bloquear su capacidad de propagacin eliminando los genes
responsables de su replicacin. El segundo paso es la eliminacin de parte
del genoma viral para crear espacio para introducir el material gentico de
inters (gen o genes, ms los elementos de control). Se han de eliminar
genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos que puedan
resultar txicos o perjudiciales para el individuo a manipular.
La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la
posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgen en el genoma de la
clula hospedadora. Por otro lado presentan desventajas como su falta de
especificidad celular en la mayora de los casos, la limitacin del tamao
(debido a que han de empaquetarlo en la cpsida), su elevada
inmunogenidad y el riesgo biolgico que conllevan (reconstitucin de
partculas replicativas por recombinacin, y oncogenidad inducida por
integracin inespecfica.
Se han usado retrovirus y lentivirus como vectores para integrar
transgenes en genomas animales. Esta tcnica se ha usado en ratones con
xito y se ha extendido a gallinas, vacunos y suinos.
-

Vectores retrovirales

Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de
transduccin en un gran nmero de tipos celulares, son capaces de integrarse
de forma estable en el genoma de las clulas que infectan sin expresar
ninguna protena viral inmunognica, y son relativamente poco patognicos,
con excepcin de algunos como el VIH. La mayora de ellos derivan del virus
de la leucemia murina (MuLV).
En general, su principal limitacin es que slo pueden transducir eficazmente
clulas en divisin, ya que el acceso al ncleo del complejo de preintegracin
requiere la ruptura de la membrana nuclear. Hay un tipo de retrovirus, los
lentivirus, que si que pueden infectar e integrarse en clulas quiescentes,
como el VIH y SIV, pero el riesgo inherente al uso de los mismos limita su
aplicacin.
Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca
estabilidad de las partculas y su baja tasa relativa de produccin. Esto ha
sido parcialmente resuelto con la sustitucin de la protena de la envuelta por
la glicoprotena G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la
obtencin de ttulos de hasta 109 p.i. /ml y estabiliza las partculas.

19

Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando
se quiere transducir selectivamente una poblacin celular, se le incorporan
ligandos heterlogos o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas
especificidades. Son vectores que poseen protenas quimricas en la envuelta.
Contrario a la percepcin de muchos, los primeros animales transgnicos
fueron producidos hace ya casi 30 aos mediante la microinyeccin de ADN
viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de ratn (Jaenish y
Mintz, 1974). Los prximos intentos involucraron embriones de ratn
infectados con el retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que
result en la transmisin estable hacia la lnea germinal (Jaenish, 1976). Esto
se logr reemplazando genes que no son esenciales para el virus por genes
heterlogos, aprovechando as la capacidad de los virus de infectar un amplio
espectro de clulas y con una gran eficiencia. Una de las grandes desventajas
de este mtodo radica en que la integracin del ADN se produce en diferentes
etapas del embrin en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra en
todas las clulas somticas o en la lnea germinal y por lo tanto no hay
transmisin del transgen a la descendencia. Adems, los animales generados
por este mtodo tienen a menudo ms de un sitio de integracin, lo cual
ocurre cuando ms de una clula del embrin es infectada por el virus
(Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las lneas de ratones
transgnicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes loci conteniendo
el transgen y poder as aislar lneas con un sitio de insercin nico.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN
forneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita
muchos experimentos especialmente con secuencias genmicas humanas que
pueden superar ampliamente este tamao.
-

Vectores Adenovirales

Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtencin de
vectores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar
tumores en animales. Pueden transducir un nmero bastante amplio de tipos
celulares distintos, tanto clulas en divisin como post-mitticas, con una
eficacia muy elevada. El genoma viral se mantiene epismico, lo que permite
una expresin gentica transitoria.
Originalmente la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb.
Recientemente se ha conseguido eliminar casi todo el genoma viral,
manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las secuencias terminales,
rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha
denominado vectores sin tripas (gutless).
La eliminacin de material genmico viral adems de aumentar la capacidad
del vector de incorporar ADN, disminuye el riesgo de induccin de respuesta
inmune. La mayora de la poblacin ha sido infectada en algn momento por
adenovirus y presenta una respuesta inmune inicial.
Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta reproductividad con
ttulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten ser
concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml.
Su falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias
de redireccionalidad. Quimeras que introducen ligandos especficos en
protenas de la cpside y molculas biespecficas que reconocen tanto la
cpside viral como el receptor seleccionado.

20

Vectores de virus adenoasociados

Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patolgicos. Son
pequeos virus sin envuelta con un genoma de ADN monocatenario, capaces
de infectar un gran nmero de clulas de origen diverso, tanto en divisin
como en su estado quiescente.
Pueden integrarse en la clula hospedadora en un lugar especfico del genoma,
eliminando la posibilidad de mutagnesis insercional. Otra ventaja en la
carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Tiene una reducida capacidad de transporte (4,5 kb) y su reproduccin es
tediosa porque necesitan un virus de apoyo (adenovirus o herpesvirus), los
cuales son difciles de eliminar completamente.
Originalmente se descubri que al eliminar parte del genoma viral para
introducir el transgen se perda la capacidad de integracin especfica.
Recientemente se ha descubierto que la protena Rep78, en presencia de los
ITRs, es capaz de potenciar la integracin especfica en el genoma celular y
podra solucionar este problema.
La falta de especificidad celular ha sido solucionada empleando estrategias de
molculas biespecficas.

Fig.12. Vectores virales de transferencia gnica

Vectores virales quimricos
Consiste en la combinacin de varios vectores para compensar las limitaciones
que tienen por separado, y aprovechar las ventajas ms destacables que
poseen de forma individual. Un ejemplo es la quimera adenovirus-retrovirus,
en la que se utilizan dos tipos de vectores adenovirales: uno incorpora la
maquinaria de empaquetamiento retroviral, y el otro introduce el material

21

gentico equivalente a un vector retroviral. Se aprovecha la eficacia de

transduccin de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos
vectores, transformando las clulas diana en productoras de vectores
retrovirales. Los vectores as generados son capaces de infectar clulas vecinas
e integrarse en su genoma.

Transferencia gnica mediada por semen

Consiste en la introduccin de ADN forneo en gametos masculinos antes
del proceso de fertilizacin.
Las clulas espermticas estn consideradas por algunos autores como
clulas inertes dado que no cuentan con la mayora de la maquinaria
molecular y bioqumica que existe en las clulas somticas para permitir la
replicacin de ADN, la transcripcin de los genes y la sntesis de protenas.
Su morfologa es particular, y se caracteriza por un compartimento
extremadamente reducido y un ncleo que contiene en ADN compactado a
modo de cromatina condensada, conectados a un largo flagelo. Estas
observaciones de la morfologa llevan a la conclusin de que las clulas
espermticas tienen como nica misin actuar de vectores de su propio
genoma durante la fertilizacin. La primera evidencia de que las clulas
espermticas de mamfero podan incorporar ADN forneo cuando eran
incubadas en solucin con estas macromolculas
fue descrita por
Brackett et al. en 1971.
En 1989 Lavitrano y col. describieron la produccin de ratones
transgnicos mediante inseminacin artificial, utilizando semen que haba
sido incubado con ADN exgeno. Las clulas espermticas haban
incorporado ADN plasmdico. La generacin F1 contena el ADN exgeno.
La transferencia gnica mediada por semen en vertebrados se ha
desarrollado y sufrido muchos cambios en los ltimos aos. La incubacin
de las clulas espermticas con ADN forneo seguida de fertilizacin in
vitro o in vivo ha generado conejos, cerdos, ratones, ovejas, vacas, peces,
pollos transgnicos. La definicin y el establecimiento de los protocolos
segn la especie a transformar es y ser un tema valioso en biotecnologa.
Una ventaja de la transferencia gnica mediada con semen frente a la
microinyeccin, es que la segunda requiere manipulacin individual de los
embriones, mientras que con la segunda se pueden transformar
genticamente un alto nmero de embriones en un solo paso. Esto es
particularmente interesante cuando se quieren obtener especies acuticas
transgnicas.
Existen investigaciones que sugieren que el control y captacin del ADN
exgeno por parte de las clulas espermticas de mamferos est altamente
regulada y es muy especfica. De hecho, el fluido seminal antagoniza
fuertemente la unin de ADN forneo y bajo condiciones normales es una
fuerte proteccin de las clulas espermticas contra el ADN forneo.

