UNIVERSIDAD LAICA ELOY ALFARO DE MANABI

ESCUELA DE INGENIERIA INDUSTRIAL

CENTRO DE SERVICIOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

LABORATORIO
CESECCA

PROCEDIMIENTO PEE/CESECCA/MI/19
ENSAYO DE RECUENTO DE AEROBIOS TOTALES
Edicin N 1
Fecha de emisin: Enero 2007

COPIA CONTROLADA N:

Fecha:

...../...../.....

ASIGNADA A:
Elaborado por:
Analista Blog. Gavrik Larrea
Revisado por:
Jefe Tcnico Dra. Norma Santamara
Aprobado por:
Direccin General Ing. Leonor Vizuete

DIFUNDIDO A (Firma, fecha)

PG0102-01

Firma.

Fecha:

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PROCEDIMIENTO ESPECIFICO DE ENSAYO
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EDICIN

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FECHA

HOJAS AFECTADAS

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CAUSA

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INDICE
1.

OBJETO

2.

ALCANCE

3.

REFERENCIA

3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION

3.2. DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE
4.

GENERAL

4.1. PRINCIPIO
4.2. DEFINICIONES
5.

DESCRIPCION

5.1. EQUIPO Y MATERIALES

5.1.1. Equipos
5.1.2. Materiales
5.1.3. Reactivos
5.2. PREPARACIN
5.2.1. Muestra
5.2.1.1. Tipos de muestras.
5.2.2. Preparacin de soluciones
5.2.3. Preparacin de equipos
5.3. PROCEDIMIENTO
5.4. TRATAMIENTO DE RESULTADOS
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD
5.6. PUNTOS CRITICOS
5.7. CONTROL DE CALIDAD
5.7.1. Blanco de reactivos
5.7.2. Exactitud
5.7.3. Repetibilidad
5.7.4. Intercomparacin
5.8. CRITERIOS DE ACEPTACION
6.

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ANEXOS

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1. OBJETO
Describir la metodologa a seguir para el recuento de aerobios totales, as como las medidas
necesarias de seguridad y de calidad.
2. ALCANCE
Este Procedimiento es de aplicacin al ensayo de aerobios totales realizados a todos los alimentos
con excepcin de los productos fermentados o madurados tales como yogurt, ciertos tipos de
embutidos y quesos.
3. REFERENCIA
3.1.

DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION

PG/CESECCA/01 Procedimiento para la elaboracin de documentos.

Bacteriological Analytical Manual. Food and Drug Administration (FDA) 8. Edicin (1995).
3.2.

DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE

PE/MI/0201 Formato Primario.

MC2003 Orden de anlisis.
MC2203 Informe parcial de Ensayos.
PU/MI/0301 - Registro de esterilizacin.
Registro de control de ambiente.
4. GENERAL
4.1.

PRINCIPIO

El nmero de microorganismos aerobios encontrados en alimentos es uno de los indicadores

microbiolgicos de calidad ms utilizado. Los resultados de este anlisis permitiran:

Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin.

Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de los alimentos.
Verificar condiciones de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos.
Indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos.

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4.2.

DEFINICIONES

C: grado Celsius.
%: por ciento.
cm2: centmetro cuadrado.
cm3: centmetro cbico.
l: litro.
5. DESCRIPCION
5.1.

EQUIPO Y MATERIALES

5.1.1. Equipos

Autoclave MI-EI/09.
Balanza semi-analtica MI-EI/15.
Bao de agua o bao mara MI-EI/18.
Contador de colonias MI-EI/28.
Estufa MI-EI/35.
Incubadora bacteriolgica regulada a 37C 1C MI-EI/47.
Microondas MI-EI/121.
Plato calentador/agitador magntico MI-EI/59.
Refrigeradora MI-EI/

5.1.2. Materiales

Abrelatas.
Algodn.
Bandejas plsticas rectangulares.
Botella de vidrio 1 l.
Cuchillo de acero inoxidable.
Encendedor.
Magneto.
Matraz erlenmeyer de vidrio de 1000 cm3 MI-MV/16.
Matraz erlenmeyer de vidrio de 500 cm3 MI-MV/13.
Matraz erlenmeyer de vidrio de 250 cm3 MI-MV/09.
Esptula de acero inoxidable.
Fundas estriles.
Gasa.

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Hilo.
Lpiz graso.
Mechero bunsen.
Papel toalla absorbente.
Papel kraf.
Piseta de plstico 500 cm3.
Placas petri de vidrio de 90 - 100 mm de dimetro.
Pipetas de vidrio de 10 cm3 graduadas en 1 cm3 tipo A MI-MV/
Recipiente plstico.
Tijera de acero inoxidable.
Vaso de precipitacin de vidrio de 600ml MI-MV/114.

5.1.3. Reactivos

5.2.

