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Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa


Licenciatura en Bioqumica
Laboratorio de Bioqumica

Laboratorio N 3-4______________________________

Separacin de protenas a partir de


electroforesis
SDS-PAGE
y
determinacin de los parmetros
cinticos para la reaccin catalizada por
-galactosidasa

INTRODUCCIN
Las caractersticas tanto fsicas como qumicas de las protenas pueden ser estudiadas a partir
de diferentes mtodos como la electroforesis o la actividad enzimtica. La electroforesis es
una tcnica de dispersin de partculas a partir de su movilidad relativa para cada molcula en
un gel, este medio puede ser de agarosa o acrilamida, al cual se le aplica un campo elctrico
que se encarga de producir la migracin de las molculas en la matriz. En este prctico se
utilizar un gel de acrilamida el cual es un excelente medio de soporte para separaciones de
molculas pequeas, este medio se caracteriza por ser transparente, tener alta elasticidad, su
porosidad puede ser controlada y puede ser compatible con una alta cantidad de compuestos
qumicos. La poliacrilamida es una copolimerizacin de los compuestos, acrilamida y NN`metilen-bis-acrilamida, los cuales determinan el tamao del poro a utilizar dependiendo de la
relacin acrilamida/bis-acrilamida [1]. Observndose que a mayor porcentaje de acrilamida en
funcin de bis-acrilamida el tamao del poro es menor, lo cual determina que la friccin es
mayor y por ende la velocidad de migracin de las molculas es menor. El entrecruzamiento de
las molculas se genera a partir de la formacin de radicales libres, para general este radical
es posible utilizar dos mtodos, a partir de la utilizacin de un iniciador de radicales libres
como el persulfato de amonio (APS), que es agregado con N,N,N`N`-tetrametiletilendiamina
(TEMED) el cual acta como catalizador de la reaccin. Esos dos componentes en presencia
del monmero, el entrecruzador y un buffer apropiado se generan los radicales libres
necesarios para inducir la polimerizacin, a dems de este mtodo es posible utilizar un
mtodo basado en la fotoqumica, en la que se utiliza algn compuesto que sea fotosensible
que genere radicales libres al ser irradiado por luz UV[2]. Entre las diversas tcnicas de
electroforesis en gel de poliacrilamida es posible utilizar un detergente conocido como
Dodecilsulfato de sodio (SDS), esta tcnica electrofortica es conocida como SDS-PAGE, se
basa en la utilizacin de dicho detergente anionico para formar complejos desnaturalizados,
cargador negativamente. Esta unin genera una relacin carga/masa constante para las
distintas protenas, es decir se anula su carga intrnseca, por lo que la separacin en el gel de
electroforesis ser determinado solo por la masa molecular de las especies [3].
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por
enzimas, pudiendo conocer as detalles del mecanismo cataltico de esa enzima, su papel en el
metabolismo y cmo puede ser inhibida su actividad por drogas o venenos o potenciada por
otro tipo de molculas.
Una enzima interacta con su sustrato en el centro cataltico de la enzima que lo reconoce y lo
transforma en producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico.
Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como
es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se
produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la DNA-polimerasa, que es
capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos
estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una
etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante
puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del
sustrato. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas

proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas,
esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente [4].
Principios generales
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma
cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de
catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y
producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto
significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn
ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los
sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de
la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia.La cantidad de
producto formado a partir de una determinada concentracin de sustrato y de enzima vara
con el tiempo. Solamente en los primeros minutos de la reaccin existe una relacin lineal
entre el producto formado y el tiempo. La velocidad de la reaccin calculada a partir de los
datos de esos primeros minutos, es lo que se denomina velocidad inicial (Vo) y se puede medir
por la variacin de la cantidad de sustrato transformado, o la cantidad de producto formado
por unidad de tiempo.
Cuando se miden las velocidades iniciales (Vo) de una reaccin enzimtica con distintas
concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y temperatura y
manteniendo constante la concentracin de enzima [E], se obtiene una curva como se
representa a continuacin:
Figura 1.- Cintica de Michaelis-Menten