22

En el caso de animales domsticos, incluyendo vacuno y cerdos, al llevar a

cabo inseminacin artificial a menudo se incorpora ADN forneo mediante
transferencia gnica mediada por semen. El semen recin recolectado de
los animales donadores se lava repetidas veces para eliminar el plasma
seminal
mediante centrifugaciones secunciales.
La suspensin de
clulas espermticas es incubada con ADN plasmdico forneo diluido en
un medio apropiado.
La incorporacin de ADN en clulas espermticas mediada por complejos
ADN-lisosomas ha demostrado afectar la motilidad de los espermatozoides,
y a medida que aumenta la concentracin de ADN disminuye el grado de
fertilizacin in vitro.
Tcnicas alternativas se han desarrollado para una mejor incorporacin del
ADN forneo. Para aumentar la incorporacin de ADN por las clulas
espermticas, detergentes no polares, como tritn y tween, que
desestabilizan la membrana espermtica podran ser usados. Se han
obtenido
resultados
similares
mediante
el
congelamiento
y
descongelamiento.
Existe un mtodo llamado Integracin mediada por restriccin enzimtica
(REMI). Esta tcnica emplea un ADN lineal derivado de un plsmido por el
corte con una enzima de restriccin que origina un extremo cohesivo en
uno de los extremos. El ADN forneo es introducido, junto con la enzima
de restriccin en las clulas espermticas por lipofeccin o electroporacin.
El enzima de restriccin corta el ADN viral en los sitios que permiten la
integracin del ADN forneo mediante el emparejamiento de los extremos
cohesivos.
Otro mtodo alternativo es la inyeccin directa del esperma tratado e
incubado con el ADN forneo en el citoplasma del oocito, mtodo conocido
como Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (ICSI). La ICSI
fue exitosamente utilizada en ratones para transferir largos fragmentos de
ADN.
Para algunas especies se ha descrito el mtodo de la incorporacin de ADN
por electroporacin al esperma incubado en una solucin isosmtica que
contiene el ADN forneo. Es el caso de las clulas espermticas de los
peces, con las que se han realizado con xito el desarrollo de estas
tcnicas.
Una ltima estrategia es la incubacin de las clulas espermticas con el
ADN forneo y anticuerpos monoclonales (mAb C). El anticuerpo es una
protena bsica que se une al ADN por interacciones inicas, permitiendo
al ADN forneo a unirse especficamente al esperma. Esta protena
interacciona con un antgeno de membrana de la clula espermtica de
todas las especies con las que se ha experimentado, incluyendo el ratn, el
cerdo, el pollo, la oveja y el humano.
Segn Lavitrano et al. (2003), SMGT es altamente eficiente y relativamente
barato, y puede ser usado en especies resistentes a la microinyeccin.

23

El uso de espermatozoides como vehculos no invasivos para transferir

ADN forneo a oocitos durante fertilizacin in vitro ha proporcionado una
nueva alternativa para la generacin de animales transgnicos.

Transplante de ncleos y clones

10.1. Clonacin
Las tcnicas para llevar a cabo clonacin celular artificial requieren un
proceso de elaboracin o de manipulacin que permite obtener copias
idnticas o casi idnticas de las clulas madre o progenitoras utilizadas. Si el
producto o embrin se transfiere a un tero, se produce la implantacin en el
endometrio y se desarrolla un nuevo ser (clonacin reproductiva). Pero si se
transfiere a un medio de cultivo, el embrin dar origen a clulas madre
embrionarias con la potencialidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de
clula adulta (clonacin teraputica).
10.2. Mtodos de clonacin
1. Particin. En esta tcnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de
preimplantacin. A partir del embrin seleccionado, se toman mitades o
secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelcidas
naturales o artificiales.
A continuacin, se efecta la implantacin del producto en el endometrio. El
nmero mximo de clulas del embrin, no puede ser superior a 8, porque a
partir de este momento, se inicia la expresin del genoma embrionario. Los
individuos obtenidos son prcticamente idnticos entre s, aunque diferentes a
los progenitores, por lo cual se considera que son el equivalente de los gemelos
monocigticos. Esta tcnica, empleada por Wilmut en 1999, se ha seguido
ampliamente para la clonacin de animales de granja. Como ejemplos de esta
tcnica estn las ovejas Megan y Morag, del Roslin Institute obtenidas en el
2000.
2. Clonacin por transferencia nuclear de clulas somticas (SCNT:
Somatic Cell Nuclear Transfer). Esta tcnica se basa en la habilidad de
inyectar o fusionar vulos carentes de ncleos con ncleos diploides derivados
de clulas somticas en cultivo. Estas clulas pueden ser transfectadas de
manera estable y proporcionar cientos de animales idnticos en una
generacin.
La transferencia nuclear se describi por primera vez en 1952 en anfibios y
consisti en extraer el material gentico de un ovocito para posteriormente
introducirle el material gentico de una clula del animal a clonar. Los
trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que los ncleos de
clulas al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo
embrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a
partir de estas clulas.
En la dcada de los ochenta se realizaron exitosamente transferencias
nucleares en la mayora de los mamferos como conejos (Stice y Robl, 1988),
cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas
(Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por

24

medio de la disociacin de blastmeros embrionarios (clulas embrionarias no

diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear.
Sin embargo, los intentos por realizar transferencia nuclear con clulas ms
diferenciadas fueron infructuosos, lo que llev a pensar que el ADN de clulas
diferenciadas no poda reprogramarse, surgiendo entonces el dogma de que el
proceso de diferenciacin celular era irreversible. Este dogma se derrumb el
27 de febrero de 1997, fecha en que Ian Wilmut y sus colegas del Instituto
Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en la revista Nature cmo haban
creado a la oveja Dolly .

Fig.13. Dolly: El primer mamfero clonado por transferencia nuclear desde una
clula diferenciada.
Dolly fue el resultado de la fusin de un ncleo procedente de una clula
mamaria extrada de una oveja adulta con un vulo al que previamente se le
haba extrado el material gentico (proceso conocido como enucleacin). El
equipo escocs demostraba as que las clulas adultas y especializadas podan
ser reprogramadas.
La etapa clave de este proceso fue la coordinacin del ciclo celular de la clula
receptora y el de la clula donante de ncleos que se logr mediante la
deprivacin de suero de estas ltimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col.,
1997). La deprivacin de suero, previo a la transferencia nuclear, induce a las
clulas a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto celular
o quiescencia (G0/G1 en el ciclo celular), el cual potenciara el desarrollo
embrionario, permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el ncleo
donante (Campbell y col., 1996).
Los requisitos mnimos para la SCNT incluyen el uso de dos tipos de clulas:
somticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los ncleos de
clulas somticas de individuos postnatales se transfieren dentro de oocitos o
de cigotos enucleados. Esta tcnica tiene la ventaja que permite conservar el
genoma durante la diferenciacin celular y la capacidad del citoplasma celular

25

para reprogramar la actividad gnica y aumentar la redireccionalidad de la

diferenciacin celular. Sin la aplicacin de estos dos principios, la clonacin
no es posible (Gurdon JB, 2003).
Para clonar a un ser vivo mediante SCNT, se extrae el material gentico de
ambos tipos de clulas y, a continuacin, se inyecta el ncleo de la clula
somtica que se desea clonar (donante), dentro del oocito previamente
enucleado (receptor). El transplante de ncleos somticos dentro de oocitos
enucleados tiene como fin reproducir los procesos bioqumicos y fisiolgicos
que, de manera natural, se desencadenan durante la fertilizacin.
Vale entonces, en este orden de ideas, establecer una comparacin entre la
fertilizacin y la clonacin.
Durante la fertilizacin, el primer evento que ocurre es la sincronizacin de los
proncleos masculino y femenino. Cuando el espermatozoide atraviesa la
membrana plasmtica del oocito, su ncleo se encuentra en la etapa G0 del
ciclo celular, mientras que el ncleo del oocito est detenido en la metafase de
la segunda meiosis. Los oocitos recientemente ovulados presentan una elevada
concentracin de Factor Promotor de la Maduracin (siglas en ingls MPF),
una proteinquinasa que induce la ruptura de la membrana nuclear y la
condensacin de los cromosomas, motivo por el cual pueden hacer su ingreso
al ncleo ciertos factores citoplasmticos que son necesarios para la
replicacin del ADN (Wilmut I. 2003). Los dos proncleos se llevan entonces a
la etapa S del ciclo, caracterizada por una sntesis activa de ADN. La
reanudacin de la segunda meiosis ocurre como consecuencia del aumento
cclico de [Ca2+] intracelular, que provoca a su vez la inhibicin de las dos
subunidades constitutivas del MPF -ciclina B y cdc1- con el descenso
consecuente en la actividad del MPF (Wakayama T , 1998, Vallejo J, 2003).
Cuando, en la clonacin, se introduce el ncleo de la clula somtica donante
en la clula receptora u oocito, se efecta un proceso similar de sincronizacin
o reprogramacin del ciclo celular, con la finalidad de que ocurra un
acoplamiento fisiolgico entre el ncleo y el citoplasma. La reprogramacin del
ciclo celular, o lo que es lo mismo, la reprogramacin nuclear, son trminos
que describen los cambios en la actividad gnica inducida experimentalmente
por el transplante de un ncleo dentro de un medio citoplasmtico diferente.
La reprogramacin es un requisito indispensable para el xito del
procedimiento, pues permite que la expresin gnica de la clula somtica sea
la apropiada para un desarrollo embrionario normal (Campbell KHS 1996,
Hwang WS, 2004). Esta reprogramacin se efecta en el tiempo transcurrido
entre la fusin ncleo-citoplasma y la activacin del producto resultante
(Hwang WS, 2004).
Si se transplantan ncleos de clulas somticas, parcial o totalmente
diferenciadas, dentro de oocitos enucleados de anfibios o de mamferos en
metafase de la segunda meiosis, se podrn obtener blastocistos, a partir de los
cuales se formar un amplio rango de tejidos y de tipos celulares (Gurdon JB,
2002).
El proceso de sincronizacin o reprogramacin se efecta mediante el estmulo
de la entrada de Ca2+al oocito, ya sea con un impulso elctrico suave o con la
utilizacin de ionomicina (Campbell KHS, 1996., Gurdon JB, 2002) o
puromicina (Hwang WS, 2004).

