TEMA 4.

TCNICAS ESENCIALMENTE MICROSCPICAS QUE SE EMPLEAN PARA EL ESTUDIO

DE CLULAS.

La primera parte de la historia de la citologa y la histologa se desarrolla en paralelo a la del
microscopio. Es as porque evidentemente los microscopios permiten el estudio de las clulas. En
general el examen microscpico de clulas y tejidos supone, como condicin indispensable, que la
muestra que se pretende estudiar sea translcida y por tanto de espesor muy fino. En la mayora de los
casos, la observacin microscpica se realiza sobre clulas muertas. Solo en determinadas
circunstancias pueden observarse microscpicamente clulas vivas.

Lo indicado comienza con: La primera parte de la historia de la citologa y la histologa Procede
preguntarse: y en nuestros das?, ya no se utilizan o se utilizan menos los microscopios?. los
microscopios son lo antiguo y las PCR y los cultivos celulares por ejemplo- son lo moderno?, es
obsoleta la Citologa en la que quizs prima el estudio estructural con clulas muertas, frente a la
Biologa celular en la que quizs prima el estudio con clulas vivas?, realizar observaciones al
microscopio se puede reemplazar por la observacin de imgenes a travs del ordenador?, etc.
Probablemente, las respuestas a las preguntas realizadas y a otras similares que se pudieran plantear,
dara lugar a largas conversaciones. Se puede afirmar que todo lo que se utilice para incrementar el
conocimiento sobre las clulas (en sentido amplio) es vlido per se. Entre esas herramientas estn los
microscopios.

En los microscopios hay que atender a:
- los aumentos: diferencia en tamao entre el objeto observado y la imagen obtenida;
- el poder de resolucin: capacidad para distinguir la distancia mnima entre dos puntos a la
cual se ven separados (y no como un nico punto); el poder de resolucin depende de la
calidad de la lentes y de la longitud de onda: a menor longitud de onda, mayor poder de
resolucin.

Diferentes microscopios.
Dentro del repaso de los diferentes microscopios, en primer lugar hay que contar con el microscopio
simple o lupa o microscopio estereoscpico. Son microscopios que se suelen usar como auxiliares en la
observacin o en la diseccin de piezas anatmicas pequeas.

El microscopio ptico de campo claro o microscopio fotnico es esencialmente un tubo con lentes de
vidrio en cada extremo. El objetivo en el extremo ms prximo a la muestra, y el ocular (por donde se
observa) en el otro extremo. La luz visible atraviesa la estructura a estudiar que debe ser lo
suficientemente fina y que generalmente se tie.

Las tinciones de rutina empleadas para el estudio de clulas (de animales y plantas), utilizan
generalmente dos colorantes para teir distintas estructuras:
- en las muestras animales, un colorante se emplea para teir ncleos y otro para teir
citoplasmas;
- en las muestras de plantas, un colorante se emplea para teir paredes primarias y otro para
teir paredes secundarias.

Microscopio de campo oscuro. Microscopio ptico con un condensador que dirige los rayos luminosos
lateralmente, de manera que ilumina la muestra de lado. Las lentes del microscopio reciben solamente
la luz dispersada por los diferentes componentes celulares por lo que las estructuras celulares aparecen
brillantes contra un fondo oscuro. Es bueno para observar clulas vivas.

Microscopio de contraste de fases. Resalta y amplia las diferencias en el ndice de refraccin de
distintas partes de las clulas.

Microscopio de interferencia o de interferencia de Nomarski. La luz se divide en dos haces. Uno
atraviesa la muestra y otro la ilumina lateralmente. Ambos son agrupados posteriormente, mostrando
imgenes en relieve.

Ambos son buenos para la observacin de clulas vivas.

