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Alumno:
Grupo:
Se realizar un total de seis prcticas que tendrn una duracin de 5 das, con
el siguiente plan de trabajo:
Da 1.
Prctica 1.
Da 2.
Prctica 2.
Da 3.
Da 4.
Prctica 5 (1 parte).
Da 5.
Indice
Prctica 1. El cariotipo humano ............................................
p7
p 23
p 10
p
18
p 31
PRACTICA 1
EL CARIOTIPO HUMANO
Cariotipo normal y de individuos con alteraciones
cromosmicas
Objetivo y material
El objetivo de esta prctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende que el alumno
aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de cariotipos que reflejan
alteraciones cromosmicas, obtenidos de individuos que presenten diferentes sndromes.
Para ello se utilizar un programa de ordenador en el que se muestran los cromosomas
metafsicos teidos pertenecientes a diversos individuos. El alumno deber ordenar el cariograma
y determinar si existen anomalas cromosmicas en cada individuo.
Introduccin
El cariotipo es el complemento cromosmico particular de un individuo y viene definido
por el nmero y morfologa de los cromosomas en la metafase mittica. En la especie humana la
dotacin cromosmica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales).
Utilizando tcnicas de tincin estndar los cromosomas aparecen uniformemente teidos en
metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posicin
del centrmero que define su morfologa. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por
tamaos decrecientes y por la posicin del centrmero. Los cromosomas sexuales X e Y
constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamao, el cromosoma X se
incluira en el grupo C, y el Y, en el grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda
constituido as:
Grupo
A
Pares cromosmicos
1, 2 y 3
4y5
C
D
E
6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12
13, 14 y 15
16, 17 y 18
F
G
X, Y
19 y 20
21 y 22
Caractersticas
Cr. muy grandes casi metacntricos (1 y 3
metacntricos, pero 2 submetacntrico)
Cr. grandes y submetacntricos, con dos brazos
muy diferentes en tamao
Cr. medianos submetacntricos
Cr. medianos acrocntricos con satlites
Cr. pequeos, metacntrico el 16 y
submetacntricos 17, 18
Cr. pequeos y metacntricos
Cr. pequeos y acrocntricos, con satlites.
El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero
sin satlites.
(Todos los cromosomas autosmicos estn ordenados en orden decreciente de tamao, excepto el
cromosoma 21 que ahora se sabe que es ms pequeo que el 22)
Sin embargo, atendiendo solamente a estos parmetros no es posible identificar
inequvocamente cada par de cromosomas. Para ello es necesario utilizar diferentes tcnicas de
bandeo cromosmico. Los distintos patrones de bandas que se consiguen son constantes y
2
A
1
B
4
C
6
10
11
12
D
13
14
E
16
15
17
18
Crs.
sexuales
19
20
21
22
Citogentica clnica
En 1956, Tijo y Levan determinaran el complemento cromosmico diploide del hombre
(2n = 46). En 1959 Lejeune describi la primera cromosomopata o enfermedad originada por una
alteracin cromosmica, el sndrome de Down producido por una trisoma del cromosoma 21.
Desde entonces, la Citogentica Humana ha ido desarrollndose como una ciencia mdica.
Hay dos tipos fundamentales de cromosomopatas:
- Variaciones cromosmicas estructurales: afectan a la estructura del cromosoma en
cuanto a la ordenacin lineal de los genes. Aqu se incluyen deleciones, duplicaciones, inversiones
y translocaciones.
3
Protocolo
En la pantalla se presentarn los cromosomas desordenados sobre la plantilla donde hay
que ordenar el cariograma. Pinchando con el ratn y arrastrndolos, se irn colocando sobre la
casilla correspondiente. Habr que ordenarlos por parejas segn su tamao, la posicin del
centrmero y las bandas, teniendo en cuenta las siguientes reglas:
- pinchando en align all, todos los cromosomas se colocarn en posicin vertical,
facilitando su ordenacin.
- el brazo largo de cada cromosoma se sita hacia abajo. Para dar la vuelta a un
cromosoma, pinchar dos veces sobre el mismo.
- los autosomas se disponen en orden decreciente de tamaos mientras que los
cromosomas sexuales deben ir por separado.
- hay en total 5 cariotipos distintos (5 muestras o samples). Se recomienda empezar por
la primera y hacer como mnimo las muestras 1, 2 y 3.
Siguiendo estas instrucciones generales, proceder de la siguiente manera:
1. Contar los cromosomas y apuntar el nmero.
2. Buscar y colocar los cromosomas ms pequeos y acrocntricos que corresponden al
grupo G y, cuando est presente, al cromosoma Y que ser el ms largo de los anteriores. En total
sern 5 si es XY o 4 si es XX.
