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CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

METODOLOGA EXPERIMENTAL :
BIOREACTOR
Condensador: por
donde salen los gases
de la respiracin del
cultivo y aire seco
inmisible en agua;

Sistema de Refrigeracin,
ya que la fermentacin es
exotrmica

Sistema de
control

Disponibilidad de
puertos adicionales

Sistema
de
Refrigeracin, ya
que la fermentacin
es exotrmica

Sensor de espuma (ingreso de


antiespumante), ya que se puede
generar espuma por el contenido
de protenas que tenga el medio
y tambin por la aireacin y
agitacin.

3 rotmetros para
el control de gases
Placa calefactora

Sistema de
conectores

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

Entrada de alimentacin
de Sustrato (Sf)

Ingreso de cido y Base


para controlar el pH
automticamente

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

SISTEMA DE CULTIVO BATCH ALIMENTAND

Este sistema consta de una computadora,


en el cual se registran los datos de pH,
Temperatura, pO2, la cantidad de cido
usado, la cantidad de base usada

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.1

Diseo del medio de cultivo

Tabla N1: Composicin de medio slido de mantencin (para 150 ml de solucin)

Nutrientes
Extracto de Levadura
Extracto de malta
Peptona
Agar
Glucosa

So
(g/l)
3
3
5
20

So
(g/150ml)
0.45
0.45
0.75
1.6

10

0.8

Tabla N 2: Composicin de medio de Activacin (para 150 ml de solucin)

Nutriente

Concentracion (g/l)

pesar (g)

Sacarosa

15

2.25

Estracto de Levadura

0.45

Estracto de Malta

0.75

Slucion de Sales

5 ml/L

0.75

Composicin de las Sales:


Solucin de sales 5mL/L

FeSO4. 7H2O
NaCl
CuSO4. 5H2O
CoCl2.6H2O

1.12
0.11
0.06
0.28
0.05
0.01
0.0005
0.027

20 ml
0.0224
0.0022
0.0012
0.0056
0.001
0.0002
0.00005
0.00054

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

COMPOSICION DEL MEDIO MINIMO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAEATCC 4126 PARA UN CRECIMIENTO DE BIOMASA DE 1.5 (g/l) PARA CL
Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi = 2 L.
(Para una concentracin final = 1.35g/l)

FUENTE

ELEMENTO

CELULA NUTRIENTE

Peso(gr)

Yx/s

S (g/L)

S (g/L)

en base
a V=2L

(C12H22O11)

45

42.105

0.561

2.4047

(NH4)2SO4

21.21

2.36

0.5733

(NH4)2SO4

0.12

24.24

202

0.0067

KH2PO4

0.5

28.75

57.5

KH2PO4

22.77

11.39

0.17790

0.3558

MgSO4.7H2O

Mg

0.4

9.87

24.68

0.083

0.166

MgSO4.7H2O

0.12

12.99

108.25

0.0318

0.0636

1.8

3.6

10ml/L

20ml

Extracto de
Levadura
Solucin de
Sales

Medio de Cultivo
pH inicial = 4.2
Shaker
Temperatura = 35 C
Velocidad de Agitacin = 200 rpm

2.4047

4.8094
1.7198

0.0100

0.0200
0.0705

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

COMPOSICION DEL MEDIO MINIMO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAEATCC 4126 PARA UN CRECIMIENTO DE BIOMASA DE 3.03(g/l) PARA CLA
Concentracin de nutrientes para un medio de fermentacin de con Vi = 4L.
(Para una concentracin final = 3.03279 g/l)
FUENTE

ELEMENTO

CELULA

NUTRIENTE

Peso(gr)

Yx/s

S (g/L)

S (g/L)

en base
a V=4L

C12H22O11

45

42.105

0.561

2.725

2.725

10.901

(NH4)2SO4

21.21

2.36

0.6509

0.9763

3.905

(NH4)2SO4

0.12

24.24

202

0.0076

0.0114

0.046

KH2PO4

0.5

28.75

57.5

0.0267

0.0399

0.160

KH2PO4

22.77

11.39

0.1347

0.2020

0.808

MgSO4.7H2O

Mg

0.4

9.87

24.68

0.0628

0.0942

0.377

MgSO4.7H2O

0.12

12.99

108.25

0.0141

0.02121

0.085

1.8

7.2

10ml/L

40ml

Extracto de
Levadura
Solucin de
Sales
X1= 1.5 g/L
X2= 3.03279

Tenemos:
gr/L
Entonces: (X =3.03279 1.5 = 1.53279 g/L)
Composicin elemental del m.o:
Elemento