Microscopio de polarizacin. Se ilumina la muestra con luz polarizada, es decir aquella que vibra en un
solo plano. La luz atraviesa un cristal: el polarizador, que como indica su nombre es el que proporciona
la luz polarizada, y llega a otro cristal: el analizador -despus de que la luz atraviese la muestra- para
captar la luz modificada por la muestra. Cuando polarizador y analizador presentan la mima orientacin,
el observador no percibe luz. Las estructuras isotrpicas no modifican la luz polarizada proporcionando
por tanto una imagen homogneamente oscura. Las estructuras anistropas (o birrefringentes) se
muestran brillantes sobre un fondo oscuro porque son capaces de desviar los rayos de luz, hacindose
visibles. Es un microscopio muy til para el estudio de muestras de plantas.

En todos los microscopios pticos, la imagen resultante llega a los oculares. Pero el microscopio puede
incorporar una cmara fotogrfica o una cmara de vdeo o puede disponer de un enlace a una pantalla
de ordenador, de tal manera que ya no solamente se estudian las muestras a travs de los oculares, si
no que tambin se puede hacer mediante fotografas o imgenes informatizadas, ambas susceptibles
de ser manipuladas por ejemplo ampliando la imagen, recortndola, interviniendo en el brillo, etc.

Los microscopios pticos modernos tienen un condensador universal que permite pasar del microscopio
ptico de campo claro al de campo oscuro y al de contrate de fases. Adems pueden incorporar
dispositivos para que se comporten como microscopios de polarizacin y de interferencia. E incluso
pueden tener lmparas de mercurio para obtener epifluorescencia y en consecuencia comportarse
como microscopios de fluorescencia.

Microscopio de fluorescencia. Permite detectar molculas que emiten fluorescencia (o que fluorescen),
esto es, molculas que absorben luz de determinada longitud de onda y emiten otra de mayor (o ms
larga) longitud de onda. Tienen dos sistemas de filtros: uno filtra la luz antes de alcanzar la muestra,
dejando pasar solo la longitud de onda que se quiere probar si excita o no las molculas fluorescentes.
Otro, deja pasar solamente la luz reemitida. Se ven estructuras brillantes sobre un fondo oscuro. Se
emplea el trmino referido a una estructura de emite en azul o emite en verde o emite en
rojo, porque frecuentemente los microscopios de fluorescencia incorporan filtros de salida que
modifican la luz de entrada en tres longitudes de onda distintas, que para el observador se identifican
con el azul, el verde y el rojo. Algunos colorantes fluorescentes pueden unirse qumicamente a
anticuerpos que se pueden unir especficamente a un tipo de estructura. Por ejemplo se pueden usar
para localizar determinada protena en el interior de las clulas. Es el llamado marcaje fluorescente.

Microscopio de luz ultravioleta. Usa como fuente de luz, luz ultravioleta que incide sobre la muestra. El
diferente grado de absorcin de clulas y tejidos es captado en placa fotogrfica porque la luz
ultravioleta daa la retina. Los microscopios fluorescentes (y confocales) suelen incorporar filtros que
permiten estudiar las muestras con luz ultravioleta.

Microscopio confocal o microscopio lser confocal. Permite la obtencin de imgenes fluorescentes de
material fijado, cortado o no, y de material vivo. Dichos materiales pueden haber sido marcados
fluorescentemente o no. Sobre la muestra en cuestin se hace incidir un rayo lser. De dicho rayo lser
se puede seleccionar su longitud de onda, tal como se hace en un microscopio de fluorescencia usando
filtros. De la muestra se estudia aquel plano en el que se ha hecho incidir el lser (puede llegar a ser un
plano de 0,1 micrmetro de espesor), obtenindose imgenes sin ruido porque el microscopio
incorpora un sistema que elimina la fluorescencia emitida por otros planos distintos al estudiado.
Finalmente y si el estudio lo requiere, mediante ordenador es posible montar plano a plano,
obtenindose imgenes tridimensionales sin necesidad de diseccionar la muestra.