3. Buscar otros 6 cromosomas acrocntricos pero ms grandes que los
anteriores y que constituyen el grupo D. Colocarlos emparejados.
4. Buscar los 4 cromosomas ms pequeos que nos quedan, que son
metacntricos. Colocarlos en el grupo F.
5. Buscar los cromosomas del grupo E que son 6, algo mayores que los F. Dos de las
parejas, la 17 y 18, son submetacntricos y la 16 metacntricos.
6. Buscar los 6 cromosomas del grupo A. Son los mayores. Los pares 1 y 3 son
metacntricos (el 1 mayor que el 3) y el 2 submetacntrico.
7. Buscar los 4 cromosomas del grupo B que son los submetacntricos de mayor tamao.
8. Buscar los 14 cromosomas del grupo C. Encontraremos ms de 14 cromosomas, ya
que el cromosoma X es idntico a los que constituyen el par 12. Para diferenciarlo hay que
recurrir al estudio de las bandas lo mismo que, en general, para numerar las parejas dentro de
cada grupo.
En el caso de que haya ms de 46 cromosomas, buscar a qu grupo pertenece el
sobrante, colocarlo all y sealar el sndrome a que da lugar esta anomala. En caso de que el
nmero de cromosomas sea inferior a 46 sealar el cromosoma que falta as como el sndrome a
que da lugar esta anomala.
Si el nmero de cromosomas es de 46, estudiar cada cromosoma para comprobar si hay
algn tipo de alteracin estructural (deleciones, translocaciones...).
Cuando hayamos terminado, pinchando en Verify el programa nos indicar si los
cromosomas estn colocados correctamente. Sobre los que no aparezca la marca roja, es que
estn mal colocados. A veces simplemente hay que colocar bien el cromosoma dentro de su
casilla, si no no se detecta.
Por ltimo, hay que hacer el diagnstico del cariotipo obtenido. Pinchando en diagnosis
saldrn varias opciones; se elegir la que se estime oportuna, y el programa nos dir si hemos
acertado. Si el diagnstico no es correcto, vuelve a observar el cariograma detenidamente. Si lo
es, puedes pasar a la siguiente muestra.
Preguntas de la prctica:
1.- Qu caractersticas permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de
otros?
2.- Qu clulas del organismo llevan el cariotipo diploide completo?
3.- Qu mecanismos cromosmicos producen anomalas del cariotipo humano?
4.- Se manifiestan siempre las alteraciones cromosmicas en el fenotipo del
individuo que las transmite? Explica tu respuesta.
Respuestas:
PRACTICA 2
TRANSFORMACION BACTERIANA
Objetivo y material
Familiarizar al alumno con tcnicas de biologa molecular de uso general tanto en estudios
de gentica bsica como en aplicaciones tecnolgicas. Se observar la adquisicin de resistencia al
antibitico Ampicilina de una cepa de Escherichia coli inicialmente sensible al antibitico.
Introduccin
La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan ADN libre presente en el
medio. Es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia con que
ocurre vara enormemente de unas especies a otras. Para que ocurra la transformacin, la bacteria
tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas
condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana
celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.
En el laboratorio se ha conseguido poner a punto tcnicas que inducen el estado de
competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas
tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen poros en la pared, lo
que permite una transformacin bastante eficiente. Algunos de estos mtodos son la
electroporacin, consistente en inducir la competencia mediante la aplicacin de un pulso
elctrico muy breve e intenso, o tratamientos qumicos con sustancias como el cloruro clcico o el
TSB. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del
cultivo se hacen competentes.
La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos
permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular superenrollada en casi
cualquier tipo de bacteria. El mtodo que se describe a continuacin es, por su simplicidad, uno
de los ms utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformacin, el ADN
introducido llevar un marcador seleccionable.
Materiales
La bacteria a transformar ser una estirpe de E. coli de uso comn en el laboratorio, que
se denomina DH5. Estas bacterias son sensibles al antibitico Ampicilina, es decir, no son
capaces de crecer en un medio de cultivo que contenga dicho antibitico.
El ADN que introduciremos en estas bacterias ser un plsmido, denominado pUC18, que
contiene un gen cuyo producto confiere resistencia al antibitico Ampicilina.
