UNIDADES TECNOLGICAS DE SANTANDER

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

PRE INFORME DE LABORATORIO DE BIOLOGIA





IDENTIFICACIN
NOMBRE DE LA PRCTICA: PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICAR
CELULAS ANIMALES

FECHA: 03/10/14
INTEGRANTES

NOMBRE: DANNY MANUEL RODRIGUEZ QUIONEZ

CDIGO: 67065
PROGRAMA:TECNOLOGIA EN RECURSOS AMBIENTALES GRUPO: E135 DOCENTE: HUGO CARVAJAL
OBJETIVOS
Conocer diferentes procedimientos para Identificar clulas animales.
Reconocer las caracteristicas de la tejidos animales.
Identificar ciertos colorantes y soluciones en la identificacin de estructuras celulares.
INTRODUCCIN
Las estructuras celulares son ( a excepcin del cloroplasto ) bastante difciles de observar a simple vista, esto
debido a que aproximadamente el 70 y 90% de la clula es agua. Por esta razn se hace necesario hacerlas
visibles, es aqu donde los diferentes tintes que existen son de utilidad. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

En estas pginas vamos a describir las tecnicas de tincin utilizadas para observar al microscopio la
morfolgia en muestras biolgicas.

La mayora de las tcnicas van encaminadas a preparar el tejido para su observacin con el microscopio,
bien sea ste ptico o electrnico. Ello es debido a que la estructura de los tejidos est basada en la
organizacin de los tipos de clulas que los componen y, salvo contadas ocasiones, las caractersticas
morfolgicas de las clulas slo se pueden observar con estos aparatos.

Existen procedimientos rpidos y simples para la observacin de tejidos y clulas vivas que reciben el nombre
de vitales. Por ejemplo, la observacin del flujo sanguneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma
de observar clulas o tejidos vivos es mediante las tcnicas histolgicas supravitales, en los que las clulas
y los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de clulas
y de tejidos.

Las tcnicas histolgicas postvitales son aquellas en las que las clulas mueren durante el proceso, pero las
caractersticas morfolgicas y moleculares que posean en estado vivo se conservan mejor o peor
dependiendo del tipo de tcnica. Estas pginas estarn dedicadas a este tipo de tcnicas, puesto que son las
ms comnmente usadas en los laboratorios de histologa.

TINCIN DEFINICIN
Los tejidos animales son en su gran mayora incoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo de pigmento
como la sangre o la melanina de la epidermis. La tincin es una tcnica en la que se utilizan diferentes
colorantes, que son captados por las estructuras de las muestras biolgicas que se observan al microscopio,
siendo cada estructura a fin a un tipo determinado de colorante, por lo que se pigmentan de diferente color y
se pueden diferenciar e identificar. . Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cmo
teir los tejidos para poder desentraar sus caractersticas morfolgicas. Se observ que algunos pigmentos
como el carmn o la eosina, disueltos en agua, se unan a determinados componentes de las clulas. La
expansin de la industria textil y su necesidad de colorear las telas provoc un rpido desarrollo de los tintes o
pigmentos en el siglo XIX. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histologa de los
animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo
y perfeccionamiento de nuevas tcnicas y molculas sintticas que se usan segn las necesidades del
investigador.
TINCIONES FUNDAMETOS
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La mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teirlos para
observar sus caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en el uso de colorantes,
sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente
hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas presentes en los tejidos gracias a afinidades
qumicas. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse
con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijacin se realiza
habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente
fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento
de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente,
de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha
precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones)
y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica,
que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el
cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s
podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los
procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas
las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles
celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que
la mayor parte del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se
colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia
utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares
y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio
de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden
conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para
tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.

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SIN TINCIN
No se utiliza ningn tipo de colorante es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se
extienden directamente sobre la superficie de un portaobjeto para su observacin. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de
solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia,
Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos,
etc.

TINCIN SIMPLE
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad.
La tincin Giemsa: Se emplea principalmente en frotis sanguneos para observar a los agentes patgenos
junto a las clulas sanguneas y mostrar las diferencias entre ambos. El colorante de Giemsa es un colorante
compuesto ya que es una mezcla de varios colorantes.
TINCIN DIFERENCIAL

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los
diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

TINCIN DE GRAM
Hans Cristian Gram en l884 invent un mtodo de tincin diferencial es uno de los mtodos ms
importantes en el laboratorio Se utilizan varios colorantes combinados. Su utilidad prctica es indiscutible y
en el trabajo microscpico de rutina del laboratorio de microbiologa las referencias a la morfologa celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos y negativos) se basan en la tincin de gram.

Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su
propia constitucin qumica.

En lo relativo a la coloracin, de microorganismos son Gram positivos cuando aparecen teidos de color
azul-violeta y de Gram negativo cuando se visualizan de color rojo-rosado.


TINCIN RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos
auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los
esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con
la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes
el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones
tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica.

TINCIN NARANJA DE ACRIDINA
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El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En
algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH
y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia
verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en
el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente
aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con
naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.
TINCIN ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido,
despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las
micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de
Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50
tomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp
son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido
sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con
alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno
(color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente
su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se
emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para
aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos
laboratoros ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz
blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.
TINCIN ROMANOWSKY
La tincin de Romanowsky es una tcnica de tincin prototpica que fue predecesora de varios mtodos
distintos, pero basados en principios similares entre los que se incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner,
Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar diferentes tipos de clulas en
especmenes patolgicos. Consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o
eosina B.