La cintica de las reacciones descritas anteriormente fue caracterizada por los investigadores
Michaelis y Menten. La ecuacin de Michaelis-Menten es:

Figura2.- Ecuacin de Michaelis-Menten. La ecuacin es una descripcin cuantitativa de la relacin entre la


velocidad (Vo) de una reaccin catalizada por una enzima, la concentracin de sustrato [S] y dos constantes Vmx y
Km (constante de Michaelis).

Las unidades de Km son, por lo tanto, unidades de concentracin, usualmente molaridad. Km


puede definirse como la [S] a la que la enzima alcanza la mitad de su velocidad mxima o la [S]
a la que la mitad de las molculas de enzima estn formando ES.
La forma de determinar Km por el mtodo grfico definido antes, no es la usada en la prctica;
rara vez se llega a medir Vmx por problemas tales como la solubilidad del sustrato a
concentraciones altas. Se utiliza entonces, la transformacin de la ecuacin de Michaelis-

Menten realizada por Lineweaver-Burk que consisti en tomar la inversa de cada trmino. La
ecuacin queda como:

Figura3.- ecuacin de doble recproco.

La representacin grfica con coordenadas 1/Vo y 1/[S] es una recta. El corte de la recta con el
eje de las ordenadas permite calcular Vmx y el corte con el eje de las abscisas permite
calcular Km[5].

Figura 4.-Grafica de dobles recprocos

La actividad enzimtica puede ser disminuida o eliminada por la accin de ciertas sustancias a
las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimticos. La unin de un inhibidor
puede detener al sustrato de entrar al sitio activo de la enzima y/u obstaculizar que la enzima
catalice su reaccin. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Los inhibidores
irreversibles usualmente reaccionan con la enzima y cambian su estructura qumica. Estos
inhibidores modifican los residuos esenciales de los aminocidos necesitados para la actividad
enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente,
tales como puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y enlaces inicos, y diferentes
tipos de inhibiciones son producidas dependiendo en si el inhibidor se une a la enzima, al
complejo enzima-sustrato o a los dos.
Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican segn el efecto de variar la
concentracin del sustrato de la enzima en el inhibidor.
-

Inhibicin competitiva: el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima
donde el sustrato tambin se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al
sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones
suficientemente altas del sustrato.

Inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que al


sustrato de la enzima. Sin embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del sustrato,
y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede reducir, pero no superar al aumentar las
concentraciones del sustrato.

Inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del


inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato.
Como resultado, el grado de la inhibicin depende solamente de la concentracin del
inhibidor[6].

Objetivos
-

Determinar el tamao molecular de una protena por electroforesis SDS-PAGE.


Determinar los parmetros cinticos para la enzima Determinar los parmetros
cinticos para la enzima -galactosidasa (-gal).