Como medio de cultivo lquido utilizaremos LB (10 g/l triptona, 5 g/l extracto de
levadura, y 5 g/l de ClNa), un medio rico en nutrientes en el que las bacterias se multiplican con
rapidez. El medio de cultivo slido ser LA (LB con agar al 1.5%). Tanto LB como LA se tendrn
ya preparados y esterilizados, pero el medio slido habr que repartirlo en placas de Petri y aadir
en su caso el antibitico para conseguir un medio selectivo para los transformantes.
Para la induccin de la competencia y posterior transformacin usaremos el medio TSB,
que contiene, aparte de los componentes del LB, lo siguiente: 10% PEG, 5% DMSO, 10mM
MgCl2, 10 mM MgSO4. Tambin se utilizar TSB suplementado con 20mM de glucosa.
Protocolo
7
Durante todo el proceso, y para evitar la contaminacin del cultivo bacteriano, habr que
trabajar en condiciones de esterilidad.
Da 0
1.
Inocular las bacterias en 10 ml de LB e incubar a 37C con agitacin toda la noche.
Da 1
1.
Dilur 1/10 el cultivo bacteriano (1 ml del cultivo en 10 ml de medio de cultivo LB
fresco)
2.
Incubar una hora a 37C con agitacin.
3.
Durante el tiempo de incubacin, aprovecharemos para comprobar que la estufa
est a 37C y descongelar reactivos. Tambin prepararemos el medio slido. El bote de LA ya
preparado, esterilizado y solidificado, lo introduciremos en el microondas para que se funda.
Despus se deja enfriar hasta unos 50C (que se pueda coger el bote sin quemarse) y se aade, en
su caso, el antibitico Ampicilina. Utilizaremos un stock de Ampicilina disuelta en agua destilada y
estril a una concentracin de 100 mg/ml. Queremos alcanzar una concentracin final de
antibitico en el medio de cultivo de 100 g/ml. Se mezcla suavemente y se vierte sobre placas de
Petri (unos 25 ml por placa). Se deja sobre una superficie plana hasta que solidifique. Todo esto
se debe realizar en condiciones de esterilidad.
4.
Medir la D.O. (densidad ptica, o absorbancia) a 600 nm de 1ml del cultivo.
Queremos que las bacterias se encuentren en fase exponencial, por lo que la D.O. debe estar entre
0.3 y 0.9. Una D.O. de 0.5 se corresponde aproximadamente con una concentracin de 10 8
bacterias/ml.
5.
Centrifugar las clulas, 10 minutos a 4000 rpm. Mientras se centrifuga, coger hielo
picado de la mquina para el paso siguiente.
6.
Tirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de bacterias en 1/10 del volumen
inicial (1ml) de TSB fro y dejar en hielo 10 minutos. Durante este tiempo, las bacterias van
adquiriendo el estado de competencia.
7.
Poner dos tubos eppendorf estriles en hielo. Marcarlos como A y B. Poner en
cada uno 100 l de clulas.
8.
Al tubo A, aadirle 2 l (0,5 g) del ADN plasmdico.
9.
Incubar 5 minutos ms en hielo.
10.
Sacar los tubos del hielo. Aadir a cada uno 900 l de TSB con glucosa.
11.
Incubar 15 minutos a 37C para dar tiempo a que se expresen los genes recin
introducidos en la clula.
12.
Sembrar 100 l de cada tubo en una placa de LB+ampicilina. Sembrar tambin 100
l en una placa de LB sin antibitico.
13.
Dejar las placas en la estufa de 37C hasta el da siguiente.
Da 2
1.
Observar el crecimiento en las placas. Contar las colonias que hayan crecido en las
placas de LB+Ampicilina. Una incubacin excesivamente larga de estas placas, o un nmero muy
elevado de colonias, podran dar lugar a la aparicin de "colonias satlite" de pequeo tamao
alrededor de las colonias grandes; estas pequeas colonias no se contabilizan, pues no representan
bacterias que hayan adquirido el gen de resistencia, sino ms bien bacterias que consiguen crecer
gracias a que las bacterias resistentes degradan el antibitico a su alrededor.
Preguntas de la prctica
8
1.
Calcular el nmero de transformantes por g de ADN aadido, con la
frmula: (n de colonias / g ADN aadidos) x10 (porque hemos sembrado slo la
dcima parte de la transformacin)
2.
Calcular la frecuencia de transformacin utilizando la frmula
Frec. transf =
n transformantes / g ADN
________________________
n clulas totales
Para calcular el nmero de clulas habr que partir de la D.O. del cultivo
inicial y de ah calcular, primero, cuntas clulas haba en el cultivo de partida, y
segundo, cuntas en el tubo A.
3.