Agar estndar para Recuento en Placa (Plate Count Agar) MI-RE/81.

Agua de peptona tamponada 0,1% MI-RE/54.
Agua destilada.
Alcohol etlico potable al 80% MI-RE/56.
Cloro activo 10%.
Germidal.
PREPARACIN.

5.2.1. Muestra.
Todas las muestras del laboratorio CESECCA tienen una codificacin que las identifica, antes,
durante y despus del ensayo.
5.2.1.1. Tipos de muestras.
Productos frescos, congelados y precocidos: Desinfectar con alcohol potable al 80% todo el
empaque de la muestra. Una vez recibida la muestra se debe realizar el anlisis lo ms pronto
posible; en el caso de que se tenga que postergar el anlisis, se debe seguir el siguiente
procedimiento: las muestras de producto congelado mantenerlas a -18 C, entre 0 y 4 C los
alimentos perecibles no congelados y por un periodo no superior a 36 horas a temperatura ambiente
las muestras no perecibles (conservas o alimentos de baja humedad). Las muestras sern trabajadas
durante todo el proceso cerca del mechero bunsen encendido y con el aire acondicionado apagado.
Abrir el empaque de la muestra con una tijera de acero inoxidable previamente desinfectada con
alcohol al 80%. Pesar 30 gramos de la muestra en una bolsa estril codificada colocada en un vaso
de precipitacin que previamente se ha tarado; cortar el producto con un cuchillo de acero
inoxidable desinfectado y flameado previamente con alcohol al 80%.
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Aadir a la bolsa estril con la muestra, 270 cm 3 de agua de peptona tamponada 0,1%; con lo que se
obtiene la dilucin 101. Homogenizar la muestra con el diluyente manualmente.
En el caso de que se conozca que la muestra est muy contaminada por aerobios se debe diluir 1
cm3 de la dilucin anterior (dilucin 10 1) a un tubo que contenga 9 cm 3 de agua de peptona
tamponada al 0,1% para obtener la dilucin 102 y as sucesivamente obtenindose las diluciones
necesarias. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener la funda
estril en refrigeracin.
Conservas en lata: Desinfectar la lata con alcohol etlico potable al 80%. Abrir las conservas
completamente con un abrelatas seco y desinfectado en alcohol al 80%. Pesar 30 gramos de muestra
del centro de la conserva en una bolsa estril codificada colocada en un vaso de precipitacin que
previamente se ha tarado; tomar el producto con la esptula desinfectada y flameada previamente
con alcohol al 80%.
Aadir a la bolsa estril con la muestra 270 cm 3 de agua de peptona tamponada 0,1%, con lo que se
obtiene la dilucin 101. Cerrar hermticamente la funda estril. Homogenizar la muestra con el
diluyente manualmente. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener
la funda estril en refrigeracin.
Conservas en envase de vidrio: Desinfectar el envase con alcohol etlico potable al 80%. Pesar 30
gramos de muestra del centro de la conserva en una bolsa estril codificada colocada en un vaso de
precipitacin que previamente se ha tarado; tomar el producto con la esptula desinfectada y
flameada previamente con alcohol al 80%.
Aadir a la bolsa estril con la muestra 270 cm 3 de agua de peptona tamponada 0,1%, con lo que se
obtiene la dilucin 101. Cerrar hermticamente la funda estril. Homogenizar la muestra con el
diluyente manualmente. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener
la funda estril en refrigeracin.
Conservas en pouch: Desinfectar con alcohol potable al 80% todo el empaque de la muestra. Abrir
el empaque de la muestra con una tijera de acero inoxidable previamente desinfectada con alcohol
al 80%. Pesar 30 gramos de la muestra en una bolsa estril codificada colocada en un vaso de
precipitacin que previamente se ha tarado; cortar el producto con un cuchillo de acero inoxidable
desinfectado y flameado previamente con alcohol al 80%.
Aadir a la bolsa estril con la muestra, 270 cm 3 de agua de peptona tamponada 0,1%; con lo que se
obtiene la dilucin 101. Homogenizar la muestra con el diluyente manualmente. En el caso de que
no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener la funda estril en refrigeracin.
5.2.2.

Preparacin de soluciones.

Agua de peptona tamponada 0,1%.

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Pesar 1 gramo de agua de peptona tamponada en una botella de vidrio de 1l enjuagada

previamente con agua destilada.
Aadir agua destilada hasta completar 1000 cm3.
Cerrar bien y agitar manualmente hasta disolver.
Girar la tapa de la botella hacia la izquierda aproximadamente.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 120C con 18 psi.
Enfriar a temperatura ambiente.
Mantener en refrigeracin.

Agar estndar para Recuento en Placa (Plate Count Agar).

Pesar 18 gramos en un matraz erlenmeyer de 1000 cm3.