Todos los microscopios, pueden ser microscopios convencionales o microscopios invertidos. stos,
presentan un recorrido de la luz diferente al de los microscopios convencionales. En los invertidos la
muestra es iluminada desde arriba, estando los objetivos por debajo de la platina, lo cual supone que no
hay una distancia muestra-objetivo que respetar, y en consecuencia se pueden observar muestras que
se encuentren en soportes gruesos, por ejemplo frascos de cultivo.


Los microscopios pticos permiten ver detalles de estructuras relativamente grandes de las clulas, por
tamao o porque son teidos. La ultraestructura se descubre con los microscopios electrnicos.

Los haces de electrones tienen longitudes de onda muy cortas, lo cual determina un enorme poder de
resolucin. En los microscopios pticos, la imagen se enfoca con las lentes. En el microscopio
electrnico con electroimanes (los haces de electrones estn cargados elctricamente!).

En la microscopa electrnica de transmisin (MET) (en ingls TEM) la muestra se fija y posteriormente
se incluye en plstico (no en parafina), se hacen cortes finsimos (de nanmetros) en ultramicrotomo.
Los cortes no se depositan en portaobjetos de vidrio, sino en soportes (llamados rejillas) generalmente
son de cobre. Finalmente el haz de electrones atraviesa la muestra. El resultado es captado por una
placa fotogrfica o por una pantalla de ordenador. Las imgenes obtenidas, muestran estructuras
electrodensas (negras), electroclaras (blancas) e intermedias entre ambas (grises). Se pueden usar
molculas de oro (que son electrodensas) adheridas a anticuerpos para localizar estructuras
especficas.

En el microscopio electrnico de barrido (MEB) (en ingls SEM) la muestra despus de fijada y
deshidratada, es recubierta por un metal para que los electrones reboten en l, proporcionando
imgenes en tres dimensiones. El MEB es muy buena herramienta para estudiar superficies.

De alguna forma se puede entender que el MET es un microscopio ptico de campo claro evolucionado
en tanto que en ambos casos se observan cortes de muestras atravesadas por, en un caso fotones y en
otro caso por electrones. Se estudian entonces finas lminas de la muestra. De igual forma se puede
entender que el MEB es una lupa (o microscopio simple o microscopio estereoscpico) evolucionada.
En ambos casos se estudian superficies

Los mtodos que se usan en microscopa electrnica, matan las clulas y pueden alterar la forma o
disposicin naturales. Es decir pueden provocar la aparicin de artefactos. Hay investigadores
abiertamente contrarios a la microscopia electrnica porque afirman- las imgenes son un conjunto de
artefactos.


Hay tcnicas bioqumicas (no microscpicas) que ayudan a conocer la funcin de los orgnulos.

En el fraccionamiento celular las clulas se rompen (se fraccionan!) y se centrifugan. El resultado es
que los materiales ms pesados precipitan (los ncleos por ejemplo) y queda en el sobrenadante lo ms
ligero (por ejemplo orgnulos y molculas). Se puede eliminar el sedimento y se puede volver a
centrifugar el sobrenadante, precipitando lo ms pesado (por ejemplo las mitocondrias), y as
sucesivamente en la llamada centrifugacin diferencial.

En la centrifugacin en gradiente de densidad, los orgnulos o molculas se instalan en su densidad
dentro de los frascos de centrifugacin en los que previamente se han dispuesto diferentes estratos con
densidades distintas.





Teoras. Arlequn

Teta roja del sol.
Teta azul de la luna.

Torso mitad coral,
mitad plata y penumbra.

Federico Garca Lorca
Muerte en el olvido

Yo s que existo
porque t me imaginas.
Soy alto porque t me crees
alto, y limpio porque t me miras
con buenos ojos,
con mirada limpia.
Tu pensamiento me hace
inteligente, y en tu sencilla
ternura, yo soy tambin sencillo
y bondadoso.
Pero si t me olvidas
quedar muerto sin que nadie
lo sepa. Vern viva
mi carne, pero ser otro hombre
-oscuro, torpe, malo- el que la habita ...

ngel Gonzlez