En la placa de LB+Ampicilina sembrada con 100 l del tubo B no debera
haber colonias. Sabras explicar por qu? Para qu se realiza este control?
4.
Describe qu observas en la placa de LB sin Ampicilina, y explcalo.
Respuestas
PRACTICA 3
ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA
Objetivo y material
El objetivo de esta prctica es que el alumno aprenda a confeccionar y esquematizar
rboles genealgicos; a determinar, en la medida de los posible, el genotipo de los individuos que
lo componen, y a conocer la transmisin de algunos caracteres sencillos y de fcil observacin.
El material biolgico de esta prctica sern los propios alumnos y sus familiares para la
observacin de algunos caracteres genticos. Con sus datos se elaborarn las genealogas.
Introduccin
El hombre presenta ciertas caractersticas especiales que lo califican como un material
difcil para el estudio gentico. De hecho, estas caractersticas son:
1. Hay una gran diversidad gentica de individuos, y tambin la estructura gentica de las
poblaciones humanas vara continuamente debido a las migraciones, la mezcla de razas, etc.
2. Por motivos ticos y morales no se practican cruzamientos experimentales, de los que
por otra parte no se obtendra gran informacin, ya que:
a) de cada parto suele nacer un solo individuo
b) las gestaciones son largas
c) entre una generacin y la siguiente transcurre mucho tiempo
d) el tamao de las familias es pequeo.
En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigacin gentica
presentan caractersticas mucho ms ventajosas. Por ejemplo en los ratones, ocurre una
generacin cada dos meses y los descendientes de cada pareja pueden contarse por decenas. En
Drosophila, la generacin dura 20 das y se cuentan los descendientes por centenares.
As, en estos organismos y otros de caractersticas similares, los cruzamientos
experimentales constituyen uno de los mejores mtodos para el conocimiento de los caracteres
hereditarios.
Por lo tanto, la gentica humana tiene que recurrir para su desarrollo a mtodos indirectos
tales como el uso de pedigrs o rboles genealgicos, anlisis de poblaciones, etc.
A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de tcnicas
genealgicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos caracteres determinados
genticamente y de los genes que los controlan, hasta llegar a varios millares. Posteriormente, las
tcnicas citogenticas y moleculares han permitido identificar nuevos genes y determinar su
localizacin cromosmica.
Protocolo
La prctica en s consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones
fenotpicas para cada uno de los caracteres monognicos que se describen a continuacin, de
donde el alumno deducir su genotipo en cada caso. Los datos se tomarn en una hoja como la
que se indica al final de esta prctica. Se usar una hoja de datos para cada persona.
Descripcin de los caracteres
10
11
II
1
III
3
12
HOJA DE DATOS 1
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 2
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 3
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
recto
..... largo
13
Deteccin PTC:
. SI
. NO
_____________________________________________________________________________
14
HOJA DE DATOS 4
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 5
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 6
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
recto
..... largo
15
Deteccin PTC:
. SI
. NO
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 7
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 8
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 9
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
recto
Pigmentacin del iris .... presente
16
..... ausente
Deteccin PTC:
. NO
. SI
..... corto
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 10
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 11
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
recto
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
HOJA DE DATOS 12
_____________________________________________________________________________
Parentesco
_____________________________________________________________________________
Fenotipo
Lbulo de la oreja
Fenotipo
Dedo autoestopista
Pico de viuda
..... presente
.... ausente
..... corto
..... largo
Lengua en U
..... capaz
..... incapaz
Dedo meique
..... curvado
.....
recto
17
..... ausente
Hoyuelos faciales
..... ausente
..... corto
Deteccin PTC:
. NO
. SI
..... largo
_____________________________________________________________________________
ARBOLES GENEALOGICOS
18
PRACTICA 4
ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGNICA
Recuento de las lneas de las huellas dactilares
Objetivo y material
1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias.
2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfologa.
3.- Determinar el recuento total de lneas (TRC) de un juego completo de huellas.
4.- Construr un histograma de la distribucin de frecuencias con los datos obtenidos del grupo de
prcticas.
5.- Discutir las caractersticas de la herencia polignica y el por qu de su difcil anlisis.
Introduccin
La herencia polignica no se puede analizar empleando pedigres ni estudiando los
cromosomas (de no ser que se estudie una aberracin cromosmica en concreto). Un rasgo
polignico es el fenotipo resultante de la accin de dos o ms genes. Estos tienen unas
caractersticas comunes:
1.- los rasgos se cuantifican midindose,
2.-los rasgos son controlados por 2 o ms genes resultando en un efecto aditivo,
3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos mltiples,
4.- los fenotipos de los rasgos polignicos y multifactoriales varan de expresin
por efecto de los factores ambientales.
Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el peso, la
inteligencia, el color de la piel, etc.
Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos polignicos no es fcil. El ejemplo que a
continuacin te proponemos estudiar explorar cmo los rasgos de la herencia de las huellas
dactilares son modelos de herencia polignicas. Recogeris las huellas dactilares vuestras y
prepararis un perfil de las mismas.
En 1890, Francis Galton sugiri que las huellas dactilares seran una buena manera de
identificacin para humanos. Durante los ltimos aos de hecho, tanto los dibujos de las huellas
dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las palmas de las manos y pies han sido de gran
inters para numerosos estudios especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la
huella del recin nacido para el diagnstico precoz de anormalidades cromosmicas.
La herencia de las huellas dactilares, al igual que los dems caracteres de herencia
polignica, tambin se ve influda por factores ambientales aunque, debido a la precocidad y
rapidez del desarrollo de stas, el fenotipo no cambiar tras el nacimiento. Las huellas dactilares
se pueden detectar a partir de la 6 semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo
hacia la semana 12-13. Posteriormente regresarn hasta adquirir la morfologa final que ya no se
ver alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.
19
ARCOS
LAZOS
ESPIRALES
165
145
126
114
47, XYY
48, XXYY
48, XYYY
49, XXXXX
103
88
83
17
20
meique dcho(V)
mano derecha
patrn
obtenido:
recuento
parcial:
pulgar
ndice
corazn
anular
meique
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
mano izquierda
patrn
obtenido:
recuento
parcial:
pulgar
ndice
corazn
anular
meique
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
____________
TRC= ___________
21
sexo
V/M
TRC
% del total:
media del
TRC:
media TRC
mujeres:
media TRC
varones:
lazos*
espirales*
arcos*
______
______
______
________
________
________
22
Histograma de la distribucin de
frecuencias
10
n alumnos
Preguntas de la prctica:
1.- Cul es la media TRC para la clase? Existen diferencias en las TRC medias
para los varones y mujeres?
2.- Cul puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta.
3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo.
4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma.
5.- De haber recogido datos de una poblacin mucho mayor crees que el grfico
presentara otro aspecto? Razona tu respuesta.
Respuestas:
23
PRACTICA 5
ESTUDIO DE POLIMORFISMOS
Anlisis del grupo sanguneo y de un VNTR
Objetivo y material
1.- Anlisis de un polimorfismo fenotpico: determinacin del grupo sanguneo.
2.- Anlisis de un polimorfismo silencioso de ADN tipo VNTR.
3.- Evaluar la utilidad de ambos para diversas aplicaciones mdicas y legales.
En ambos casos, el material de partida ser la sangre de los propios alumnos, y en su caso,
muestras de sangre de familiares de stos, previamente recogidas.
Introduccin
Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad gentica de la especie. Se dice que existe
un polimorfismo en un determinado locus cuando hay ms de un alelo presente en la poblacin
con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo slo puede presentar como mximo dos
alelos distintos para un locus, un estudio poblacional puede revelar la presencia de mltiples alelos
para ese locus, especialmente en ciertos loci que son altamente polimrficos.
Una pequea proporcin de los polimorfismos en el ADN dar lugar a diferencias a nivel
de los aminocidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de protenas. Pero la
mayora de los polimorfismos en las secuencias de ADN ocurren en ADN no codificante, y no
tienen por tanto efecto fenotpico (se denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de
polimorfismos sean silenciosos es, por una parte, que la gran mayora del genoma humano
consiste en ADN no codificante; y por otra, que este ADN est sometido a menores presiones
selectivas.
El anlisis de polimorfismos en el ADN se aplica a estudios poblacionales y al estudio de la
evolucin del genoma humano. Otra aplicacin que ha cobrado gran importancia consiste en
detectar polimorfismos asociados a ciertas patologas, lo que permite en muchos casos localizar el
gen responsable, y permite tambin a veces realizar el diagnstico de la enfermedad. Por ltimo,
el estudio de polimorfismos tiene un creciente inters en el mbito de la Medicina Legal; el
anlisis gentico de la diversidad humana permite resolver ciertos problemas judiciales, utilizando
la "huella del ADN" a modo de huellas dactilares. El anlisis conjunto de varios polimorfismos
(tanto fenotpicos como silenciosos) permite identificar individuos con unos mrgenes de error
despreciables. Por otra parte, la ventaja sobre otros sistemas de identificacin, como las huellas
dactilares, es que se trata de caracteres genticos que se heredan de manera mendeliana. Esto
permite su uso en pruebas de paternidad.