MATERIALES Y MTODOS
Electroforesis en gel SDS-PAGE
Materiales- Mezcla de protenas estndar de peso molecular conocido (BM-1100), 6 mezclas
de protenas, amortiguadoras de corrida, fuente de poder, cmara electrofortica, azules de
Coomasie G-250, placas con gel de poliacrilamida al 12%.
Preparacin gel concentrador- Esta debe poseer una concentracin de 5% acrilamida/bisacrilamida. A la mezcla se le agreg 25L de APS y 2L de TEMED. Finalmente se carg sobre
el gel separador en la cmara de electroforesis.
Preparacin de muestras para anlisis electrofortico- Se prepararon 6 tubos eppendorf con
15L de muestra desconocida a las que se le agreg 15L de buffer con una concentracin al
2X, el cual contiene amortiguador Tris (pH8.3), SDS, 2--mercaptoetanol, glicerol y azul de
bromofenol (5KDa). Luego fueron llevados a un termociclador por 5min a una temperatura de
95C, y finalmente se realiz un spin para homogenizar.
Realizacin de la electroforesis- Se tomaron 20L de muestra tratada y se cargaron en el gel
concentrador, tambin se cargaron 20L de mezcla de protenas estndar en el carril 1, y se
aplic una corriente de corrida de 80V para producir el ingreso de la muestra al gel separador,
y luego se cambi el voltaje aplicado a 150V, hasta que el azul de bromofenol lleg a la base
del aparato de electroforesis. Finalmente se tieron las muestras con Azul de Coomasie G-250.
Anlisis de parmetros cinticos de -gal
Materiales- Amortiguador citrato (pH 6.4), NaOH (0.05M), o-nitrofenil--galactsido (ONFG)
(2.5mM),
o-nitrofenol
(ONF)
(60mM),
-galactosidasa,
Fenil--Dtiogalactopiranosido(PETG)(50mM).
Curva de calibracin- Se realiz una curva de calibracin para el producto de la reaccin
tomando los siguientes volmenes:
Tabla 1.- Volumen utilizado de ONF y de NaOH
Se utilizaron 6 muestras para la realizacin de la curva de calibracin

Tubo
1
2
3
4
5
6

o-nitrofenol 60mM( L)
0
125
250
500
750
1000

NaOH 0.05M (L)


1000
875
750
500
250
0

Luego de tomar los volmenes necesarios se procedi a tomar la absorbancia de la muestra a


420nm, y finalmente se grafic la absorbancia en funcin de la concentracin de ONF

Determinacin parmetros cinticos de -gal y efecto de PETG en la reaccin- Se prepararon


10 mezclas de reaccin las cuales contienen ONFG, Buffer citrato, PETG y enzima en diferentes
concentraciones. A continuacin se presenta una tabla con los volmenes utilizados de cada
componente de la mezcla.
Tabla 2.-Volumenes de ONFG, Buffer, PETG y enzima utilizados
La tabla muestra los diferentes volmenes de las 10 mezclas.

tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

ONFG2.5mM
(L)
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200

Buffer
(L)

citrato PETG 50mM(L)


400
350
300
250
200
365
315
265
215
165

0
0
0
0
0
35
35
35
35
35

Enzima (L)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

Luego de preparar las 10 muestras se incubaron durante 15min a 37C y luego se tomaron
100L de cada muestra y se agregaron a 900L de NaOH 0.05M. Finalmente se tomaron 200L
de la solucin y se midi la absorbancia a 420nm.
RESULTADOS
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Para separar la mezcla de protenas entregadas en los diferentes tubos, se realiz una
electroforesis, donde se obtuvo el siguiente gel:
Figura 5.- Electroforesis en gel de poliacrilamida
al 12%. La figura muestra el gel obtenido luego de
realizar una electroforesis a 150V hasta que el azul
de bromofenol alcanzara la base de la cmara
electrofortica. Las muestras analizadas
corresponden a una mezcla de protenas. El carril
1 corresponde al estndar Winkler, los carriles del
2 al 7 corresponden a las muestras problemas.

Luego de realizar la electroforesis, se procedi a determinar los pesos moleculares de las


protenas ya separadas. Para esto, se midieron las distancias de migracin en el gel de las
bandas de protenas en el estndar (mostrados en Tabla 3) y se graficaron en funcin del
logaritmo de su peso molecular, como se observa en el siguiente grfico:

Log PM

Relacin entre el peso


molecular y la movilidad
relativa
2
1.5
1
0.5
0
0

1
movilidad relativa (mm)

Figura N6: Relacin entre peso molecular y movilidad relativa de protenas. En el grafico se observa la relacin
entre los pesos moleculares de protenas en el estndar en funcin de su peso molecular. Al trazar la recta, se
2
obtiene la ecuacin que se presenta a continuacin: Y = -0,870X + 1,89, con un R = 0,964.
Tabla N 3: Movilidades relativas de protenas estndar Winkler en el gel
La tabla muestra la movilidad relativa en mm de la migracin de las bandas en el estndar y sus respectivos pesos
moleculares. Para B-galactosidasa no se observaron bandas en el gel.

