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Nombre: Kevin Mantuano Ortega

Curso: 2/3
Links: http://perso.wanadoo.es/sergioram1/microscopios.htm#MICROSCOPIO_OPTICO
http://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm
http://www.upv.es/entidades/SME/info/753120normalc.html
EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto
pequeo. Es el instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los
microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede
hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a
cientos de miles de veces el tamao original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. En el
microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes
que manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio
electrnico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magntico.
MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios de este tipo generalmente producen un
aumento de 1000 veces el tamao original. El lmite lo
tienen en unas 2000 veces.
Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el
objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe
enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza el
condensador. Elevando o bajando el condensador puede
alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posicin
que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada
cerca del objeto que se observa. El aumento primario del
objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se
transmite al ocular, donde se realiza el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en
microbiologa estn equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de
inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una pieza que se llama revolver que
puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.
La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento
total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su
ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente
mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este ltimo, llamado
microscopio simple, se usa principalmente como lupas y cristales de aumento.

Adems del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder


resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy
cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto.
Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver
pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la
longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como
apertura numrica. Como los microscopios pticos utilizan luz visible, la longitud de
onda est fijada y es por lo que la resolucin de un objeto es funcin de la apertura
numrica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo.

0.5 l
d = ----------N sen a
d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ngulo de la lente objetivo; N:
ndice de refraccin del medio; N sen a: apertura numrica.
Un factor que afecta a la apertura numrica, adems de la construccin de la lente, es
el medio a travs del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo est separado del
objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 1,0; para conseguir
aperturas numricas mayores que sta, el objetivo debe estar inmerso en un lquido de
mayor ndice de refraccin que el aire. A estos lquidos se les denomina aceites de
inmersin que se utilizan con los objetivos de inmersin obteniendo una apertura
numrica entre 1,2 y 1,4. Aun as, al utilizarse la luz visible (longitud de onda) estos
microscopios llegan a tener un poder de resolucin de aproximadamente 0,25 m, lo
que significa que las partculas con un tamao ms pequeo de 0,25 m no pueden
distinguirse unas de otras.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les
permite tener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos
de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible
(426 - 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrnico resolver
objetos separados por una distancia de 0,003 m, comparado con los 0,25 m de uno
ptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un milln de veces.
A causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy
delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada
directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrnico se
necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero
deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Despus de la deshidratacin, la
muestra se incluye en una resina y es aqu donde se realizan cortes finos con un
ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula
bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si slo tiene que
observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que
se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro).

El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por


el metal pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. A la
primera tcnica se la denomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la
segunda Microscopa Electrnica de Barrido (MEB).
El microscopio electrnico de barrido (SEM) es un instrumento capaz de ofrecer un
variado rango de informaciones procedentes de la superficie de la muestra. Su
funcionamiento se basa en barrer un haz de electrones sobre un rea del tamao que
deseemos (aumentos) mientras en un monitor se visualiza la informacin que
hayamos seleccionado en funcin de los detectores que hayan disponibles. En el
Servicio de Microscopa de la U.P.V. existen los siguientes:
Detector de electrones secundarios (SE): es el que ofrece la tpica imagen en blanco y
negro de la topografa de la superficie examinada. Es la seal ms adecuada para la
observacin de la muestra por ser la de mayor resolucin.
Detector de electrones retrodispersados (BSE): tambin ofrece una imagen de
superficie aunque de menor resolucin. Su ventaja consiste en que es sensible a las
variaciones en el nmero atmico de los elementos presentes en la superficie. Si
tenemos una superficie totalmente lisa observaremos distintos tonos de gris en funcin
de que existan varias fases con distintos elementos.
Detector de rayos X (EDS): es el que recibe los rayos X procedentes de cada uno de
los puntos de la superficie sobre los que pasa el haz de electrones. Como la energa
de cada rayo X es caracterstica de cada elemento, podemos obtener informacin
analtica cualitativa y cuantitativa de reas del tamao que deseemos de la superficie.
Por ello se conoce esta tcnica como Microanlisis por EDS.
Detector de rayos X (WDS): similar al anterior, pero en vez de recibir y procesar la
energa de todos los rayos X a la vez, nicamente se mide la seal que genera un solo
elemento. Esto hace que esta tcnica, aunque ms lenta, sea mucho ms sensible y
precisa que la de EDS. Realmente son complementarias, pues el EDS ofrece una
buena informacin de todos los elementos presentes en la superficie de la muestra y el
WDS es capaz de resolver los picos de elementos cuyas energas de emisin estn
muy cercanas, as como detectar concentraciones mucho ms pequeas de cualquier
elemento y, sobre todo, de los ligeros.
Detector de electrones retrodispersados difractados (BSED): en este caso slo se
reciben aquellos electrones difractados por la superficie de la muestra que cumplen la
ley de Bragg en el punto que son generados, es decir, se trata de una seal que nos
aporta informacin de la estructura cristalina de la muestra. Si conocemos previamente
la o las fases cristalinas presentes en nuestra muestra, el sistema es capaz de
procesar la seal que recibe en forma de lneas de Kikuchi y ofrecer una variada
informacin cristalogrfica: orientacin de granos, orientaciones relativas entre ellos,
textura, identificacin de fases, evaluacin de tensin, fronteras de grano, tamao de
grano.