26

El ncleo de la clula somtica donante no debe haber iniciado o completado

la replicacin del ADN, para que el cigoto pueda tener una ploida o
complemento cromosmico normal. Si se activa el oocito, y se le permite entrar
a su primer ciclo celular, la actividad del MPF caer y no ocurrir la ruptura
de la membrana nuclear despus de la transferencia del ncleo de la clula
donante. As las cosas, el ncleo determina si habr o no replicacin del ADN,
de modo que pueda esperarse una ploida normal -necesaria para un normal
desarrollo- en todos los estados del ciclo celular de la clula donante (Wilmut
I. 2003). Se considera entonces que el oocito es un receptor universal, pues no
slo provee un medio apropiado para el ncleo de la clula donante en
cualquier estado del ciclo sino que, independientemente de ste, tiene la
capacidad para actuar sobre la estructura y la funcin de la cromatina del
ncleo somtico, de modo que lo lleva de nuevo a un estado de
totipotencialidad (Wilmut I. 2003, Betts DH, 2001).
Al aplicar la tcnica de la transferencia nuclear, no slo se debe procurar
mantener una ploida normal en el producto formado, sino tambin evitar la
destruccin de la cromatina. Por este motivo se han hecho investigaciones
sobre la evaluacin de la tcnica, cuando se utilizan clulas donantes en
diversas etapas del ciclo celular (G1, S, G2, M), y como clulas receptoras,
oocitos en metafase de la segunda meiosis. (Campbell KHS. 1996, Wakayama
T, 1999, . Kasinathan P, 2001). Como clulas somticas donantes, al principio
se utilizaron las clulas quiescentes en fase G0, que haban abandonado el
ciclo celular en fase G1 y, que, por tanto, tenan un complemento cromosmico
diploide. Como ejemplo de clulas en fase G0 se encuentran clulas del
cmulus, clulas de Sertoli y neuronas, aunque tambin se pueden obtener
artificialmente en un medio de cultivo, mediante la deprivacin de factores de
crecimiento (Khholzer B,2000). Aunque estas clulas son menos activas en la
transcripcin y, adems contienen poblaciones distintas de ARN mensajero
(ARNm) que las que se hallan en fase G1, se prefirieron, pues sus mismas
caractersticas, de alguna manera facilitan la accin de los factores
citoplasmticos del oocito necesarios para modificar la expresin gnica del
embrin, y, por tanto, la reprogramacin nuclear (Wilmut I. 2003, Campbell
KHS 1996). Tambin se han utilizado clulas somticas donantes en fases G1
(Kasinathan 2001, Piotrowska, 2000), G2 (Ono Y, 2001)Lai y M (L, Machty Z,
2001).

27

Se ha obtenido una notable eficiencia en el desarrollo de los embriones as

clonados hasta el estado de blastocisto, cuando el ncleo inyectado se
encuentra en fase M (Wakayama T 1998, Li X, Li Z, 2003). En cualquier caso,
una clonacin exitosa requiere reprogramar el ncleo de la clula somtica
donante, debido a que la cromatina ha sufrido previamente transformaciones
epigenticas incompatibles con el desarrollo embrionario, que incluyen la
desacetilacin de las histonas y la metilacin del ADN.
En el 2004 Hwang obtuvo clulas madre embrionarias a partir de blastocistos
humanos. El xito de su procedimiento radic en que el tiempo destinado a la
reprogramacin celular fue de unas pocas horas, en contraste con la
metodologa utilizada en experimentos con otras especies de mamferos
(Khholzer B 2001). Sin embargo, no siempre la reprogramacin nuclear
ocurre de modo satisfactorio.
As hay informes de hallazgos de embriones clonados a partir de clulas
somticas donantes, que fracasan en la reactivacin de genes claves para el
desarrollo embrionario normal (Bortvin A 2003 ). En estos embriones se
pueden expresar precozmente genes especficos de las clulas donantes (Gao S
2003) , y, adicionalmente, presentar patrones aberrantes de metilacin del

28

ADN en el trofoectodermo (Rhind S 2003, Dean W 2001) , as como

mosaicismo (Rhind S 2003).
Por otra parte, las clulas somticas, a lo largo de las sucesivas divisiones
mitticas sufridas in vivo, han perdido parte de los extremos de los
cromosomas, denominados telmeros. Los telmeros son repeticiones cortas
en conjunto (tndem) de ADN, que se replican mediante la accin de la enzima
telomerasa. Se ha encontrado que variables como la longitud de los telmeros
y la actividad de la telomerasa estn significativamente disminuidas en las
clulas somticas donantes, cuando se comparan con las clulas madre
embrionarias como fuente donante de ncleos. Debido a que los telmeros
desempean un papel estabilizador del ADN, su acortamiento progresivo
puede incidir, tanto en los procesos de envejecimiento celular, como en la
aparicin de anormalidades cromosmicas, espermatognesis defectuosa,
apoptosis aumentada y proliferacin celular disminuida en mdula sea, bazo
y testculo, en animales clonados a partir de clulas somticas donantes(Betts
DH , 2001).
Es claro entonces que el estado de diferenciacin de la clula donante afecta
directamente la eficiencia de la clonacin, y en tal sentido se considera que las
clulas madre embrionarias ofrecen ventajas cualitativas sobre las clulas
somticas como posibles donantes en la tcnica de transferencia nuclear.
A pesar de los xitos sucesivos obtenidos en la clonacin de clulas adultas, la
SCNT dista mucho an de ser considerada una tcnica eficaz. En primer
lugar, muchos embriones clonados mueren inmediatamente despus de la
implantacin, o bien, a lo largo del desarrollo prenatal. Tambin se ha
observado, que si bien algunos individuos sobreviven hasta el trmino de la
gestacin, mueren prontamente debido a un amplio rango de diversas
entidades. Si logran sobrevivir, presentan una talla corporal y un tamao de la
placenta mayores que lo normal, obesidad, as como defectos en riones,
corazn, hgado, pulmones y cerebro.
Hasta hace poco tiempo se desconoca cul era la razn biolgica y cules los
problemas tcnicos causantes de tales fracasos. En el caso de primates no
humanos, como los monos Rhesus macacus, los intentos de clonacin han
fallado, debido a que, durante la enucleacin de los oocitos no fertilizados previa a la transferencia nuclear- se removan ciertas protenas necesarias
para la organizacin normal del huso mittico, como las protenas motoras de
los microtbulos y del centrosoma.
La dificultad fue en apariencia resuelta por Hwang y su equipo de
colaboradores32, quienes recientemente obtuvieron blastocistos humanos.
Ellos extrajeron el complejo ADN-huso mittico inmediatamente despus de la
aparicin del primer cuerpo polar, a travs de un orificio en la zona pelcida,
en lugar de aspirarlo con una pipeta de vidrio, tal como es descrito por otros
autores.
En especies de mamferos como perros, conejos, cerdos, caballos, gatos y seres
humanos, el xito de la clonacin ha sido altamente dependiente de la
disponibilidad de tecnologas especie-especficas, que incluyen el cultivo, la
activacin, la micromanipulacin y la transferencia de huevos y embriones a
receptores. Es as como en la aplicacin de la SCNT en cerdos, si se efectan