Protena

Peso Molecular (kDa)

Movilidad relativa (mm)

Log Peso molecular

- galactosidasa
BSA
Ovoalbmina
LDH
Endonucleasas de restriccin

116
66,2
45
35
25

0.1587
0.2381
0.3333
0.5873

1,8209
1,6532
1,5441
1,3979

-lactoglobulina
Lisozima

18,4
14,4

0.6825
0.873

1,2648
1,1584

La movilidad relativa (Rf) se calcul aplicando la siguiente formula Rf= Distancia recorrida por
la protena en el gel (mm)/ distancia recorrida por el frente de migracin (mm)
Luego de realizar la grfica con las protenas del estndar, y una vez conocida la ecuacin de la
recta, se procedi a calcular los pesos moleculares de las bandas obtenidas en que van desde
el carril 2 hasta el carril 7. Para esto se midieron las distancias de migracin de las bandas, al
igual que para el estndar, y este valor se extrapol en la ecuacin de la recta, en donde se
obtiene el logaritmo del peso molecular de la protena desconocida, donde luego, es posible
calcular su peso molecular. Estos resultados se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 4.-: Movilidades relativas de las protenas separadas en la electroforesis


La tabla muestra la movilidad relativa de las bandas obtenidas en el gel con su respectivo peso molecular asignado
de acuerdo a la ecuacin de la recta mencionada anteriormente.

Carril
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7

Movilidad relativa (mm)


0.1587
0.2381
0.3175
0.5873
0.7143
0.9206
0.3333
0.5714
0.6984
0.9206
0.1587
0.3175
0.5873
0.7143
0.9365
0.3333
0.5714
0.7302
0.1746
0.3492
0.6508
0.1746
0.7460

Peso molecular asignado (kDa)


56.48
48.18
41.09
23.94
18.56
12.28
39.81
24.71
19.16
12.28
56.48
41.09
23.94
18.56
11.89
39.81
24.71
17.98
54.71
38.57
21.08
54.71
17.42

Curva de calibracin
Al medir la absorbancia de las muestras a 420nm se obtuvieron los siguientes datos,
descontando la absorbancia obtenida en el tubo uno a cada absorbancia obtenida:
Tabla 5.- Datos para curva de calibracin
La concentracin de ONF se consider en mol/mL para comparar con el rango lineal de literatura [7]

Concentracin
(mol/mL)
0.075
0.15
0.3
0.45
0.6

ONF Absorbancia 420nm


0.240
0.428
1.070
1.339
1.665

Luego se grafico la absorbancia obtenida en funcin de la concentracin de ONF

Absorbancia 420nm

Curva de calibracin
2
1.5
1
0.5
0
0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

ONF (mM)

Figura 7.- Curva de calibracin para concentracin. Se consideraron solo el rango de concentracin entre 0.02 a 0.3
mol/mL, ya que en ese rango muestra una linealidad segn bibliografa.

A partir de la curva de calibracin se obtuvo la ecuacin de la recta Y=3.773X-0.081 con un R2=


0.986 utilizando solo los datos correspondientes a las concentraciones 0.075, 0.15 y 0.3 mL.
Determinacin de los parmetros cinticos para -gal y anlisis del efecto de PETG en la
reaccin
A partir de la concentracin de producto formado y la concentracin de sustrato en la muestra
es posible calcular los diferentes parmetros cinticos para -gal. A continuacin se presentan
los datos obtenidos por la reaccin enzimtica:
Tabla 6 Datos obtenidos a partir de la reaccin enzimtica
En la tabla se encuentran las concentraciones de sustrato las absorbancias y las respectivas concentraciones de
producto formado y las velocidades de cada reaccin
[ONFG]mM*

Aborbancia S/[I]

[ONF] mM*

Vo

absorbancia c/[I]

[ONF] mM*

Vo

0.025

0,182

0,697

0,046

0,105

0,495

0,033

0.05

0,313

1,044

0,069

0,283

0,964

0,064

0.075

0,422

1,333

0,088

0,326

1,095

0,073

0.1
0,526
1,609
0,107
*Los datos fueron considerados aplicando ciertas diluciones.