% en clula

9.0

Mg

0.4

0.5

2.0

0.12

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

MATERIALES:
DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA

3.1. MATERIALES Y EQUIPOS


Biorreactor modelo : Marca: Sartorius
Modelo: BIOSTAT Aplus

Espectrofotmetro
Gasa y algodn
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel alumini

3.1.1 Medio de mantencin


3.1.1.1 Materiales y equipos
Balanza analtica
Olla a presin
Mechero Bunsen
Pipetas de 10 ml.
Tubos de ensayo con
tapas
Varilla de vidrio
Matraz erlenmeyer
Guantes.
Esptula
Probeta graduada
Capachos de papel

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.1.1.2 Reactivos
Muestra: Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126
Sustrato: sacarosa
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Glucosa
Agar.

3.1.2 Medio de fermentacin y proliferacin

3.1.2.1 Materiales y equipos


Matraz de 1 L
Matraces de 125 ml
Varilla de vidrio
Capachos de papel
Balanza analtica
pHmetro

3.1.3
3.1.3.1

Mtodo del DNS (cido Dinitrosaliclico)


Materiales y equipos
Barra magntica
Vaso de precipitado
Matraz de 100ml.
Papel aluminio
Balanza de platos
Balanza analtica
Frasquito
Agitador calentador

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.1.3.2

Reactivos
1g de cido 3,5 Dinitrosaliclico (DNS)
1.6g de NaOH 2N.
30g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

3.1.4

Determinacin de la concentracin celular por Densidad ptica.

3.1.5

Materiales y equipos
Matraces Erlenmeyer
Tubos de ensayo
Pipetas
Vasos de precipitado
Fiola
Espectrofotmetro
Centrifuga

3.1.6

Reactivos
Agua destilada
DNS

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.2.

Preparacin de medios:

Antes de disear un medio de cultivo, de preparar los medios y el cultivo de los


microorganismos,

es

importante

conocer

las

caractersticas

de

los

microorganismos con el que se va a trabajar, en este caso una cepa de


Saccharomyces cerevisiae ATCC4126

Diseo y preparacin del medio de cultivo:

Este diseo tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para
lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a
desarrollar.
Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con
el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las
materias primas.

Consideraciones y condiciones de cultivo:


Para disear el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos
proporciona la gua de prctica, en el cual podemos conocer los requerimientos
del microorganismo, para su mantencin, activacin y para la fermentacin del
cultivo por lote alimentado.

Sustrato limitante: Sacarosa


Duracin de la etapa: 4 a 6 horas de la etapa de CLA.
Fermentador: Automatizado Biostat A Plus de 5 litros.
Temperatura: 35 C
pH: Se controlara usando electrodo y unidad control.
Velocidad de agitacin: 200 RPM

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.1.7 Medio de mantencin


3.1.7.1 Procedimiento

Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de composicin de medios de


cultivo de mantencin para Saccharomyces cerevisiae ATCC-16045. (Tabla
N 1)
Luego de acuerdo a la tabla N 1 anterior se pesan las cantidades
requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.
Medir en una probeta graduada 80 ml de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando el
agua destilada.
Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando
constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparicin
de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.
Preparar 10 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 8 ml de la
mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presin,
previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de gases.
Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C y a partir de ello
controlar 20 minutos, finalizando la esterilizacin.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego
colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

3.1.8 Medio de activacin


3.1.8.1 Procedimiento

Pesar los componentes descritos en la tabla N 2


Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y malta en un tubo
de ensayo (enrazar hasta 10 ml con agua destilada), la sacarosa en
un matraz de 125 ml (10 ml con agua destilada) y sales (5 mL de
agua destilada)
Previamente a la esterilizacin utilizar NaOH y acidoortofosforico
para ajustar el pH a 6.0 de la solucin que contiene sacarosa.
Mezclar estos componentes para el medio de activacin bajo
mechero para evitar la contaminacin.
Colocar en el shaker hasta que la concentracin sea de 2gr/l para
un tiempo de 12h.
Luego se inocula en un matraz de 500 ml con un medio liquido de
48 ml que contiene sacarosa, sales y extracto de levadura.
Luego se coloca en el shaker por 12h.