29

simultneamente los procesos de fusin ncleo-citoplasma y activacin del

producto, se obtienen resultados satisfactorios.
En contraste, cuando se utiliza el mismo proceso en bovinos y en seres
humanos, los porcentajes de fusin y de clivaje o segmentacin son muy bajos
y no se forman blastocistos. Por tanto en estas especies, parece ser necesario
un mayor tiempo de reprogramacin entre fusin y activacin con el fin de
obtener un nmero significativo de blastocistos. Por otro lado, el tipo de
sustrato energtico aadido al medio de cultivo (fructosa en lugar de glucosa)
tambin parece ser un factor determinante para la formacin de blastocistos
en bovinos y en seres humanos.
3. Paraclonacin. Consiste en inyectar ncleos de clulas madre
embrionarias en cultivo, dentro de oocitos enucleados y, a veces, de cigotos
nucleados. Los blastmeros se obtienen a partir de varias fuentes como la
masa celular interna o el trofoectodermo de embriones preimplantados y sus
ncleos son transferidos dentro de oocitos enucleados6. Los individuos
obtenidos son casi idnticos entre s, aunque diferentes a los padres del
embrin que aport el ncleo transferido. Se ha demostrado que la
supervivencia de los clones formados a partir de clulas madre embrionarias
en el instante del nacimiento o hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces mayor
que en los derivados de clulas somticas.
Por otra parte, los clones derivados de clulas madre embrionarias tienen
mejores posibilidades de reactivar completamente genes claves para el
desarrollo embrionario -tales como oct4 y 10oct4- y as constituir una
poblacin de clulas verdaderamente totipotenciales. Sin embargo, las clulas
madre embrionarias, aunque requieren un menor grado de reprogramacin
que las clulas somticas, presentan una elevada inestabilidad epigentica en
cultivos in vitro. La inestabilidad se refleja en una expresin aberrante de la
huella gentica, de modo que, cuando estas clulas se utilizan como donantes
para la clonacin reproductiva, el fenotipo fetal y placentario de los clones,
exhibe graves patrones de anormalidad. Sin embargo, cuando se emplean
como fuente de ncleos para la clonacin teraputica, en apariencia no ocurre
este error, pues, durante la reprogramacin, se seleccionan tan slo las
clulas competentes.
10.3. Clonacin de la oveja Dolly
Se aislaron las clulas de la glndula mamaria de una oveja adulta. Se
aislaron los ovocitos de otra oveja adulta, y se eliminaron los ncleos
haploides por micromanipulacin. Se fusionaron las clulas de ambas ovejas
por electroporacin y se mantuvieron en cultivo 6 das antes de su
implantacin en el tero. Tras 150 das de gestacin naci Dolly.

30

Fig.14. Esquema representativo de las etapas que llevaron a la creacin de la

oveja Dolly mediante la tcnica de transferencia de nuclear una clula
somtica diferenciada.
La tasa de xito es de 1 de 227
10.4. Transferencia nuclear de clulas transfectadas diploides fetales
En primer lugar se aslan clulas diploides fetales y se realiza una transfeccin
estable con un vector que contenga el gen de inters y un promotor que dirija
su expresin. El promotor puede dirigir la expresin dentro de algn tejido
especfico de inters, o para determinada etapa del desarrollo del animal. Por
otro lado se aslan ovocitos y se les elimina el ncleo haploide. A continuacin
se fusionan las membranas, y la clula resultante se implanta en un tero
para su desarrollo. Transcurrido el tiempo de gestacin el resultado es un
animal clnico transgnico.

31

Fig.15. Fusin celular inducida por un pulso de electricidad

10.5. Transferencia nuclear Honolulu
La tcnica de transferencia nuclear Honolulu utiliza la microinyeccin para
generar clulas diploides. La activacin in vitro del ovocito tiene lugar
mediante su incubacin en un medio sin calcio que contiene estroncio y
citocalasina B para prevenir la formacin del cuerpo polar.
La tasa de xito es 3 de 100.

32

Fig.16. Transferencia nuclear Honolulu

10.6. Aplicaciones de la clonacin mediante la tcnica de transferencia

nuclear
El estado del arte en la clonacin ha permitido su empleo en dos direcciones
claramente definidas: La clonacin con fines reproductivos y la clonacin con
fines teraputicos. La primera apunta a duplicar seres vivos completos,
mientras que la segunda promete convertirse en una alternativa para prevenir
y tratar ciertas enfermedades, as como para el reemplazo de tejidos y rganos
lesionados.

33

A las clulas somticas donantes se las manipula para inducirlas a un proceso

de diferenciacin en tipos celulares determinados, que posteriormente se
utilizarn en el tratamiento de ciertas enfermedades incurables. La ventaja de
esta tcnica radica en que las clulas madre embrionarias, una vez
transplantadas, no provocan rechazo inmunolgico, pues se comportan como
injertos autlogos, gracias a que son genticamente idnticas a las clulas del
receptor o del paciente.
El problema de los transplantes heterlogos, es el largo tiempo que toma el
enfermo en aceptarlos, a pesar de que los rganos utilizados comparten su
misma informacin gentica, pues casi siempre provienen de miembros de la
misma familia. Por otra parte, cuando se produce rechazo al tejido
transplantado, la salud del individuo queda seriamente comprometida y hay la
eventualidad que se debe pensar en un nuevo transplante.
Algunos hallazgos recientes han revolucionado la biologa de las clulas madre
y han demostrado su potencial clnico para tratar diversas enfermedades,
como trastornos neurodegenerativos, desrdenes sanguneos y diabetes.
Adems, una estrategia vlida para el manejo de desrdenes de origen
gentico conocido, como la anemia falciforme y la -talasemia, consiste en
utilizar la tcnica de transferencia nuclear, combinada con terapia gnica y
celular.
Los defensores de la clonacin teraputica de clulas humanas aducen que
permite disponer de tejidos y de rganos viables, a partir de una fuente de
ADN, sin que sea necesario traer un nuevo ser al mundo con el nico fin de
obtener un tejido. Con la finalidad de asegurar la normalidad del clon y, por
tanto de las clulas madre embrionarias, se propone una "prueba o test de
seguridad" que seleccione y discrimine los embriones a los que se les permitir
progresar en su desarrollo. En teora, este filtro se podra efectuar mediante la
evaluacin de los errores en la expresin y en la huella gentica de los
blastmeros en estado de preimplantacin, pero no tiene en cuenta que se
desconocen los efectos epigenticos adversos que desencadenara tal
manipulacin.
A partir de ciertos rganos o tejidos de individuos postnatales, se pueden
aislar clulas que pueden persistir en forma indiferenciada. Estas clulas
podran ser transformadas en clulas madre pluripotenciales y cultivadas
separadamente, de acuerdo a la necesidad del paciente.
As, dentro de tejidos clsicamente considerados con un potencial regenerativo
nulo, como el nervioso y el muscular, se han identificado grupos de clulas
madre, capaces de proliferar y de madurar hacia diferentes tipos celulares,
tanto in vivo como in vitro. De la misma manera, en la zona subventricular del
cerebro adulto, se han hallado clulas madre que eventualmente se podran
utilizar en terapias de reemplazo neuronal. Por otro lado, se observa una
buena regeneracin de tejidos como msculo esqueltico lesionado, cuando se
injertan mioblastos cultivados in vitro.
Otra fuente prometedora de clulas pluripotenciales es la sangre del cordn
umbilical. La muestra de sangre se obtiene en el momento del nacimiento, sin
que el neonato ni su madre se vean afectados. La eficiencia del procedimiento
es tal, que, a partir de un volumen de 20 ml de sangre del cordn, se obtienen
hasta 4 millones de clulas madre67, que pueden crioconservarse por largo

