30 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

A idia de cultivar clulas isoladas

de plantas surgiu no incio deste sculo
com Gottlieb Haberlandt, um ilustre bo-
tnico alemo, como uma estratgia ca-
paz de materializar os conceitos embuti-
dos na teoria celular proposta por
Schwann e Shleider por volta de 1839. O
que postulava esta teoria? Esta conceituava
a clula (vegetal e animal) como a menor
unidade biolgica, autnoma, e capaz,
em princpio, de originar um organismo
inteiro. Assim, ela afirmava que a clula
madura do corpo de um organismo
pluricelular (clula somtica) manteria
seu material gentico em condies de
originar um indivduo idntico matriz
doadora, comportando-se desta forma
como se fosse uma clula-ovo ou zigoto.
A questo, pois, era descobrir como
fazer uma clula madura e especializada
(diferenciada), programada para a reali-
zao de funes especficas, voltar ao
estgio embrionrio. A tarefa no era
pequena para a poca de Haberlandt e
continua desafiadora e malcompreendida
para a cincia ainda hoje, quase s
vsperas da entrada da humanidade no
Gilberto B.Kerbauy
Instituto de Biocincia da
Universidade de So Paulo
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 31
terceiro milnio.
Haberlandt, todavia, legou s gera-
es seguintes de pesquisadores algo
muito importante para o avano do co-
nhecimento cientfico, ou seja, princpi-
os bem fundamentados, e procedimen-
tos tcnico-tericos a serem seguidos,
tendo alguns destes ltimos se mostrado
mais tarde quase que como verdadeiras
premonies.
A pr i mei r a demonst r ao
inquestionvel na obteno de embries
de plantas a partir de clulas maduras
(embriognese somtica) viria a ocorrer
em 1958 pelo prof. F.C. Steward e cola-
boradores, cerca de quarenta anos mais
tarde, atravs do cultivo de clulas isola-
das de raiz de cenoura. No obstante, o
significado cientfico e o imenso poten-
cial prtico representado por esta desco-
berta parecem no ter sido suficientes
para despertar na mdia da poca o
mesmo frisson verificado com a divulga-
o dos resultados com a ovelha Dolly,
mesmo que neste caso no se possa falar
em clonagem, na verdadeira acepo
deste termo.
Antes da obteno de embries
somticos de cenoura, j haviam conse-
guido a formao in vitro de estruturas
complexas, como gemas vegetativas,
razes e plantas inteiras, utilizando-se
fragmentos (explantes) de tecidos isola-
dos de caules, folhas e razes. Todavia,
um avano fantstico nos estudos da
cultura de clulas, embries e rgos de
plantas foi possibilitado com a desco-
berta das citocininas, um importantssi-
mo hormnio vegetal, pelo grupo do
professor Folke Skoog da Universidade
de Wisconsin (USA). Paradoxalmente, a
descoberta deste novo fitormnio deu-
se graas ao emprego da prpria tcnica
da cultura de clulas vegetais. Esta des-
coberta levou constatao de que o
processo de formao de rgos nas
plantas dependia, na verdade, de um
balano das quantidades relativas de
uma citocinina e de uma auxina (outro
hormnio vegetal j conhecido), e no
da pr esena de subst nci as
organognicas especficas, conforme se
postulava at ento (floregno, calinas,
rizocalinas).
Paralelamente a uma renovada e
indita perspectiva de compreenso dos
complexos mecanismos controladores
do desenvolvimento das plantas como
um todo, dava-se tambm com esta des-
Embries somticos de amor-perfeiro (Viola tricolor) em diferentes estgios de
desenvolvimento (estruturas verdes), formados sobre um calo (estrutura creme).
32 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
cober t a o i n ci o da chamada
biotecnologia celular de plantas, aqui
entendida como a utilizao integrativa
de pr ocessos t ecnol gi cos e
bioqumicos, empregando-se clulas,
tecidos e rgos de plantas superiores,
visando a gerao de produtos e servi-
os.