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3.1.9 Medio de fermentacin y proliferacin

Procedimiento
Pesar los componente componentes descritos en la tabla N 3
Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de la
siguiente manera:
Sacarosa en un matraz de 1 L con 400 ml de agua destilada
Extracto de levadura y el cloruro de amonio en un matraz con
212 ml. de agua destilada
Las sales, K2HPO4, MgSO4. 7H2O
Regular el pH de la solucin de sales con cidoorto fosfrico e hidrxido
de sodio hasta un pH de 6
Esterilizar las diluciones por separado. Dejar enfriar
Mezclar el extracto con el azcar (sacarosa) y adicionar el inoculo.
Colocar en Bao Maria con el agitador magntico e iniciar el cultivo
continuo con adicin de nutrientes

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3.2 Obtencin de la curva caracterstica de crecimiento de una levadura


Para la obtencin de esta curva, es necesario considerar 5 estados estacionaros.

Estados estacionarios:

dx
0
dt

Considerando que en estado estacionario se cumple que:

=D

Calculo de la Velocidad de Aireacin Especfica (vvm)

Vvm = flujo de aire o caudal / volumen de medio


vvm = Q / VL

Se trabajar con vvm= 0.5


VL = 2 L

Flujo de aire o caudal = vvm x volumen de medio

Q = 0.5 x 2 L
Q=1
Este ltimo valor es la velocidad de aireacin especfica con la que se trabajara
para alcanzar la concentracin deseada.

3.3 Perturbacin de un estado estacionario mediante aumento de la concentracin del


nutriente limitante en la alimentacin.

Habindose obtenido los cinco estados estacionarios en el crecimiento de la levadura,


se perturbara este estado aumentando la concentracin de sacarosa (Nutriente
limitante) en la alimentacin, con el cual el estado estacionario en el que se
encontraba terminar, dando lugar a un comportamiento logartmico.

CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

Este nuevo flujo tendr una concentracin de Sacarosa = 15.0 g/l. Para este estado
estacionario consideraremos los siguientes datos:

Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121C por 20 min.


Determinacin de la velocidad especfica mxima de crecimiento mediante lavado

Para poner en marcha esta actividad, comenzamos realizando los siguientes pasos:

Cortar el flujo de alimentacin, despus de haber transcurrido el tiempo de


fermentacin; en donde se alcanza una reduccin de X y = max.= 0.37h-1
Utilizando la ecuacin de balance general de clulas:

dx
Dx x
dt
Obtenemos la grfica Ln X vs. t.

Utilizando la siguiente frmula: Ln(X/Xo) = (-D)t,


Luego trazamos una recta tangente a la curva, considerando un D >> max, entoncesD
= 1, y obtenemos el max a travs de la funcin tangente.

3.4

Mtodos de anlisis

La sacarosa se analizar colorimtricamente

por el mtodo DNS, la biomasa se

estimara por densidad ptica en el espectrofotmetro a longitud de onda de 640 nm.


La curva de calibrado para biomasa se determina a travs de peso seco de las clulas.
Para alcanzar cada estado estacionario se necesita tres tiempos de residencia ( = D-1).

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3.4.1

3.4.1.1

Mtodo del DNS (cido Dinitrosaliclico)

Procedimiento

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en


aproximadamente 50 ml de agua, paralelamente el NaOH en 20 ml
de agua.

Ambas soluciones se mezclan en un vaso de precipitado de 250 ml y


se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes.
Se disuelve el DNS en pequeas cantidades con ayuda de un agitador
magntico y calentando.
Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Luego verter en una fiola de 100 ml, enrazar y mezclar
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:
Se aade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de solucin de sacarosa
hidrolizada.
Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5
minutos para luego enfriar con agua helada por 3 minutos.
Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 10 minutos,
luego agitar.
Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia
en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestra de
concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.

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3.4.2

Determinacin de la concentracin celular por Densidad ptica.

3.4.3

Procedimiento

El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la


concentracin de microorganismos a medida que avanza el tiempo, esto puede ser
detectado fcilmente por espectrofotometra a 640 nm.
Para sta determinacin es necesario que previamente se elabore una curva de
calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son
determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento
Se aade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a analizar.
Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para luego
enfriar con agua helada.
Se aaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego agitar.
Se lee la absorbancia a 640 nm, utilizando agua como blanco.
La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de
calibrado a 540 nm.

Grfico N01: Esquema del sistema para cultivo continuo

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