Aadir 800 cm3 de agua destilada.
Colocar en el plato caliente a la mxima temperatura y agitar totalmente, hasta llegar a
ebullicin.
Transferir el agar a matraces identificados con la letra P de 500 cm 3 o 250 cm3 para facilitar su
manejo posterior, colocndoles tapones de gasa con algodn y una cubierta superior de papel
kraf amarrada con hilo.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 120C con 18 psi.
Enfriar los matraces al ambiente.
Mantener el agar en refrigeracin.

Germidal (clorhexidina + cetrimide) al 10%.

Colocar 5 cm3 de Germidal en una piseta de 500 cm3.

Completar el volumen de 500 cm3 con agua destilada.

5.2.3. Preparacin de equipos

Autoclave:

Verificar que el nivel interno del agua se encuentre a la altura de la base metlica interna del
equipo procurando que el nivel de agua no sobrepase la superficie de la misma. Utilizar para
este propsito agua destilada.
Verificar que el nivel de agua de la botella externa no sobrepase la marca exterior que seala el
equipo.
Introducir los medios de cultivo o agares en las canastillas del equipo.
Colocar dos tiras de esterilizacin cada una dentro de un tubo de ensayo con tapa rosca en las
dos canastillas del autoclave para verificar el funcionamiento del equipo.
Cerrar a presin.
Encender con el interruptor ubicado en la parte izquierda inferior del equipo.

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Asegurarse que el dial indique una temperatura de 121C y tiempo de 15 minutos y presionar
ENTER.
Apagar cuando el equipo indique END en el dial o cuando la presin interna sea 0 psi.
Abrir el autoclave y sacar las canastillas.
Cerrar bien las tapas de los recipientes.
Enfriar los medios a temperatura ambiente.
Retornar las canastillas al equipo y cerrar.

Balanza semi-analtica:

Encender la balanza y esperar a que se estabilice.

Verificar que se encuentre nivelada.

Bao de agua:

Verificar que el nivel de agua destilada se encuentre por encima de la marca superior interna del
equipo.
Encender el equipo.
Colocar a la temperatura requerida.

Contador de colonias:

Encender.
Verificar que la luz del equipo est funcionando correctamente.

Estufa:

Encender la estufa.
Colocar la temperatura requerida.
Una vez alcanzada la temperatura, colocar el tiempo de utilizacin.

Incubadora bacteriolgica:

Mantener regulada la incubadora bacteriolgica a 37 1C.

Abrir las puertas de la incubadora nicamente para ingresar o retirar materiales.

Microondas:

Colocar el tiempo y la potencia de fundicin.

Proceder a fundir.

Plato calentador/agitador magntico:

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Encender el plato.
Colocar la temperatura y las revoluciones requeridas.

Calibracin y verificacin:

Balanza semi-analtica segn procedimiento de verificacin y calibracin.

5.3.

PROCEDIMIENTO
Fundir el agar en el microondas con una potencia del 50%. El tiempo de fundicin depender
del volumen de agar. Mantener el agar totalmente fundido en bao de agua a 60C.
Sembrar 1 cm3 de cada dilucin en placas petri estriles previamente identificadas.
Verter en cada placa petri aproximadamente 15 cm3 de agar que se encuentre aproximadamente
a 45C verificando esta temperatura manualmente.
Mezclar el inoculo con el medio fundido. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin es
la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una direccin, hacerla girar
5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivn en una direccin
que forme ngulo recto, hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las manecillas del reloj.
Una vez solidificado el agar, invertir las placas rpidamente, para prevenir el crecimiento de
colonias invasivas por acumulacin de humedad. Incubar a 37 C 1C durante 48 2 horas
colocando las placas invertidas.

5.3.1. Recuento de colonias y registro

Luego de cumplir el perodo de incubacin realizar la lectura de las placas, considerando lo
siguiente:

El contaje de las colonias se realiza siempre en el rea de lavado.

Realizar el recuento utilizando un contador de colonias de campo oscuro.
Las colonias dudosas, examinarlas con lupa de mayor aumento para diferenciarlas de materias
extraas.
Anotar la dilucin usada y el nmero de colonias contadas en cada placa.
Para el reporte del recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:
5.3.1.1.

Placas normales (25 - 250 colonias):

Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo.

Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamao muy pequeo.

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Anotar el nmero de colonias contadas en cada placa de cada una de las diluciones.

5.3.1.2.