35

A las clulas somticas donantes se las manipula para inducirlas a un proceso

de diferenciacin en tipos celulares determinados, que posteriormente se
utilizarn en el tratamiento de ciertas enfermedades incurables. La ventaja de
esta tcnica radica en que las clulas madre embrionarias, una vez
transplantadas, no provocan rechazo inmunolgico, pues se comportan como
injertos autlogos, gracias a que son genticamente idnticas a las clulas del
receptor o del paciente.
El problema de los transplantes heterlogos, es el largo tiempo que toma el
enfermo en aceptarlos, a pesar de que los rganos utilizados comparten su
misma informacin gentica, pues casi siempre provienen de miembros de la
misma familia. Por otra parte, cuando se produce rechazo al tejido
transplantado, la salud del individuo queda seriamente comprometida y hay la
eventualidad que se debe pensar en un nuevo transplante.
Algunos hallazgos recientes han revolucionado la biologa de las clulas madre
y han demostrado su potencial clnico para tratar diversas enfermedades,
como trastornos neurodegenerativos, desrdenes sanguneos y diabetes.
Adems, una estrategia vlida para el manejo de desrdenes de origen
gentico conocido, como la anemia falciforme y la -talasemia, consiste en
utilizar la tcnica de transferencia nuclear, combinada con terapia gnica y
celular.
Los defensores de la clonacin teraputica de clulas humanas aducen que
permite disponer de tejidos y de rganos viables, a partir de una fuente de
ADN, sin que sea necesario traer un nuevo ser al mundo con el nico fin de
obtener un tejido. Con la finalidad de asegurar la normalidad del clon y, por
tanto de las clulas madre embrionarias, se propone una "prueba o test de
seguridad" que seleccione y discrimine los embriones a los que se les permitir
progresar en su desarrollo. En teora, este filtro se podra efectuar mediante la
evaluacin de los errores en la expresin y en la huella gentica de los
blastmeros en estado de preimplantacin, pero no tiene en cuenta que se
desconocen los efectos epigenticos adversos que desencadenara tal
manipulacin.
A partir de ciertos rganos o tejidos de individuos postnatales, se pueden
aislar clulas que pueden persistir en forma indiferenciada. Estas clulas
podran ser transformadas en clulas madre pluripotenciales y cultivadas
separadamente, de acuerdo a la necesidad del paciente.
As, dentro de tejidos clsicamente considerados con un potencial regenerativo
nulo, como el nervioso y el muscular, se han identificado grupos de clulas
madre, capaces de proliferar y de madurar hacia diferentes tipos celulares,
tanto in vivo como in vitro. De la misma manera, en la zona subventricular del
cerebro adulto, se han hallado clulas madre que eventualmente se podran
utilizar en terapias de reemplazo neuronal. Por otro lado, se observa una
buena regeneracin de tejidos como msculo esqueltico lesionado, cuando se
injertan mioblastos cultivados in vitro.
Otra fuente prometedora de clulas pluripotenciales es la sangre del cordn
umbilical. La muestra de sangre se obtiene en el momento del nacimiento, sin
que el neonato ni su madre se vean afectados. La eficiencia del procedimiento
es tal, que, a partir de un volumen de 20 ml de sangre del cordn, se obtienen
hasta 4 millones de clulas madre67, que pueden crioconservarse por largo

35

tiempo sin deterioro alguno, para ser utilizadas en transplantes y en procesos

de terapia gnica. La sangre del cordn umbilical tambin provee hemates
normales y leucocitos muy tiles en el tratamiento de la anemia falciforme y
en la restauracin del sistema inmunitario de los nios nacidos con
inmunodeficiencia grave.
Si las clulas madre que provienen de determinados rganos de individuos
adultos, se cultivan en condiciones apropiadas, son susceptibles de sufrir
transdiferenciacin. En 1999, un grupo de cientficos italianos y canadienses
demostraron la presencia, en personas adultas, de clulas madre nerviosas
capaces de diferenciarse en clulas hematopoyticas. Segn sus hallazgos, la
diferenciacin de las clulas madre estara condicionada por las seales que
reciben del entorno donde se sitan. Igualmente se ha determinado que
clulas madre nerviosas de ratones se pueden diferenciar hacia clulas
hemticas, como tambin las clulas hemticas en clulas musculares
esquelticas, o bien, en clulas de microglia o de astroglia. Estos hechos
sugirieron la posibilidad que clulas madre de la mdula sea fueran
transplantadas con el fin de tratar enfermedades como distrofia muscular, mal
de Parkinson, infarto de miocardio o falla heptica. Sin embargo no es claro si
la aparente plasticidad de las clulas madre adultas examinadas se debe a las
condiciones particulares en las que se cultivaron, a posible contaminacino a
fusin celular. Adems de esta incgnita que retrasa su empleo como
donantes en la clonacin, se ha observado que las clulas madre adultas
presentan otra serie de desventajas con respecto de las clulas madre
embrionarias. Tales desventajas incluyen no slo dificultades en su
aislamiento y cultivo, sino tambin una alta probabilidad de sufrir
mutagnesis insercional y cncer, como resultado de la introduccin de
transgenes retrovirales, necesarios para su manipulacin gentica. En
contraste, las clulas madre embrionarias se obtienen fcilmente a partir del
embrin seleccionado, proliferan de modo indefinido en cultivo, y sus defectos
genticos se pueden reparar mediante procesos de recombinacin homloga.
Recientemente se obtuvieron clulas madre adultas derivadas de tejido
mesenquimatoso de mdula sea en ratas, ratones, otros animales y seres
humanos, que sufrieron una rediferenciacin exitosa hacia clulas de las tres
capas germinativas (ecto, meso y endodermo), cuando se transfirieron sus
ncleos dentro de blastocistos.
Hay otras fuentes que ofrecen disponibilidad de clulas madre
pluripotenciales, que se pueden diferenciar y cultivar separadamente: Son los
embriones desechados durante el procedimiento de fertilizacin in vitro (IVF).
Clonacin reproductiva. Inicialmente, el proceso es igual al que se efecta
durante la clonacin teraputica. La diferencia aparece con posterioridad a la
fusin del ncleo de la clula donante con el oocito enucleado, pues el cigoto
se debe implantar en un tero, donde se desarrollar hasta formar un
individuo rplica del donante.

36

Fig.17. El esquema representa la tcnica de transferencia nuclear con fines

reproductivos
Se toma el ncleo de alguna clula del cuerpo del animal que se quiere clonar
(animal A). Ese ncleo tiene toda la informacin gentica que determina las
caractersticas de ese individuo. Este ncleo se introduce en un vulo de otro
individuo al que previamente se le quit el ncleo (animal B). De esta forma,
se obtiene una clula que se asemeja a un cigoto. Este cigoto realiza in vitro
las primeras divisiones mitticas hasta convertirse en embrin de unas pocas
clulas y entonces es implantado en el tero de una madre adoptiva (animal
C). A partir de ese cigoto se desarrolla un individuo exactamente igual a aquel
individuo que don su material gentico. En total son necesarios 3 animales:
el que se quiere clonar que aporta el ncleo, una hembra que aporta vulos y
otra adoptiva que llevar a cabo la preez.
Existe otra tcnica de clonacin, denominada clonacin por fusin nuclear
que es similar a la anterior pero en lugar de tomar el ncleo de la clula, se
fusiona una clula completa del animal que se quiere clonar (animal A) con un
vulo de otro animal (B) al que se le ha extrado el ncleo. Esa fusin genera
un vulo con toda la carga cromosmica completa, es decir, un cigoto, el cual
se desarrollar en embrin in vitro y luego ser implantado en una madre
adoptiva (animal C).
Cuando se quieren tener muchos animales transgnicos idnticos que
produzcan la misma protena recombinante de inters, se recurre a la
clonacin reproductiva. Esta tcnica permite obtener individuos genticamente
idnticos al animal deseado.
La clonacin utilizando clulas somticas sin transformar ha demostrado la
utilidad en generar clones de animales individuales de alto mrito gentico;
esto combinado con la tecnologa de ADN recombinante da lugar a la
generacin de animales clnicos transgnicos de alto mrito gentico, que es
posible mediante la incorporacin de los genes de inters a lneas celulares
mediante transfeccin, las cuales pueden ser utilizadas como donantes de
ncleos en la transferencia nuclear.
A diferencia de la microinyeccin pronuclear, donde slo un 3-5% de los
animales nacidos son transgnicos (cifra que es inferior en animales mayores),

37

la transferencia nuclear asegura que el 100% de los animales nacidos sea

transgnico, eliminndose, por lo tanto, una generacin de animales.
Adems, estos animales presentan un bajo ndice y/o ausencia total de
mosaicismo. Esto permite producir varios animales transgnicos en la primera
generacin, posibilitando hacer pruebas de expresin del transgen en un
grupo de animales mientras el resto se utiliza para propagar la lnea. En forma
adicional es posible seleccionar el sexo del animal sin necesidad de incurrir a
biopsias del embrin, lo que permitira incrementar la masa ganadera por
multiplicacin (clonacin) en forma ms rpida y eficiente. Finalmente, la
posibilidad de recombinacin homloga (gene targeting) en clulas somticas
previo a la transferencia nuclear abre infinitas posibilidades de manipulacin
gentica en animales de granja que haban sido restringidas slo al ratn, a
travs de recombinacin homloga en clulas madre embrionarias. Esto
permitir expandir el horizonte de posibilidades a esta tecnologa,
posibilitando la eliminacin de genes de inters en el animal (gene knock out),
como, por ejemplo, la eliminacin del gen del cerdo responsable del rechazo a
los trasplantes de rganos (Phelps y col., 2003; Ramsoondar y col., 2003) o la
eliminacin del gen de la oveja responsable de la produccin de priones
(Denning y col., 2001), adems de la posibilidad de insertar genes especficos
en regiones definidas del genoma del animal, favoreciendo un sitio permisivo
para asegurar altos niveles de expresin de la protena de inters (McCreath y
col., 2000).