En esta prctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos maneras muy
distintas. En primer lugar se estudiar el polimorfismo del locus AB0 que determina el grupo
sanguneo. Puesto que es ste un polimorfismo fenotpico, y adems la penetrancia es del 100%,
el anlisis se har directamente sobre el producto gnico. En segundo lugar estudiaremos un
polimorfismo de ADN silencioso. Para ello amplificaremos por PCR una regin de ADN
genmico que incluye un VNTR. Finalmente analizaremos los datos obtenidos por todo el grupo.
24
IAIA IAi
anti-B
IBIB IBi
anti-A
ii
AB
IAIB
ninguno
Ay B
anti-A y anti-B
ninguno
Las personas que poseen en sus eritrocitos un tipo de antgeno carecen del anticuerpo
respectivo, pero este ltimo est presente en el suero de las personas que carecen de dicho
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antgeno. Por lo tanto, en una transfusin se producir reaccin de aglutinacin antgenoanticuerpo o no segn los casos, tal como se indica en el siguiente cuadro:
Origen del suero (receptor)
AB
AB
Sistema MN
En 1927 se descubri el sistema MN, mediante experimentos con conejos. Los grupos
MN dependen de un par de alelos codominantes M y N, responsables de tres genotipos: MM,
MN y NN y sus respectivos fenotipos M, MN y N. Este sistema es de escasa importancia en la
transfusin sangunea o en la incompatibilidad materno fetal. Su significacin principal en la
gentica mdica deriva del hecho de que sus frecuencias relativas y su herencia codominante los
hacen especialmente tiles para resolver problemas de identificacin, paternidad etc.
Sistema Rhesus
Un tercer sistema de antgenos de superficie de los eritrocitos es el sistema Rhesus
descubierto por Landsteiner, Wienes y Levine en 1940. En un primer anlisis y para simplificar se
consideran dos grupos en este sistema:
- Rh+, individuos que poseen antgenos Rh.
- Rh-, indviduos que no poseen antgenos Rh.
Los anticuerpos anti-Rh no son anticuerpos naturales, no existen normalmente en la
sangre, pero aparecen en individuos Rh- que han recibido antgenos Rh como consecuencia de
una transfusin de un donante Rh+ o despus de un embarazo. La madre Rh- se sensibiliza por los
eritrocitos Rh+ del primer hijo, produciendo anticuerpos anti-Rh. El segundo embarazo de un
nio Rh+ produce un aumento masivo de anticuerpos, que pasan a travs de la placenta y
aglutinan los glbulos rojos del nio.
Este sistema revel la explicacin de una enfermedad hemoltica que se produce en el
recin nacido, la eritroblastosis fetal, adems de las reacciones de aglutinacin que ocurran en
transfusiones de sangre entre personas del mismo tipo respecto al sistema AB0.
Las bases genticas del sistema Rh son complejas, al estar constituido por un gran nmero
de antgenos eritrocitarios distintos. Este sistema est codificado por tres loci muy prximos entre
s (C, D, E y sus recesivos respectivos c, d, y e) en el brazo corto del cromosoma 1. Cada uno de
los alelos produce un antgeno y los anticuerpos correspondientes aparecen para todos menos
para el d.
El alelo D, es de un inters primordial al ser el responsable de la codificacin del antgeno
D que es muy antignico y provoca la sensibilizacin. Es por esto que para fines prcticos las
personas se consideran Rh+ si poseen el antgeno D y Rh- si carecen del antgeno D segn la
siguiente tabla:
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Genotipo
Antgeno
Rh
DD
Dd
dd
Posteriormente se han descrito otros grupos sanguneos tales como los sistemas Kell,
Diego, Kidd, P de herencia autosmica y el Xg ligado al cromosoma X. Estos sistemas no son de
gran importancia en las reacciones de aglutinacin postransfusin pero pueden ser utilizados
como marcadores genticos tiles para la exclusin de posible paternidad, determinacin del
grado de histocompatibilidad etc.
Protocolo
Sistema AB0
La determinacin de grupos del sistema AB0 se efecta enfrentando los hemates problema
con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti A,B (grupo 0). La aglutinacin o
no aglutinacin de los hemates ensayados frente a cada uno de los antisueros es indicativa de la
presencia o ausencia de los correspondientes antgenos en los mismos.
1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB.
2.- Con una lanceta estril realizar una puncin en el cuarto dedo de una mano.