0,395

1,261

0,084

Para el clculo de la concentracin de sustrato y de producto se consideraron las siguientes


diluciones:
1.- Para el sustrato la muestra se encontraba a una concentracin 2.5mM y se tomo para la
primera muestra un volumen de 50L que fueron llevados a un volumen final de 500L
obtenindose una concentracin de 0.25mM, luego se tom 100L de la muestra y se llevaron
a 1000L final obtenindose una concentracin de sustrato final de 0.025mM (mol/mL). As
para cada muestra de sustrato.
2.- Para la concentracin de producto solo se consider la dilucin final, ya que solo se
tomaron 100L de la formacin de producto y se llevo a 1000L obtenindose la
concentracin indicada en la tabla.

A partir de los datos obtenidos se procedi a graficar la velocidad de formacin de producto en


funcin de la concentracin de sustrato.

Figura 8.- grafico de Vo/ [ONFG]. Se observa que la curva para la reaccin sin el inhibidor no alcanza al nivel de
saturacin mientras que la reaccin con inhibidor si la alcanza.

Luego para obtener los valores de Km y Vmax en la reaccin realizar la grafica de LineweaverBurk o de dobles recprocos obtenindose la siguiente grfica:

Grfica de dobles recprocos


35
30

1/Vo

25
20
15

Reaccin sin inhibidor

10

Reaccin con inhibidor

5
-20

0
-10 -5 0

10
20
1/[ONFG]

30

40

50

Figura 9.- Grfica de dobles recproco. A partir de las graficas se obtuvieron las siguientes ecuaciones de la recta. (A)
2
2
reaccin sin inhibidor Y= 0.402X+5.851 con un R =0.997. (B) reaccin con inhibidor Y= 0.615X+5.750 con un R =
0.990.

A partir de la grfica de doble reciproco es posible obtener los valores de Km a partir de la


extrapolacin al corte del eje X es decir cuando el valor de 1/Vo = 0, el valor en el eje X es de
-1/Km, para el caso de la reaccin con inhibidor se tiene que el valor donde corta el eje X se
obtiene -1/Km siendo un coeficiente de correccin al utilizar un inhibidor representado por
=1+ *I+/Ki para reacciones de tipo competitivo. Para el clculo de la Vmax es necesario
conocer el punto donde se corta el eje Y, ya que cuando se tiene que 1/ [ONFG] es igual a 0 el
valor de Y= 1/Vmax. Este valor es aplicado tanto para la reaccin sin inhibidor como la con
inhibidor, para el caso de inhibidores de tipo competitivos.

Los datos obtenidos a partir de los clculos realizados son expuestos en la siguiente tabla:
Tabla 7.- Parmetros cinticos para la reaccin con y sin inhibidor.
En la tabla se presentan los valores obtenidos al calcularlos a partir de la grfica de doble reciprocos.

Tipo de reaccin
Km(mM)
Vmax (min-1)
Sin inhibidor
0.0687
0.1709
Con inhibidor
0.1069*
0.1739
*el dato representa el valor obtenido por Km, ya que la Km en s se mantiene constante.