Fig.18. Rutas para la produccin de animales transgnicos

En el campo de la clonacin animal con fines reproductivos existe consenso
sobre las bondades de efectuar el procedimiento en animales de granja, con la

38

finalidad de preservar el genoma de los mejores ejemplares. Es lo que se ha

llamado comnmente clonacin de animales de lite.
Adems de proporcionar una ruta para la generacin de animales
transgnicos, la transferencia nuclear podra utilizarse para la produccin de
cantidades ilimitadas de animales genticamente idnticos con cual la
posibilidad de multiplicar razas de animales seleccionados podra aumentar la
eficiencia de la productividad pecuaria.
Las caractersticas genticas ms valoradas son, entre otras, un crecimiento
rpido, resistencia a enfermedades, una elevada produccin de leche o de lana
de alta calidad.
Una ventaja importante de la clonacin sera la diseminacin ms rpida del
progreso gentico desde rebaos elite hacia los productores. Hasta la fecha
esto se ha venido realizando mediante la inseminacin artificial, la cual
suministra slo la mitad de los genes. Con la clonacin, los productores que
pudieran pagar este servicio recibiran embriones que seran clones de las
vacas ms productivas de los rebaos elite, con lo que incrementaran la
performance de sus rebaos en tan slo una generacin. En este escenario las
empresas venderan embriones clonados de la misma forma en que hoy
comercializan el semen. Estos embriones tendran la ventaja de un transporte
ms fcil de los genotipos entre pases, evitndose los inconvenientes de la
cuarentena. Aunque los rebaos de algunos productores pudieran consistir
slo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clones de diferentes
animales elite incrementara la diversidad gentica en estos predios.
La clonacin reproductiva tambin permite preservar especies exticas o que
se encuentren en peligro de extincin. Aunque la transferencia nuclear se
asocia en la mente de la gente con una prdida de la diversidad gentica, esta
tcnica tambin proporciona nuevas alternativas para la conservacin
gentica. Con una cada vez ms creciente presin comercial, muchas razas
indgenas o criollas adaptadas a las condiciones locales estn siendo
reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivos de
produccin.
Estas razas locales pueden contener importantes genes que confieran
resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climticas
(fro/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extincin.
Los mtodos actuales de conservacin consisten en almacenar semen o
embriones congelados, procesos que son largos y costosos. Como
consecuencia, el futuro de slo unas pocas razas est asegurado. La
tecnologa de clonacin puede proporcionar una forma ms simple y efectiva
de conservar estas razas, por cuanto muestras de sangre, biopsias de piel o
incluso pelo pueden ser utilizadas como fuentes de clulas que podran ser
crecidas brevemente en el laboratorio, mantenidas y congeladas mediante su
almacenamiento en nitrgeno lquido para ser luego utilizadas en
experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplo del potencial de esta
tecnologa lo demuestran los recientes experimentos en diversas especies en
peligro de extincin mediante transferencia nuclear interespecies (Lanza y col.,
2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee y col., 2003).

39

11. Generacin de animales knockout

La posibilidad de recombinacin homloga (gene targeting) en clulas
somticas previo a la transferencia nuclear ha captado la atencin de las
principales compaas biotecnolgicas. La modificacin gentica que conduce
a la prdida de funcin de un gen, o ms comnmente conocida como gene
knock out, ha sido utilizada extensivamente en el ratn para obtener un
mayor entendimiento de la funcin gnica y como modelo para ciertas
enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).
11.1. Generacin de ratones knockouts
Los ratones knockout estn alterados genticamente de tal manera que un gen
concreto (diana) se ha interrumpido (inactivado y se ha convertido en no
funcional. Es una tcnica compleja que utiliza la combinacin de ADN
recombinante, de cultivos celulares y de manipulacin de embriones. La
tcnica de construccin del un ratn knockout fue desarrollada en 1989 por
varios grupos, como el de Mario Cappechi en la Universidad de UTA, el de
Oliver Smithies en la Universidad de Carolina del Norte, y el de Elizabeth
Robertson en la Harvard Medical School.

Al tercer da de post-fertilizacin de las hembras de ratn son obtenidas del

tero las clulas ES, que derivan de la masa celular interna de la blstula en
desarrollo.
Las clulas ES se cultivan en placas que contienen fibroblastos embrionarios
incapaces de dividirse llamados feeder cells.

Fig.19. Superovulacin de una hembra agouti, donadora de clulas ES, y

obtencin de cultivos de clulas ES a partir de los blastocistos aislados del
tero de la hembra.
A continuacin el constructo de ADN, que contiene un marcador (o dos) de
seleccin, es transfectado de manera estable en las clulas ES mediante

40

electroporacin o lipofeccin. En algunas de estas clulas ES el vector de ADN

introducido habr reemplazado al gen normal por un suceso de
recombinacin. Se realiza anlisis de PCR o Southern blots para comprobar
qu sub-lneas contienen el ADN incorporado a su genoma.
La recombinacin homloga en las clulas ES es el proceso de insercin gnica
que requiere de una recombinacin homloga entre secuencias del vector y
secuencias genmicas. La insercin gnica conduce a la interrupcin del gen y
a la incorporacin de la regin codificadora del marcador de seleccin, lo que
permite realizar el seguimiento en las posteriores manipulaciones.

Fig.20. Esquema de recombinacin del vector introducido en las clulas ES

con el genoma, de manera que se introduce la regin codificadora para el
marcador de seleccin escogido en este caso, gen de resistencia a la
neomicina.
Se seleccionan las clulas ES que contienen una copia del gen recombinante y
un alelo normal, y se las hace crecer en cultivo. Estas clulas genticamente
modificadas se inyectan a un embrin de ratn, en el que participarn en la
formacin de los tejidos y rganos adultos. Se transfiere el embrin quimera a
una madre adoptiva para que se complete su desarrollo. Se pueden utilizar
genes del color del pelaje como marcadores para seleccionar posteriormente a
los ratones quimera que tengan clulas germinales provenientes de las clulas
ES genticamente modificadas.
Los ratones heterocigotos pueden cruzarse para obtener ratones homocigotos
para el gen inactivado. Estos ratones homocigotos se denominan knockout ya
que se ha mutado o suprimido la funcionalidad de un gen.

41

Fig.21.Construccin de un ratn Knockout

La eficiencia del mtodo es alta y la insercin en el genoma es dirigida.
La desventaja del mtodo es que la frecuencia de recombinacin es baja, del
orden de 10-5. Los factores que afectan a la recombinacin son:
- El largo de la secuencia del vector
- El grado de homologa entre las secuencias homlogas del vector y las
secuencias blanco
- La ubicacin cromosmica del gen blanco
Es posible aplicar esta tcnica para producir animales con mltiples genes
inactivados implicando a varios genes de una va bioqumica, as como
desarrollar animales que tienen genes inactivados en un determinado tejido, o
que contienen genes discapacitados en lugar de inactivados.
11.2. Condicional knockouts
Esta tcnica permite inactivar un gen slo en tejidos particulares y/o a
tiempos especficos durante su ciclo de vida. Un ejemplo es la mutagnesis
condicional que lograron en el ao 2006 en
Max-Planck-Institute of
Experimental Medicine, Goettingen, Alemania con el ratn NEX-Cre.
Crearon una lnea de ratones que expresaba la recombinasa Cre bajo el
control de las secuencias regulatorias de NEX, gen que codifica para la
protena neuronal bHLH. Para mimetizar la expresin endgena de NEX en el
telencfalo dorsal, la recombinasa Cre fue insertada en el locus de NEX por
recombinacin homloga en clulas ES. El patrn de expresin de Cre fue
analizado despus de que las lneas se cruzaran con lneas de ratones que
tenan insertado el gen marcador lac-Z. Se visualiz una expresin prominente
en el hipocampo y en el neocortex a partir de los 11,5 das.

42

Fig.21. Seccin frontal cerebral de un ratn doble transgnico NEX-Cre*LacZmarcador a la edad de 55 das. La tincin de lac-Z corresponde exactamente a
la expresin conocida de los dominios del gen NEX, como el hipocampo y el
neocortex.
11.3. Aplicaciones de las tcnicas knockout
Actualmente existe una gran carencia de rganos para trasplantes humanos
que no es cubierta por las donaciones. El trasplante de rganos de animales
hacia humanos (xenotrasplantes) podra ser la solucin. Sin embargo, existen
muchas barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal
barrera consiste en el fenmeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia
de anticuerpos naturales contra eptopes del disacrido galactosa 1-3
galactosa presente en las superficies celulares de mamferos, pero que estaran
ausentes en las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col.,
1985). Este es uno de los principales usos donde la tecnologa de
recombinacin homloga acoplada con transferencia nuclear est siendo
explotada. La reciente generacin de cerdos transgnicos en los que se elimin
el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitira la produccin de animales que
carecen del eptope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara
demostracin del poder de esta tecnologa (Phelps y col., 2003).
Otra de las aplicaciones de esta tecnologa est en la creacin de animales
resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones
han tenido un enorme impacto econmico en algunos pases de Europa y la
utilizacin de productos animales para su uso en humanos es una
preocupacin constante.
Este es el caso de la encefalopata espongiforme bovina (EEB) o ms
comnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sera la causa
de una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos
denominada vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones
(Prusiner y col., 1993) y ms recientemente en ovejas (Denning y col., 2001),
demuestran que es factible eliminar el gen para los priones (PrP) mediante
recombinacin homloga y que los animales producidos son resistentes al
Scrapie. Dado que las ovejas y vacas estn siendo utilizadas para producir
protenas humanas de uso farmacolgico y que estos animales poseen genes