3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequea de la sangre a ensayar.
4.- Aadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado.
5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo.
6.- Mover la placa lentamente por rotacin a temperatura ambiente. Examinar
macroscpicamente la aparicin de aglutinacin a los 2 minutos.
Sistema Rh (anti-D)
La presencia del antgeno D se determina enfrentando los hemates problema, en un medio
proteico alto, con suero anti-D. La aglutinacin o no aglutinacin de los hemates ensayados es
indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente antgeno en los mismos.
1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado.
2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST.
3.- Aadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamao aproximado a la gota de suero en l
depositada.
4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una extensin de unos
2 cm cuadrados.
5.- Colocar los portas sobre la lmpara visualizadora precalentada (45).
6.- Mover la lmpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos, observando
macroscpicamente la aparicin de cualquier signo de aglutinacin .
Lectura
Reaccin negativa: ausencia de aglutinacin al cabo de los 2 minutos.
Reaccin positiva: aglutinacin visible a los dos minutos y ausencia de aglutinacin con el
autocontrol. La reaccin positiva indicar cul es el antgeno presente en los eritrocitos (por ej. si
sale aglutinacin en la casilla A el grupo sanguneo ser A).
27
Preguntas:
1.- Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo genotipos posibles.
2.- Por qu se tiene en cuenta el grupo sanguneo de las series AB0 y Rh en las
transfusiones y no la serie MN?
3.- Por qu el antgeno D define bsicamente al grupo Rh?
4.- Por qu el anlisis de los grupos sanguneos slo sirve en algunos casos
para exclur la paternidad y no para asignarla?
5.- En qu casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer
embarazo asumiendo incompatibilidad Rh?
Respuestas:
28
Puesto que la tcnica de PCR es muy sensible a la contaminacin con cualquier otro ADN,
durante todo el proceso tendremos especial cuidado en tocar todo con pinzas o guantes y no
poner en contacto muestras distintas.
Da 1
a) obtencin del ADN genmico total
1. - Utilizando un punzn estril, pinchar el dedo anular hasta que sangre. Con una pipeta,
recoger cuidadosamente la sangre; con 5 l es suficiente, si sale ms, mejor. Pasarla a un tubo
eppendorf.
2. - Aadir 1 ml de agua destilada. Mezclar bien, invirtiendo el tubo varias veces.
3. Centrifugar 1 minuto en la microcentrfuga. Recoger el sobrenadante con una pipeta y
desechar. ATENCION: el precipitado apenas ser visible. Hay que recoger con una pipeta de 1 ml
aproximadamente 960 l del sobrenadante, sin tocar ni remover el fondo del tubo.
4. Aadir 100 l de resina InstaGene. La resina estar en agitacin constante y
cogeremos el volumen indicado utilizando una punta de boca ancha (azul). Mezclar.
5. Incubar a 56C 15 minutos.
6. Agitar el tubo en vortex a mxima potencia durante 10 segundos.
7. Incubar en bao hirviendo durante 8 minutos.
8. - Repetir la agitacin en vortex otros 10 segundos.
9. Centrifugar 2 minutos.
10.- Recoger 20 l del sobrenandate con cuidado de no coger la resina, que queda al
fondo del tubo. Los pasaremos a otro tubo eppendorf de 0.2 ml en hielo que contiene 30 l de la
mezcla de PCR.
b) amplificacin de la regin de ADN que contiene el polimorfismo
1. - Tendremos en un tubo en hielo: 20 l del sobrenadante con el ADN, y 30 l de
mezcla de PCR. La mezcla de PCR contiene todo lo necesario para la amplificacin de la regin
concreta del genoma que queremos estudiar, excepto el enzima:
- cebadores especficos que se unirn a ambos lados de la regin VNTR.
- tampn, magnesio y sal adecuados para que funcione la polimerasa.
- deoxinucletidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), precursores del ADN de nueva sntesis.
2. - Aadir al tubo 0,5 l de la termopolimerasa, el enzima que llevar a cabo la sntesis del
ADN a partir de los cebadores y tomando como molde el ADN del alumno.
3. - Meter la muestra en el termociclador debidamente programado para realizar 29 ciclos
de desnaturalizacin del ADN (95C), renaturalizacin para que se unan los cebadores (65C), y
polimerizacin del nuevo ADN (72C).
Da 2
1. - Recoger los tubos con las muestras amplificadas.
2. - Preparar un gel de agarosa al 1.5% en tampn TBE con bromuro de etidio. NOTA: el
bromuro de etidio es un potente mutgeno. Manipular en todo momento con guantes.