Ki (mM)
0
0.6295

DISCUSIN
La electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida, comnmente denominada
electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna
una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas.
La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de
muestra pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.
En este caso se realiz una electroforesis en condiciones desnaturantes utilizando SDS , el cual
es un detergente que se une a las cadenas polipeptdicas desnaturalizadas con una relacin de
1.4 g de SDS por g de protena, unindose aproximadamente una molcula de SDS por cada
dos aminocidos de la cadena. Esta unin masiva de molculas de SDS bloquea la carga propia
de la molcula de protena y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su
masa, haciendo que todas las protenas acomplejadas con SDS viajen hacia el nodo. La
separacin de los complejos SDS-protena es proporcional slo a la masa de la protena pues
todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede entonces determinar el peso
molecular aparente de cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de
pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son
funciones lineales del logaritmo de su peso molecular[8].
Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son qumicamente inertes,
propiedades uniformes, estables en un rango amplio de pH , temperatura y fuerza ionica , es
capaz de ser preparado en forma rpida y reproducible , formando geles transparentes con
estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena
visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que
variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao
del poro, siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs acrilamida se use.
De esta forma, el porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de
separacin del gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen (tabla 8). As, la mayora de las protenas se separan
bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para
separar protenas de gran tamao[2].

Tabla N8: Rango de separacin efectivo para geles segn el % de Acrilamida para SDS-PAGE
La tabla muestra los tamaos de protenas que son separadas efectivamente segn el porcentaje de
acrilamida en el gel concentrador.

En el caso de este laboratorio el gel utilizado contena un 12% de acrilamida, que como se
observa en la tabla N8, permite la separacin efectiva de protenas que van desde 14 a
70kDa. El estndar utilizado
(Winkler) contena 7 protenas que van desde los 14,4kDa
(lisozima) hasta 116kDa (-gal), por lo que esta protena no es posible visualizarla en el gel, ya
que el tamao del poro le impide desplazarse en el gel separador, por lo que esta se queda en
el bolsillo. De esta manera se justifica la aparicin de 6 bandas en el carril 1 (que contiene al
estndar). Es posible observar en la tabla N4, que el carril 2,3 y 4 presentan bandas inferiores
a la lisozima, con un peso molecular 12kDa, lo que sugiere la presencia de otra protena ms
pequea que en el estndar no se encuentra, pero que, sin embargo, es posible su
visualizacin, ya que su peso molecular es muy similar. En el carril 2,4 y 6, se observan
tamaos de banda demasiado grandes, lo que podra explicarse porque tal protena se
encuentra en una gran concentracin en esas muestras, adems como es posible observar en
la figura N5 , estas bandas grandes se encuentran todas a la misma distancia.
La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores
experimentales, dentro de los que se encuentran:
- Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel: La movilidad de las protenas
vara entre otras causas porque la viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas (la
distancia recorrida es aproximadamente 20 % mayor en la regin central que es ms caliente).
Este efecto puede atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o manteniendo
temperaturas bajas durante el desarrollo de la electroforesis. La uniformidad de la
temperatura a travs del gel mientras ocurre la corrida electrofortica generalmente elimina el
efecto de la deformacin de las bandas en forma de sonrisa. [9]
- Velocidad de la polimerizacin. Niveles de catalizador
Una polimerizacin muy rpida puede deformar las bandas, porque ocurre una contraccin no
uniforme del gel, en este caso debe reducirse el TEMED y el persulfato de amonio o adicionar
ferricianuro de potasio, con el objetivo de hacer ms lenta esta. El empleo de niveles bajos de
catalizador provoca que la superficie del gel se torne desigual y tienda a romperse con
facilidad, pero el empleo de altas concentraciones provoca que los geles tiendan a cuartearse.
Este problema puede solucionarse en geles de altas concentraciones, al poner una capa de
alcohol isobutlico en lugar de agua. [10]