Casos especiales

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera:
a. Placas sobrepobladas (ms de 250 colonias):

Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC)
cuando se dispone de placas normales en otras diluciones.
Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en sectores
de la placa si su distribucin es homognea y calcular el recuento estimado en placa ( RPES )
por estar fuera de los lmites 25 y 250.
Si hay menos de 10 colonias por cm, contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6
cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ngulo
recto. Contar cada cuadrado slo una vez.
Si hay ms de 10 colonias por cm contar las colonias en cuatro cuadrados. En ambos casos,
multiplicar el nmero promedio de las colonias contadas por cm por el rea de la placa usada,
para estimar el nmero de colonias por placa.
Si hay ms de 100 colonias por cm, registrar como >100 col / cm.
b. Placas con menos de 25 colonias ( < 25 colonias )

Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, proceder como en el
punto 1.
c. Placas sin desarrollo de colonias

Cuando ninguna de las placas presenta desarrollo o crecimiento de colonias se registran sin
desarrollo.
d. Crecimiento invasivo

Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:

El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegracin de un
grupo de bacterias, cuando la placa petri es rotada para mezclar el agar con la alcuota analizada.
Si solamente existe una cadena, contar como una colonia. Si una o ms cadenas parecieran
originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia.
El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una pelcula de agua entre el agar
y el fondo de la placa petri.

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El tercer tipo es la que se forma en una pelcula de agua en el costado o en la superficie del agar.
Estos dos ltimos tipos revelan una acumulacin de humedad en el punto en el cual se origina el
crecimiento invasivo.

Cuando la alcuota de siembra es uniformemente distribuida en el medio, las bacterias raramente

desarrollan colonias invasivas.
Si en las placas seleccionadas se presenta invasin, realizar recuento de colonias solamente:

5.4.

Si el rea invadida no excede la mitad de la placa.

Si las colonias estn bien distribuidas fuera del rea invadida.
Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio.
TRATAMIENTO DE RESULTADOS

Los datos obtenidos de la lectura son registrados en el formato primario PE/MI/0201 y revisados
por Jefe Tcnico del Laboratorio. Luego son trascritos al formato de informe parcial de ensayos
MC2204.
5.5.

MEDIDAS DE SEGURIDAD
Realizar un control de ambiente diario de aerobios totales y hongos y levaduras en las reas de
preparacin de muestras y siembra.
Utilizar mascarilla con filtros y gafas protectoras durante la preparacin del agar.
Mantener el rea de trabajo limpia y en el caso de ser necesario desinfectada con alcohol al
80%.
Limpiar semanalmente los mesones, superficies y equipos con germidal (clorhexidina +
cetrimide) al 10%. La solucin preparada solo tiene validez por 7 das.
Mezclar cuidadosamente el agar con el inoculo.
No sobrecalentar el agar en el microondas y vigilar el agar mientras se est fundiendo.

Limpieza de las cajas petri.

Colocar el agar slido en una funda plstica con la ayuda de una esptula.
Aadir suficiente cloro disuelto con agua a la funda procurando que el agar se moje con esta
solucin y cerrar bien la funda para luego desecharla.
Las placas son sumergidas en un recipiente plstico que contiene agua, jabn neutro y cloro
hasta el siguiente da.
Al siguiente da, lavar las placas con jabn neutro. Luego de quitar completamente el jabn de
las placas con agua potable, sumergirlas en agua destilada.
Colocar las placas en la estufa a 120C hasta secarlas por completo.

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Limpieza de las pipetas.

Sumergir las pipetas en una solucin de agua jabonosa hasta el siguiente da.
Enjuagar las pipetas con agua potable. Sumergir las pipetas manchadas en una probeta con
acetona por un momento para luego ser lavadas con jabn neutro y agua.
Sumergir las pipetas en agua destilada.
Colocar las pipetas en la estufa a 120C hasta secarlas por completo.
Limpieza de los matraces.

Lavar los matraces con jabn neutro y agua.

Luego de quitar completamente el jabn de las placas con agua potable, sumergir los matraces
en agua destilada.
Secar en la estufa a 120C.
Esterilizacin del material.

Colocar en cada una de las pipetas limpias y secas un tapn de algodn.

Envolver las pipetas en un paquete de papel kraf e hilo en el cual se especifica el nmero de
pipetas de cada paquete.
Envolver las cajas petri completamente limpias y secas en un paquete de papel kraf e hilo.
Esterilizar en la estufa por 2 horas a 180C 2C.

5.6.

PUNTOS CRITICOS
Cumplir el tiempo requerido para la esterilizacin e incubacin.
Trabajar con material limpio y cuando sea necesario material estril.

5.7. CONTROL DE CALIDAD

5.7.1. Blanco de reactivos
Se elabora un placa petri sin inoculo.
5.7.2. Exactitud
5.7.3. Repetibilidad
Se repetir una muestra cada da.
5.7.4. Intercomparacin

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Los informes de intercomparacin deben ser analizados y revisados por el Jefe Tcnico y aprobados
por el mismo. Cuando los resultados no cumplan con los criterios esperados debern tratarse como
un trabajo no conforme y cuando este haya sido levantado buscar la posibilidad de volver a
participar en otro ensayo intercomparacin.
5.8. CRITERIOS DE ACEPTACION
6. ANEXOS

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