Microscopio electrnico de transmisin (TEM)


Los microscopios electrnicos ms sencillos constan
de dos lentes formadoras de la imagen de forma muy
parecida a los microscopios pticos convencionales.
La iluminacin proviene de un can de electrones
emitidos por un filamento de W o LaB6. Los electrones
son acelerados al aplicar un potencial negativo (100
kV - 1000 kV) y focalizados mediante dos lentes
condensadoras sobre una muestra delgada,
transparente a los electrones.
Despus de pasar a travs de la muestra los
electrones son recogidos y focalizados por la lente
objetivo dentro de una imagen intermedia ampliada.
La imagen es ampliada an ms gracias a las lentes
proyectoras, las cuales controlan la ampliacin de la imagen en la pantalla
fluorescente. La imagen final se proyecta sobre una pantalla fluorescente o una
pelcula fotogrfica.
Un TEM de dos lentes puede llegar a aumentar la imagen alrededor de 1000 veces. El
poder de resolucin podra llegar hasta 5 nm siempre y cuando se consiguiera
aumentos de 50.000 lo que es posible utilizando un vidrio de aumento sobre la
imagen fluorescente en el microscopio, o un incremento fotogrfico de la imagen
registrada en la pelcula.
Los microscopios de gran resolucin (tres lentes generadoras de imagen) son capaces
de ampliar la imagen hasta 500.000 veces y tienen poderes de resolucin de unas
fracciones de nm. Normalmente poseen aumentos de entre 1000 - 200.000 de
2500 - 500.000.
Modos de formacin de la imagen: existen diferentes modos de formacin de la
imagen en un microscopio de transmisin: si la imagen se forma a partir del haz
transmitido, que no ha sufrido dispersin, entonces la imagen del objeto es oscura
sobre un fondo brillante. Si, por el contrario, se utilizan los electrones dispersados en
este caso la imagen aparece brillante sobre un fondo oscuro. Por ello estas dos
tcnicas se denominan formacin de imagen en campo claro y en campo oscuro
respectivamente, la primera es la ms utilizada.
Por otra parte con este microscopio se puede obtener un diagrama de difraccin de la
muestra, lo que nos aporta una valiosa informacin sobre la estructura cristalina de la
misma. Esto es posible si hacemos incidir el haz de electrones sobre un cristal con un
ngulo capaz de satisfacer la ley de Bragg para una determinada distancia entre
planos atmicos dhkl. Ya que la longitud de onda de los electrones es muy pequea
ese ngulo tambin lo es por lo que el haz debe incidir prcticamente paralelo a los
planos reticulares. El diagrama de difraccin est formado por los puntos de corte de
los haces difractados y transmitido con el plano de la pantalla. Representa, por tanto,
la seccin de la red recproca del cristal en el plano normal al haz de electrones.

La posibilidad de combinar la difraccin de electrones con los distintos modos de


formacin de la imagen hace del microscopio de transmisin una de la mejores
herramientas en el estudio de la red cristalina y sus defectos. Se utiliza
fundamentalmente en dos campos: el de las Ciencias de Materiales en el que analizan
semiconductores, metales, aleaciones, aislantes, cermicas, etc. y en el campo de la
Biologa en el que se estudian bacterias, virus, macromolculas, tejidos, etc.
MICROSCOPIA OPTICA
Adems del microscopio de campo claro existen otros microscopios pticos como son
el de campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases.
Microscopio de campo claro: usa como fuente de luz directa bien una bombilla bien la
luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes es difcil distinguirlos con
este tipo de microscopa y es por lo que se suelen teir.
Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio ptico equipado con un
condensador y objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra
frente a un fondo oscuro. Este mtodo se utiliza para visualizar microorganismos vivos
sin teir.
Microscopio de fluorescencia: la muestra se tie con una sustancia fluorescente que
absorbe la energa de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de
ondas ms largas (verde). Se utiliza en inmunofluorescencia, tcnica en la cual una
sustancia fluorescente se une a un anticuerpo especfico de ciertos microorganismos.
Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo emite
fluorescencia y se puede identificar. Esta tcnica se usa en clnica.
Microscopio de contraste de fases: es un microscopio ptico modificado que permite
contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un
objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas
a travs de las distintas partes de una clula. El resultado es una imagen con
diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este mtodo, el material denso aparece
brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al H2O
(citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin
necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

Tamao celular

Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de
pequeo tamao por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los
microscopios para su visualizacin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano
es de 0.2mm (200 m), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es
de dos lneas separadas 1mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia,
veremos una sola lnea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolucin.
La invencin del microscopio en el siglo XVII posibilit la serie de descubrimientos
posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio ptico
simple, examin un corte de corteza, encontr que esta estaba compuesta por una
masa de diminutas cmaras, que llam clulas, en realidad slo vi las paredes
celulares, ya que este tejido est muerto a la madurez y las clulas ya no tienen
contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporneos observaron clulas
vivas.