- Tiempo de corrida
La determinacin del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues corridas muy
cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su correcta separacin,
pero tambin se ha probado que tiempos de corrida cortos minimizan la dispersin de la
muestra y el ensanchamiento de la banda. En este caso, para obtener un gel de mejor calidad
se recomienda, correr el gel a mayor tiempo y a un menor voltaje.
- Preparacin de las muestras
En el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa desnaturalizacin de las protenas,
para evitar la aparicin de bandas fantasmas en la electroforesis (bandas dobles por la
concentracin de -Mercaptoetanol o por el tiempo de incubacin). [11]
- Tincin
Las protenas coloreadas naturales como la mioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C,
pueden ser observadas directamente en los geles, sin embargo la visualizacin de la mayora
de las protenas requiere el uso de colorantes. Los colorantes orgnicos fueron los que se
emplearon primero para teir protenas en los geles (ejemplo de estos bromofenol azul, azul
de Coomassie, etc.). Una rpida tincin y fijacin son esenciales en el caso de las protenas
pequeas para evitar su elucin.
Existen diferentes tipos de tincin, entre ellos la plata que es muy sensible y tiene la
caracterstica de producir generalmente coloraciones de color negro. La tincin con Coomassie
puede emplearse para la determinacin de protenas cuando estas son abundantes, pero no
para la determinacin de pureza de protenas trazas. Esta tincin requiere un medio cido para
la generacin de la atraccin electrosttica entre las molculas del colorante y los grupos
amino de las protenas. La atraccin inica es a travs de las fuerzas de Van Der Walls, que une
a las protenas y al colorante formando un complejo. [12]
En todo ensayo para la caracterizacin de una protena luego de su separacin se realiza
comnmente el anlisis de sus caractersticas cinticas, en las cuales se determina la velocidad
de formacin de producto. Para esto es necesario tomar en consideracin otros mtodos
analticos como el anlisis de absorbancia de analitos en solucin.
La -gal se encarga de hidrolizar los enlaces -galactosidos, esta enzima es capaz de actuar
sobre sustratos sintticos cromognicos, que al ser hidrolizados general un producto
coloreado. El ONFG es un sustrato sinttico para esta enzima que puede ser hidrolizado para
formar ONF el cual en medio alcalino es capaz de tautomerizarse, tomando un color amarillo,
es por esto que en el ensayo es necesario utilizar un medio de NaOH en la medicin de la
absorbancia. La absorbancia a 420nm es directamente proporcional a su concentracin en el
rango 0.02 a 0.3mM [7], es por esto que los puntos obtenidos en la recta mayores a 0.3 fueron
omitidos, ya que la linealidad al considerar dichos puntos disminua de 0.986, que se obtuvo
con los puntos en el rango de linealidad de bibliografa, a 0.973 que se tiene tomando todos
los puntos observados.

Luego de realizar la curva de calibracin se procedi a calcular la velocidad de formacin de