3. - cargar en el gel 15-25 l de la muestra con 3-5 l de tampn de carga. Inclur en otros
pocillos del mismo gel los controles de tamao adecuados.
4. - Realizar la electroforesis a 120V durante 90 minutos.
5. - Llevar el gel al transiluminador y obtener la imagen de los fragmentos de ADN.
6. - Analizar los datos obtenidos por todo el grupo.
Preguntas:
30
Respuestas:
31
PRACTICA 6
GENTICA DE POBLACIONES
Aplicacin de la ley de Hardy-Weinberg en la gentica de los
grupos sanguneos (alelos mltiples)
Objetivo y material
1.- Calcular las frecuencias de los fenotipos de grupos sanguneos obtenidos en la prctica.
2.- Calcular las frecuencias allicas y genotpicas basndose en la ley de Hardy-Weinberg.
3.- Determinar si la poblacin est o no en equilibrio, y por qu.
El material utilizado sern los resultados obtenidos en la prctica 5(a).
Introduccin
G.H. Hardy y W. Weinberg definieron los principios bsicos de la herencia polignica y
demostraron que en poblaciones en equilibrio las frecuencias (p y q) de los diferentes alelos de
un gen (A y a respectivamente) permanecen constantes generacin tras generacin, siempre y
cuando no se produzcan fenmenos de mutacin, seleccin, deriva gentica, migracin o deriva
meitica. En el caso de dos alelos (A y a) si p es igual a la frecuencia del alelo A, y q la frecuencia
del alelo a; entonces:
p+q=1
(o lo que es lo mismo en porcentajes: el % p + el % q = 100%)
En poblaciones donde la fecundacin ocurre de forma aleatoria, las frecuencias para los
distintos genotipos sern:
(vulo) p (A)
(vulo) q (a)
(espermatozoide)
p (A)
p2 (AA)
qp (aA)
(espermatozoide)
q (a)
pq (Aa)
q2 (aa)
p2 + q2 + 2pq = 1
Esta frmula tambin se puede usar para calcular las frecuencias de los alelos A o a en la
poblacin. En el caso de los grupos sanguneos AB0 existen 3 alelos del locus de la isoaglutinina
(I). En este sistema A y B son codominantes, y ambos son dominantes respectos a 0. Este sistema
tiene seis combinaciones genotpicas posibles: AA, A0, BB, B0, AB, 00.
Los individuos homocigticos AA y heterocigticos A0 son fenotpicamente iguales, lo
mismo que los individuos BB y B0. Esto dar lugar a 4 combinaciones fenotpicas conocidas
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como A, B, AB y 0. La Ley de Hardy-Weinberg tambin se puede emplear en este caso para los
tres alelos:
p (A) + q (B) + r (0) = 1
y las combinaciones genotpicas pueden calcularse por la siguiente ecuacin:
p2 (AA) + q2 (BB) + 2pq (AB) + 2qr (B0) + 2pr (A0) + r2 (00) = 1
La ley de Hardy-Weinberg se cumplir slo en poblaciones que se encuentren en
equilibrio. Uno de los requisitos para que esto ocurra es que el tamao de la poblacin sea
suficientemente grande. Nosotros vamos a considerar al grupo de prcticas como una poblacin,
y partiendo de los datos fenotpicos que hemos recogido para el grupo sanguneo AB0,
calcularemos las frecuencias allicas suponiendo equilibrio Hardy-Weinberg. Sin embargo, lo ms
probable es que el grupo de prcticas no represente una poblacin en equilibrio, dado su limitado
tamao. Tras calcular las frecuencias allicas, estimaremos las frecuencias genotpicas y
fenotpicas esperadas y cotejaremos esos datos con los obtenidos. Si no concuerdan, se puede
deducir que la poblacin grupo de prcticas no est en equilibrio Hardy-Weinberg. Se
comparar esta situacin con otros datos provenientes de poblaciones de mayor tamao que s
estn en equilibrio.
antgenos
Anticuerpos
presentes en presentados
eritrocitos
en la sangre
genotipos
posibles
n de
estudiantes del
tipo
frecuencia fenotpica
que representa
A
B
AB
O
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Preguntas de la prctica:
1.- Calcular las frecuencias de los alelos A (p), B (q) y 0 (r) empleando la
Ley de Hardy-Weinberg.
2.- Calcular las frecuencias genotpicas y fenotpicas esperadas, y
compararlas con los datos obtenidos.
3.- Discutir si la poblacin est o no en equilibrio H-W, y por qu.
Respuestas:
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