1- Aplicaes da cultura de tecidos
Vrias tm sido hoje as aplicaes
das tcnicas de biotecnologia celular de
plantas, a comear pela clonagem, seu
lado mais visvel, seguido pela cultura de
clulas (suspenses celulares em meio
lquido), tecidos e rgos para fins pr-
ticos, a obteno de plantas haplides a
partir da cultura de anteras, a produo
de met abl i t os secundr i os em
biorreatores, a gerao de variantes
somaci onai s, a mi cr oenxer t i a, a
tecnologia dos protoplastos (clulas nuas
com capacidade de se fundir) etc. Alm
disto, no seria demais mencionar ainda
que um dos esteios bsicos da chamada
biologia molecular de plantas (enge-
nharia gentica) depende em grande
extenso de estratgias e tcnicas utiliza-
das em biologia celular. Neste artigo,
procuraremos abordar apenas uma des-
tas diferentes tcnicas, aquela mais vis-
vel para o pblico em geral, ou seja, a
clonagem in vitro ou plantas de prove-
ta.
2 - Estabelecimento das culturas
Comparativamente s clulas ani-
mais, as clulas das plantas superiores
(produtoras de flores) podem ser consi-
deradas menos diferenciadas, tendo sido
esta caracterstica interpretada como uma
importante estratgia de sobrevivncia
para organismos imveis.
Entretanto, isto no signifi-
ca que possamos regenerar
uma planta inteira de qual-
quer tecido. Os potenciais
de regenerao dependem
do tipo de planta, do rgo
utilizado e do estgio de
desenvolvimento deste. r-
gos jovens so mais susce-
tveis clonagem do que
quando maduros, o que sig-
nifica que, medida que a
especializao progride du-
rante o desenvolvimento do
rgo ou da pl ant a, a
despr ogr amao gni ca
(desdiferenciao) torna-se
mais difcil.
Conforme mostrado no
esquema, verifica-se que as
cul t ur as podem ser
estabelecidas a partir tanto
de fragmentos de tecidos
maduros (fol has, caul es
etc.), quanto de tecidos
meristemticos, constitudos
por clulas em processo de
diviso e localizados, geral-
mente, nos pices dos cau-
les e razes em crescimento.
O baixo grau de diferencia-
o de suas clulas, associ-
ado maior estabilidade
gentica destas, faz dos pi-
ces meristemticos uma das
principais fontes de explantes.
Aps a necessria desinfestao das
superfcies externas, os explantes so
transferidos para os meios de cultura,
uma mistura balanceada de macro e
mi cr onut r i ent es ( sai s mi ner ai s) ,
aminocidos, vitaminas etc., e, obvia-
mente, de uma auxina e uma citocinina
em propores adequadas s finalida-
des desejadas. A geleificao do meio
para efeito de sustentao das culturas
obtida atravs da adio de agar. Gemas
vegetativas e mesmo florais, razes e
embries somticos podero se formar
tanto diretamente do explante quanto
indiretamente (via proliferao celula-
res, os chamados calos). De um modo
geral, os balanos hormonais mais favo-
rveis s auxinas promovem a formao
de embries e primrdios de razes e,
quando favorveis s citocininas, indu-
zem a formao de gemas. Quando ape-
nas gemas so formadas, torna-se neces-
sria a transferncia destas para meios
indutores de razes, obtendo-se ento
uma planta inteira e em condies de ser
transferida para a casa de vegetao. Os
calos, por serem massas celulares
indiferenciadas, permitem tambm a re-
generao in vitro com relativa facilida-
de. Todos os procedimentos necessrios
ao manuseio das culturas so realizados
sob condies asspticas, fornecidas por
equipamentos especiais.
3 - Clonagem de plantas in vitro
O termo clonagem, hoje j incor-
porado ao cotidiano das pessoas, signi-
f i ca a f or mao de i ndi v duos
geneticamante idnticos a partir de clu-
las ou fragmentos de uma determinada
matriz. Clone deriva etmologicamente
do grego kln, que quer dizer broto e
pressupe, portanto, a existncia de um
indivduo gerador, e a ocorrncia de
reproduo assexuada.