producto en funcin de la concentracin de sustrato, como se observa en la figura 8 la muestra
sigue una linealidad inicial pero no alcanza su punto de saturacin, ya que los valores de Vmax
para la enzima son mucho mayores a las velocidades obtenidas de la enzima a la mayor
concentracin de sustrato considerado, siendo Vmax 0.1709 y la velocidad ms alta de 1.107.
En cuanto a la enzima en presencia de inhibidor se observa que la velocidad de formacin de
producto disminuye en comparacin con la de la enzima sin inhibidor. Como se observa en la
tabla 7 las velocidades mximas para cada reaccin son diferentes pero con una diferencia de
+0.003, por lo que la diferencia puede ser despreciada, considerando que la velocidad mxima
se mantiene constante con la accin del inhibidor, luego al observar los valores de Km se
observa que hay un cambio considerable en los valores, ya que la Km con inhibidor aumenta
por la presencia del factor que considera la concentracin de inhibidor y la constante de
inhibicin, los cuales producen un aumento en el valor de la Km. Segn estos datos es posible
concluir que la inhibicin que ejerce el PETG sobre la accin de -gal es de tipo competitivo, en
el cual el inhibidor acta directamente sobre el sitio activo de la enzima compitiendo con el
sustrato por dicho sitio de fijacin enzimtica, formando un nuevo complejo enzima-inhibidor
que se encuentra en equilibrio con sus especies por separado. Por consiguiente un inhibidor
de tipo competitivo acta reduciendo la concentracin de enzima libre disponible para la
fijacin de sustrato. As el inhibidor no afecta el nmero de recambio de la enzima, sino que la
presencia del inhibidor produce un efecto de dilucin de la concentracin de sustrato, o hace
que el valor de Km parezca mayor de lo real [6], lo cual explica la figura 8 en la que se observa
un aumento en la Km con el inhibidor.
Es importante controlar ciertos aspectos en una reaccin enzimticas para poder sacar
resultados concluyentes sobre los parmetros cinticos de las enzimas, entre estos aspectos
est el pH, ya que las protenas solo son activas en un estrecho intervalo de de pH siendo para
la -gal su pH optimo de 6[13], es por esto que se trabajo a un pH 6.4 aproximadamente
conferido por el buffer citrato. Otro parmetro a considerar debe ser la temperatura, ya que a
mayor temperatura mayor velocidad de reaccin, pero hasta cierto punto en el cual se
desnatura la protena [5], es por esto que nosotros solo consideramos la temperatura corporal
como temperatura optima de accin. Y finalmente para obtener resultados concluyentes de la
accin de inhibidor sobre la reaccin enzimtica es necesario realizar varios ensayos con
diferentes concentraciones de inhibidor y con sus respectivos duplicados o triplicados para
aumentar la precisin del anlisis.
CONCLUSIONES

La electroforesis es un mtodo analtico que permite separar protenas y otro tipo de


molculas adecuadamente, y permite calcular el peso molecular de protenas a partir
de la utilizacin de un estndar.
A partir de un anlisis cintico a la -gal se obtuvo que la Km es de 0.0687mM y la
velocidad mxima es de 0.1709 min-1, y que la accin inhibitoria de PEGT es de tipo
competitivo por los valores de Km y Vmax obtenidos, que fueron de 0.1069 y 0.1739
respectivamente.

REFERENCIAS
[1] Westermeier R (2001): Electrophoresis in Practise, 3 ed. WILEY-VCH Verlag GmbH
[2] Switzer R, 1999, Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods,
Freeman and company, 61-77
[3] Boyer R.,2000, Modern Experimental Biochemistry, Benjamin Cummings, San
Francisco,113-120
[4] F. Agius, O. Borsani, P. Daz, S. Gonnet et al. Bioqumica. Facultad de Agronoma., Enzimas,
http://www.fagro.edu.uy/~bioquimica/docencia/basico/enzimas.pdf, 23/05/2010
[5]Lehninger D., 2009, Principios de bioqumica, 5 edicin, editorial OMEGA, 194-200
[6] Voet D. Voeth J., 2005, Biochemistry, Editorial OMEGA, S.A. pag 367-373.
[7] Maisey K., 2010, Trabajos prcticos bioqumica, Determinacion de las propiedades cinticas
de la Enzima -galactosidasa, Santiago.
[8] http://www.med.ufl.edu/biochem/bch6206/DETERGENTS.pdf
[9] Da Woon J, Gyoung Hoon T, Jin Wook L, et al., Detection of proteins in poliacrilamida gels
using eriochrome black T rhodamina B. Anal. Biochem.1998; 263:118-120.
[10] Guo Y, Li X, Fang Y. The effects of electroendosmosis in agarose electrophoresis.
Electrophoresis. 1998; 19 (8-9):1311-3.
[11] Schgger H, Von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate- Polyacrylamide gel
electrophoresis for separation of proteins in the range from 1 to 100kDa. Analytical
Biochemistry 1987; 166, 368-79.
[12] http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm
[13] Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, et al., September 1995, A biomarker that identifies
senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (20):
93637