La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloracin prpura a
los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes
de este efecto son el azul B y la eosina Y.
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TINCIN DE WRIGHT
La tincin de Wright es un tipo de tincin usada en histologa para facilitar la diferenciacin de los tipos de
clulas de la sangre. Se usa principalmente para teir frotis de sangre y punciones medulares, para ser
examinadas al microscopio. En citogentica se usa para teir cromosomas, para facilitar el diagnstico de
sndromes y enfermedades.
Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tincin de
Romanowsky, en 1902.
Debido a que ayuda a distinguir fcilmente las clulas de la sangre se convirti en una tcnica muy usada
para el conteo de los glbulos blancos, una tcnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones.
La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky.
Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y
o eosina B.
La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloracin prpura a
los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color rosado a los eritrocitos. Los
componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.
Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras
qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las
protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico.
La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las
protenas bsicas.

TCNICAS DE PREPARACI DE MUESTRAS: FROTIS
Es una tcnica en la que se utilizan diferentes colorantes, que son captados por las estructuras de las
muestras biolgicas que se observan al microscopio, siendo cada estructura afn a un tipo determinado de
colorante, por lo que se pigmenta de diferente color y se pueden diferenciar e identificar.
FROTIS EXTENDIDO
Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de
separar lo ms posible los microorganismos. Se coloca una gota sobre un portaobjetos y se extiende con un
asa, con un cubre u otro portaobjetos y se observa directamente o previa fijacin y coloracin.
SQUASH O APLASTAMIENTO
Se coloca el material entre 2 portaobjetos y se presiona con el dedo pulgar los dos portaobjetos con fuerza
para obtener la preparacin por aplastamientos. Despus se puede observar directamente o previa fijacin y
coloracin
CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES
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SEGN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmn y la orcena.
SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G,
etc..

SEGUN SUS PROPIEDADES QUMICAS:

La mayora de los colorantes empleados en histologa actan como cidos o bases y tienden a formar uniones
salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos.

Colorantes cidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes
celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidfilos,
porque tienen afinidad por los colorantes cidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de
las protenas. Estas protenas pueden pertenecer al citoesqueleto de la clula o hallarse en la matriz
extracelular. Debido al elevado contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente colorante
citoplasmtico. La eosina se une tambin a las membranas plasmticas, sin embargo, se desconoce la
naturaleza qumica de esta unin. Las clulas que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas
mitocondrias, mucho retculo endoplasmtico liso, etc.) son sumamente acidfilas, o sea, se tien
intensamente con la eosina.

Colorantes bsicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a
componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan
basfilos, porque tienen afinidad por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al ncleo
y ciertas regiones del citoplasma. Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teir un tejido
se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es bsica y por lo tanto se une
a cargas negativas de la clula o matriz extracelular.

Colorantes neutros: son colorantes en los que la porcin cida y la bsica colorean. Tien las partes bsicas
de una clula de un color y las partes cidas de otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej.
el eosinato de azul de metileno.

Colorantes indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los disuelven ms fcilmente que el
lquido en que estn preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lpidos.

Los colorantes ms usados son:
EOSINA
Se conocen 2 compuestos con este nombre y estn relacionados: la eosina Y (tetrabromouorescena),
comnmente conocida como eosina amarilla, y la eosina B (dibromodinitrouorescena), tambin conocida
como eritrosina B azulada. Ambas, en principio, son intercambiables, sin que sean notables las diferencias
entre ellas en el resultado de la tincin, por lo que la preferencia de una sobre otra suele seguir un criterio
subjetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la ms utilizada en procedimientos rutinarios histolgicos, como
tincin de contraste, la tcnica de la Hematoxilina - Eosina. La Eosina es un Colorante amarillento
anaranjado usado comnmente para contrastar con otros, se puede utilizar en solucin acuosa al 1% o
alcohlica al 5%.

SAFRANINA O
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Es un colorante biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar un color violeta
ms intenso a las bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias G- ; en histologa y en citologa. La safranina
se usa como lquido de contraste en algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo celular de rojo. Este
colorante se utiliza especialmente para tcnicas histolgicas animales y vegetales.
SUDN III O SUDN IV
Usado comnmente en tejidos vegetales o animales para diferenciar las grasas. Los colorantes para grasas
son ms solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. As, al baar la grasa con la
solucin del colorante ste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general
estos colorantes siempre van en solucin alcohlica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.
El Sudn IV produce una coloracin progresiva, es decir, que a ms tiempo de exposicin al colorante mayor
es la intensidad de tincin.
ORCENA
Uno de los tintes ms empleados, se utiliza para diferenciar ncleo. Caliente suavemente 45 mL de cido
Actico y agregue 2 g de Orcena, deje enfriar y agregue 55 mL de agua destilada.
LUGOL
El lugol o solucin de Lugol es una solucin de yodo diatmico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de potasio KI
(2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al mdico francs Jean Guillaume Auguste Lugol.

En microbiologa, es empleado en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta.
AZUL DE METILENO
El azul de metileno, cuyo nombre cientfico es Cloruro de Metiltionina, es un colorante El azul de metileno se
utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Es tambin utilizado para teir los
extendidos de sangre para ser utilizados en citologa y como colorante vital en el recuento de reticulocitos
REFERENCIAS
http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html
http://metodolab.blogspot.com/
http://elprofedebiolo.blogspot.com/2010/01/tecnicas-de-tincion.html