A tcnica da clonagem in vitro de
pl ant as, t ambm conheci da por
micropropagao, devido ao emprego
de pores de tecidos bastante peque-
nas, tem-se mostrado de enorme impor-
tncia prtica e potencial nas reas agr-
cola, florestal, horticultural, bem como
na pesquisa bsica em geral.
A necessidade de colocao rpida
no mercado de plantas de ciclo de vida
longo, geralmente arbreas e arbustivas,
selecionadas aps prolongados pero-
dos de melhoramento gentico, faz da
clonagem uma alternativa muito impor-
tante e indispensvel nos dias atuais. Em
orqudeas, por exemplo, embora sejam
Flor e botes florais formados a partir de
tecido epidrmico, isolado de flores maduras
de tabaco.
Protocormides formados diretamente de pi-
ces de razes de Catasetum fimbriatum
(Orquidceas).
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 33
plantas herbceas, uma boa muda (di-
viso) no se obtm em menos de dois
anos, enquanto que neste mesmo pero-
do, atravs da cultura in vitro de pices
meristemticos, centenas ou milhares de
clones podem ser produzidos. Alm dis-
to, so indiscutveis as vantagens repre-
sentadas pela manuteno de quantida-
des considerveis destas plantas por
metro quadrado, dentro de frascos em
laboratrios, protegidos do ataque de
pragas, doenas e intempries.
Particularmente na rea de plantas
ornamentais, onde predominam plantas
hbridas (gerbera, cravo, tulipa, orqu-
dea etc.), a clonagem in vitro de matrizes
sel eci onadas t em per mi t i do a
compatibilizao de demandas especfi-
cas do mercado interno e externo, com
atributos importantes como poca de
florao, colorao, tamanho e forma
das flores, nmero de flores/planta, com-
primento e resistncia das hastes florais,
tamanho e vigor das plantas etc. A mul-
tiplicao in vitro em larga escala de
plantas de importncia econmica tem
resultado na instalao de verdadeiras
biofbricas comerciais, baseadas no prin-
cpio da linha de produo.
4 - Eliminao de patgenos
Plantas propagadas vegetativamente
por meio de tcnicas convencionais,
como estaquia, enxertia, etc., uma vez
infectadas por vrus, micoplasmas, bac-
trias e fungos endgenos, transmitem
inescapavelmente estes patgenos s
geraes subseqentes, provocando uma
diminuio progressiva no rendimento
das culturas. O cultivo de espcies com
retornos abaixo do potencial gentico
produtivo, selecionado previamente,
inaceitvel num
mundo com po-
pulao crescen-
te e carente de ali-
ment os. Aval i a-
es comparati-
vas realizadas com
pl ant as de um
mesmo cultivar de
mo r a n g u i n h o ,
infectadas com v-
r us, most r ar am
que aquelas livres
destes patgenos,
via cultura de pi-
c e s
mer i st emt i cos,
eram duas vezes
mais produtivas. O
fato de uma plan-
ta ter sido limpa
de vrus, ou de
out ro pat geno
em l aborat ri o,
no confere a ela
nenhuma imuni-
dade a novas in-
feces. De fato,
a substituio das
popul aes de
plantas, aps al-
guns anos de cul-
tivo a campo, por
novas matrizes produzidas
em laboratrio torna-se con-
dio sine qua non. Labora-
trios comerciais de mdio e
grande portes tm sido os
responsveis pela produo
contnua de plantas livres de
patgenos.
Por sorte, conforme se
descobriu tempos atrs, a
distribuio de vrus e ou-
tros patgenos dentro das
plantas no uniforme, sen-
do os tecidos meristemticos
apicais praticamente livres
destes microrganismos. In-
felizmente, a cincia no sabe
ao certo a(s) causa(s) desta
capacidade protetora dos
tecidos meristemticos.
De qualquer forma, o
isolamento cuidadoso de
pequenas pores de regi-
es meristemticas (0,1 a
0,5mm) e a cultura destas em
meios de cultura apropria-
dos permitem a obteno em
escala econmica de plantas
clonadas livres de muitos
patgenos. muito prov-
vel, sem que o leitor o saiba, que a
batatinha, banana, moranguinho, abaca-
xi que saboreou nesta ltima semana
tenham sido produzidos por plantas
clonadas in vitro.