43

funcionales PrP, sera apropiado producir poblaciones de animales resistentes

a estos priones.
La tecnologa de recombinacin homloga ha sido ampliamente utilizada en el
ratn para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo,
debido a las diferencias fisiolgicas sera ms apropiado disponer de modelos
animales que se asemejen ms al humano. Este es el caso del modelo para
fibrosis qustica creado en el ratn, donde se elimin el gen Cftr (Cystic
fibrosis transmembrane responder). Este modelo no present las
caractersticas tpicas de la enfermedad en humanos debido a las diferencias
en la fisiologa del pulmn del ratn (Davidson y col., 1995). La eliminacin del
gen Cftr en la oveja se esperara produjera un modelo animal para fibrosis
qustica ms exacto debido a las similitudes de la fisiologa pulmonar entre
ovejas y humanos.
Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de produccin
tales como el crecimiento y la eficiencia de alimentacin son uno de los
principales objetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la
miostatina se elimin mediante recombinacin homloga desarrollaron mayor
musculatura esqueltica que los controles no modificados (McPherron y col.,
1997). Adems, el fenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas,
por ejemplo Belgian Blue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones
naturales) del gen de la miostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la
eliminacin de este gen en bovinos, ovejas y cerdos podra producir animales
con mayor masa muscular, lo cual sera de enorme importancia econmica.
Tal es as que actualmente existe una empresa biotecnolgica en USA (http://
www.prolinia.com) cuyo objetivo es proporcionar la clonacin a los
mejoradores de razas registradas, para luego mediante ingeniera gentica
proveer a estas razas elite de caractersticas deseables como la mutacin para
el gen de la miostatina.
Otra caracterstica productiva que se podra mejorar a travs de esta
tecnologa es la leche. La leche aporta cerca del 30% de las protenas
consumidas en los pases desarrollados. Por esta razn, la lactancia ha sido
objeto de diversos estudios en el campo de gentica, fisiologa y nutricin. La
recombinacin homloga podra ser utilizada para reemplazar genes de las
protenas de la leche de los animales de granja con la respectiva contraparte
de los genes humanos para utilizarlos como fuentes de protenas. Por ejemplo,
la seroalbmina humana es utilizada ampliamente para el tratamiento de
quemaduras y como reemplazo de fluidos corporales en ciruga. La escala de
requerimiento de esta protena (~ 600 toneladas al ao) la hacen un muy buen
candidato para su produccin a escala comercial en la leche de vacas
transgnicas. Desafortunadamente, la seroalbmina bovina es muy similar a
la humana, lo que genera problemas para su purificacin. Una solucin sera
reemplazar el gen bovino con su contraparte humana, as la protena bovina
sera eliminada sin alterar o comprometer la viabilidad del animal. Otro
ejemplo lo constituye la -Lactoglobulina que est presente slo en la leche de
rumiantes y no tiene una funcin conocida en el proceso de secrecin de leche
(Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunas propiedades de elaboracin
indeseadas y se cree es la responsable de la mayora de las alergias a la leche
bovina, situacin que afecta a una considerable parte de la poblacin mundial.
Por lo tanto, la eliminacin de esta protena podra proporcionar nuevas
propiedades tecnolgicas a la leche (Richardson, 1985). Adems, su
eliminacin no slo ayudara con el problema de las alergias, sino que
tambin, debido a la compensacin compensacin que se producira en la
concentracin de las otras protenas de la leche, probablemente incrementara
la concentracin de casenas, lo que tendra un efecto directo para la industria

44

quesera. De la misma forma, la sobreexpresin de casenas en la leche se

esperara que alterara significativamente las propiedades tecnolgicas de la
misma como fuera demostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la
expresin de proteasas podra generar resistencia a enfermedades de gran
impacto en el sector lechero como la mastitis (Kerr y col., 2001).

12. Modelos de animales transgnicos

12.1. Animales transgnicos como fbricas de protenas: Vaca transgnica
productora de hormona del crecimiento
Cuando se quiere expresar protenas farmacolgicas para abastecer grandes
demandas, se debe pensar en producirlas en grandes cantidades. Pero, a su
vez, la produccin de estas protenas dentro del animal no debe interferir con
la biologa misma del organismo. Por ello se pens en obtener las nuevas
molculas a partir de la leche de los animales de granja. Las ventajas de esta
estrategia consisten en que es un mtodo natural con muy bajo impacto
ambiental (no se utilizan plantas industriales para la produccin de la
protena), y el costo de produccin es relativamente bajo. Adems, la leche es
un fluido corporal renovable secretado por los mamferos en cantidades
sustanciales, que permite una purificacin relativamente simple de la protena
de inters.
Se puede dividir el trabajo de obtencin del animal transgnico en tres partes:
a) Construccin del transgn, que incluye el gen de inters.
b) Transgnesis o transferencia del gen a las clulas de mamferos.
c) Deteccin de la protena recombinante.
Una vez producido un animal transgnico, se lo puede clonar para obtener
una descendencia importante genticamente idntica que, por lo tanto,
producir tambin la nueva molcula de inters.
a) Construccin del transgn
Dado que el objetivo es que la protena recombinante se produzca en la
glndula mamaria para que sea secretada en la leche, sin interferir con el
crecimiento y metabolismo del animal, es fundamental armar la construccin
gentica utilizando un elemento (promotor) que permita la expresin del gen
nicamente en la glndula mamaria. Para ello se utiliza el promotor del gen de
la casena del mismo animal, que es la protena mayoritaria de la leche y que
se expresa slo en glndula mamaria para ser secretada a la leche.

Promotor
(del gen para
casena)

GEN de inters

Construccin gentica para obtener la

expresin del transgn en la glndula
mamaria.

45

b) Transgnesis del animal

Existen varias tcnicas para transferir genes a clulas de mamferos con el
objetivo de que dicha secuencia se integre al genoma, las cuales han sido
descritas en apartados anteriores.
Los cigotos as obtenidos son luego implantados en el tero de una madre
adoptiva, o receptora, que ha sido preparada hormonalmente para poder llevar
adelante la gestacin.
Otra tcnica que se encuentra en desarrollo para ser aplicada a animales de
granja, consiste en transferir el gen de inters a las clulas de un embrin de
mamfero que proliferan in vitro y conservan su capacidad de poder
diferenciarse a otros tipos celulares. Cuando el embrin sigue su desarrollo en
el tero de una madre receptora, se forma un animal con clulas transgnicas.
c) Deteccin de la protena
Una vez nacidos los animales hay que determinar que sean transgnicos, es
decir, que contengan al menos una copia del transgn y que lo expresen, es
decir, que produzcan la protena. Si la protena de inters farmacolgico se
produce en la leche del animal, slo cuando el animal comienza a producir
leche se puede detectar la protena. En ese caso, la protena se purifica y se
obtiene el producto farmacolgico deseado.
Algunos animales de granja transgnicos
La primera oveja transgnica fue Tracy y vivi entre 1991 y 1998. Tracy
produca a1-antitripsina en la leche, un medicamento para tratar la fibrosis
qustica, una enfermedad que afecta los pulmones. La siguiente tabla muestra
algunos ejemplos de animales transgnicos utilizados para la produccin de
protenas de inters farmacolgico:
Animal Frmaco producido
Conejo
Cabra
Cerdo
Oveja
Vaca

Tratamiento

Interleukina-2

Deficiencias inmunolgicas

a-Glucosidasa

Enfermedad de Pompe

Activador del plasmingeno tisular Cogulos coronarios

Anti-trombina III

Resistencia a la heparina

Factor VIII humano

Hemofilia

Protena C

Prevencin de trombos

a1-antitripsina

Fibrosis qustica

Factor de coagulacin IX

Hemofilia

lactoferrina

Deficiencia de hierro

Hormona de crecimiento humano

Enanismo

Algunos de estos frmacos ya se encuentran en etapas avanzadas de prueba

clnica y se espera que en los prximos aos salgan al mercado, inicialmente
en Alemania y otros pases de la Comunidad Europea.

46

Vaca Transgnica productora de hormona del crecimiento

La gran produccin lechera de las vacas (10.000 litros/ao, 35 g protena/litro
de leche) las convierte en poderosos biorreactores de protenas humanas.
La primera vaca transgnica argentina se llama Pampa Mansa, y fue
producida en 2002. Pampa Mansa, transgnica y clonada, produce la
hormona de crecimiento humano para tratar casos de enanismo, y comenz a
dar leche con buenos niveles de hormona de crecimiento en octubre de 2003.
Los pasos para la obtencin de Pampa Mansa se muestran en el siguiente
esquema:

La tcnica empleada consiste en la fusin de un vulo de vaca no fecundado al

que se le quit el ncleo, con una clula de una vaca que fue previamente
transformada mediante la introduccin del gen humano que codifica para la
hormona de crecimiento humana. La clula que contiene el transgn en este
caso fue un fibroblasto (un tipo de clula que forma parte del tejido conectivo).
Como resultado de la fusin se origina un cigoto transgnico, que se desarrolla
en embrin y se implanta dentro de una vaca madre portadora, hasta su
nacimiento.
Posteriormente, en febrero de 2004 se obtuvo la segunda generacin de
animales transgnicos, Pampa Mansa II y III, clones obtenidos a partir de
Pampa Mansa. La tcnica empleada se muestra en la infografa de la pgina
siguiente extrada del Diario Clarn del 7 de febrero de 2004.

47

12.2. Animales transgnicos resistentes a la mastitis: Vaca transgnica

resistente a la infeccin intramamaria
Las posibles estrategias para producir y usar animales transgnicos
resistentes a la mastitis se fundamentan en la variedad de sustancias
antimicrobianas presentes en la glndula mamaria de los bovinos. Cuando
una bacteria logra atravesar el canal del pezn las probabilidades de mastitis
son altas. Pero los animales muestran diferentes grados de susceptibilidad
para enfermarse y en buena parte esa resistencia es determinada
genticamente. Las bases genticas de la resistencia a la mastitis no son an
bien conocidas, pero es necesario hacerse varias preguntas de tipo prctico
acerca del impacto econmico que tendra este comportamiento gentico. Los
ensayos para incrementar la resistencia de la glndula mamaria a la mastitis
utilizando cruces o vacunas han tenido hasta el momento un impacto muy
limitado. Sin embargo la revolucin contempornea en gentica animal
conducir a posibilidades an no pensadas, la transgnesis puede ser la clave
de una de ellas.
Hay dos tipos de estrategias transgnicas para aumentar la resistencia de la
glndula mamaria a la mastitis:

Aumentando la eficiencia y efectividad de los mecanismos de

defensa del husped para prevenir la entrada, sobrevivencia y
multiplicacin de los microorganismos en la glndula mamaria.

Ampliando la habilidad del sistema inmune del husped para

eliminar rpidamente la infeccin, reducir la inflamacin y/o minimizar
los daos tisulares.

48

PREVENCIN DEL CRECIMIENTO Y SOBREVIVENCIA DE LAS BACTERIAS EN LA GLNDULA MAMARIA

Cuando ingresan las bacterias a la ubre no son eliminadas a pesar del efecto
removedor que se produce durante el ordeo, debido a que ellas emplean
diversas tcnicas para permanecer, tales como la rpida multiplicacin, su
adherencia tisular o la invasin intracelular. Tericamente la transgnesis
puede ser usada para aumentar la actividad antimicrobiana con la mayor
produccin de sustancias como lisozimas, bloquear una ruta metablica
bsica del microorganismo, prevenir la adherencia al tejido o todas en
conjunto.
Eliminar la infeccin, reducir inflamacin y minimizar el dao tisular:
Una vez el microorganismo invade la glndula inicia su multiplicacin
generando por parte del husped una respuesta inflamatoria con el propsito
de controlar o eliminar el agente invasor, ya sea recurriendo a la respuesta
humoral o a la celular; la transgnesis podra emplearse para modificar la
velocidad y naturaleza de la respuesta celular, aumentar la produccin local
de anticuerpos o neutralizar toxinas y metabolitos que produzcan dao
celular.
La estrategia transgnica que se ha venido investigando en la Universidad de
Vermont, tiene por objetivo aumentar la resistencia gracias a la codificacin
gentica que estimula la produccin de pptidos antibacterianos en la
glndula mamaria (Williamson y Col 1964, Kerr y col 2001). A continuacin se
presentan los progresos de estas investigaciones.
Numerosos pptidos y protenas antimicrobianos son producidos por
microorganismos, plantas o animales, que segn su actividad van desde los
que tienen un estrecho espectro como colicinas y lisostafinas hasta molculas
de mayor espectro con actividades no especficas como lisozimas y
lactoperoxidasa. Unas y otras tienen ventajas y desventajas cuando se quiere
elegir a una de ellas para la transgnesis. En este caso se eligi un pptido, la
lisostafina que tiene un espectro especfico antiestafilococo. Esta es una
endopeptidasa que hidroliza los enlaces pentaglicina en el pptidoglicano de la
pared de Staphylococcus aureus, produciendo la lisis celular. Naturalmente la
lisostafina es producida por especies Coagulasa Negativa del gnero
Staphylococcus como es el S. simulans. Se caracteriza por ser especifica para S
aureus , con poca actividad para otras especies del mismo gnero, no es txica
y no afecta las clulas animales ni las protenas de la leche. Bramley y Foster
demostraron en 1990 que una concentracin de 10 mcg de lisostafina era
suficiente para prevenir mastitis en ratas en lactacin. Adems la expresin
gentica puede estar orientada a un tejido en particular o a un estado
fisiolgico por la adicin de sustancias promotoras o reguladoras, por ejemplo,
la produccin de B-lactoglobulina, la cual es una expresin gentica de la
glndula mamaria. La expresin de la lisostafina dirigida por una secuencia
reguladora hacia las clulas secretoras de la glndula mamaria puede lograr
animales resistentes a mastitis causada por S. aureus.
Para conseguir el objetivo de las investigaciones el gen de la lisostafina
necesitaba ser clonado del S. simulans y modificado para que se expresara en
clulas animales, esto requiere de un codon particular y del cambio de la
secuencia para minimizar las diferencias existentes entre el DNA de las clulas

49

procariticas de las eucariticas. El pptido tiene que ser secretado de las

clulas en cantidades adecuadas y biolgicamente activo y si finalmente esto
se logra, se podr obtener un animal transgnico con expresin en su glndula
mamaria para producir lisostafina y controlar la infeccin intramamaria por S.
aureus.
En 1994, John Bramley de la Universidad de Vermont report la clonacin del
gen de la lisostafina a partir de S. simulans y su modificacin para que sea
expresado en clulas de mamferos, in vitro. Este trabajo demostr que la
hiptesis del doctor Bramley era viable pero abri muchos otros interrogantes
a resolver como eran, la cantidad de pptido biolgicamente activo, que se
secretara en la leche.
En los trabajos de Williamson y col en 1994, se lograron producir pequeas
cantidades de lisostafina biolgicamente activa en el interior de las clulas
pero que no era secretada al medio. Se estableci que la secrecin requera de
una codificacin gentica adicional, siendo necesaria la adicin de una nueva
secuencia de DNA que la indujera. El pptido obtenido en este ensayo fue
ligeramente mayor al inicial pero era inactivo. Posteriormente se descubri que
la glicosilacin del pptido durante la secrecin, no solo aumentaba su peso
molecular sino que lo inactivaba, siendo necesario modificar el gen para
eliminar los fragmentos responsables de la glicosilacin y as tener un pptido
biolgicamente activo y del tamao correcto.
El nuevo gen productor de lisostafina ha sido usado por el doctor Robert Wall
y col. de USDA Beltville, para producir ratones y bovinos transgnicos. Se han
producido tres lneas de ratones transgnicos que tienen distintas capacidades
para secretar lisostafina en la leche.
Utilizando el modelo tradicional para estudiar la patognesis de la mastitis por
estafilococo, las tres lneas de ratones transgnicos fueron probadas para
evaluar su resistencia a la infeccin por S aureus. Los resultados se expresan
en la tabla siguiente:

Con estos resultados se demuestra que la resistencia a la descarga

intramamaria con S. aureus en ratones transgnicos en forma proporcional a
los niveles de lisostafina secretada (Kerr y col 2001) En colaboracin con el
USDA el trabajo se extendi a la obtencin de bovinos transgnicos
productores de lisostafina, y fue en 2005 cuando obtuvieron vacas
genticamente mejoradas para resistir la infeccin intramamaria por
Staphylococcus aureus. Las vacas transgnicas segregan en su leche
concentraciones de lisostafina que van desde 0,9 a 14 mg/ml. Se ha
demostrado con ensayos in Vitro la capacidad bactericida de la leche contra

50

Staphylococcus aureus . Fueron administradas infusiones intramamarias de

Staphylococcus aureus a 3 vacas transgnicas y a 10 vacas no transgnicas. El
incremento de clulas somticas en la leche elev la temperatura corporal e
indujo fase aguda de protenas, ambos indicativos de infeccin, en las vacas
que no eran transgnicas, pero no se observaron dichos signos en las vacas
transgnicas.

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