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CONTENIDO

PRACTICA N 1 Principios bsicos para el anlisis microbiolgico de alimentos


PRACTICA N 2 Mtodos de muestreo para el examen microbiolgico de alimentos
PRACTICA N 3 Evaluacin microbiolgica de superficies inertes y vivas (manos de
manipuladores de alimentos)
PRCTICA N 4 Numeracin de microorganismo mesfilos aerobios viables en alimentos no
fermentables, carne de res, pollo y pescado.
PRACTICA N 5 Investigacin y numeracin de Bacillus cereus en productos de panificacin
PRACTICA N 6 Investigacin y numeracin de Staphylococcus aureus coagulasa positivo
PRACTICA N 7 Investigacin de Salmonella en alimentos (ovoproductos).
PRCTICA N 8 Control de esterilidad de conservas
PRACTICA N 9 Numeracin de coliformes totales y coliformes termotolerantes (E. coli) por el
mtodo del nmero ms probable de tubos mltiples NMP/ml/g
PRACTICA N 10 Numeracin de mohos y levaduras
PRCTICA N 11 Aislamiento, purificacin y aplicacin de hongos (Basidiomicetos) en la
elaboracin de un producto fermentado.







PRACTICA N 1
PRINCIPIOS BSICOS PARA EL ANLISIS MICROBIOLGICO DE
ALIMENTOS
I. OBJETIVO

Conocer los principios bsicos sobre la preparacin de materiales para el examen
microbiolgico de alimentos.
Conocer las diferentes tcnicas para la numeracin de microorganismos en alimentos.

II. FUNDAMENTO TEORICO
2.1 MEDIDAS DE ASEPSIA DURANTE EL PROCESAMIENTO
Durante el procesamiento se utiliza un mechero Bunsen que, debido a la fuerza la circulacin del
aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestril en la zona
inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen
considerablemente. Durante el proceso de dilucin se debe trabajar cerca al mechero. Normalmente
se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y
despus de su utilizacin, a pesar de estar esterilizados previamente. El uso de gorra y mascarillas
durante el procesamiento de las muestras de alimentos debe ser obligatorio.
2.2 RE SUSPENSIN Y HOMOGENIZACIN DEL ALIMENTO
Los mtodos de aislamiento y numeracin de microorganismos presentes en las muestras de
alimentos, generalmente requieren de un tratamiento preliminar para liberar dentro del medio
fluido, los microorganismos que pudieran estar aprisionados en las estructuras del alimento o en
superficies. Comnmente se utiliza un aparato elctrico de trituracin (licuadora o vortex) y
mezcla. As una homogenizacin excesiva puede dar como resultado, recuentos bajos, por el
contrario por el contrario, una homogenizacin insuficiente puede no, liberar de todos los
microorganismos que se encuentran aprisionados, o no conseguir su distribucin homognea en la
suspensin del alimento.
Todos los homogeneizados generan aerosoles, por lo que se debe tener mucho cuidado para evitar el
riesgo de la formacin de los aerosoles, especialmente si se sospecha que el alimento puede
contener grmenes patgenos. Durante este procedimiento se debe considerar medidas de asepsia.
Otro factor de gran importancia en la numeracin de microorganismos en los alimentos la
naturaleza del diluyente usado, siendo el ms adecuado el agua peptonada al 1%. Sin embargo, de
acuerdo a la naturaleza del alimento se pueden utilizar otros diluyentes, tales como: solucin salina
peptonada, solucin tween o agua destilada estril.
2.3 MTODOS DIRECTO DE RECUENTO DE MICROORGANISMOS
Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Se considera
como un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. En general se investiga
la presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos; aunque, en ciertas situaciones
(alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales,
coliformes, mesfilos aerobios, mohos y levaduras, etc.
Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso.
a.- Recuento en Placa
Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El
resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de
microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo.
b.- Filtros de membrana
Utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen
las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo
apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que
facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie
especficamente los cidos nucleicos).
c.- Contaje de microcolonias al microscopio
Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formacin
de microcolonias al microscopio.
d.- Films secos (Petrifilm)
Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml
de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento.
2.4 MTODO INDIRECTO PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS
a.- Nmero Ms Probable (NMP/g o ml)
Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las
diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos.
b.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes
Usando azul de metileno. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y
esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos).
2.5 COMPUTO DEL RECUENTO ESTNDAR EN PLACA
Completada la incubacin seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contar el
nmero de colonias, multiplicando por el inverso de la dilucin redondeando la cantidad a dos
cifras. Reportar el nmero de colonias por gramo o mililitro de muestra. Se debe tomar en cuenta
las siguientes consideraciones:
Cuando solo una dilucin tiene el rango apropiado, se debern contar las colonias,
multiplicando por el inverso de la dilucin.
Cuando hay dos diluciones cuyo rango es el apropiado, se deben contar las colonias de cada
dilucin y luego se promedian las cuentas de dos diluciones.
Cuando la dilucin menor tenga menos de 30 colonias contar las colonias y multiplicar por
el inverso de la dilucin.
Cuando la dilucin mxima tenga ms de 300 colonias, se deber escoger un rea de la
placa donde la distribucin colonial sea representativa, contando posteriormente las
colonias multiplicando por el factor adecuado para obtener la cuenta de la placa.
Cuando en ninguna de las placas haya desarrollo de colonias, reportar como menor del
inverso de la menor dilucin usada.
2.6.- CRITERIOS MICROBIOLGICOS
Los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad se sujetaran a lo expresado en la
presente norma sanitaria de la Direccin General de Salud Ambiental- DIGESA, de acuerdo a lo
siguiente:
PRACTICA N 2
MTODOS DE MUESTREO PARA EL EXAMEN MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

I. OBJETIVOS
Preparar los materiales necesarios para la toma de muestras.
Exponer los elementos bsicos necesarios en los diferentes tipos de muestreo de
alimentos

II. FUNDAMENTO TEORICO
Los mtodos de muestreo y los procedimientos para la toma de muestras debern basarse en
normas nacionales o internacionales referidas a alimentos y apropiadas para fines
microbiolgicos.
La mayora de las pruebas de control de calidad se realiza a peticin del fabricante
interesado en demostrar al consumidor la calidad de su producto. El muestreo para el
control de calidad debe preestablecerse y programarse de modo que las mnimas variaciones
que pueden apreciarse en los lotes de ciertos productos, se detecten rpidamente para que
puedan introducirse de inmediato modificaciones en el proceso antes de que ocurran
cambios apreciables que alteren las preferencias del consumidor, en las grandes factoras se
realiza el muestreo al comienzo y al final de las operaciones de procesado as como tambin
en la facturacin y durante su almacenamiento. En el caso que se sospeche de una
toxiinfeccin alimentario el muestreo se dirigir directo y especficamente al alimento
consumido, sospechoso de haberla causado
Un alimento de riesgo en salud pblica es aquel que, en razn a sus caractersticas de
composicin, especialmente en sus contenidos de nutrientes, actividad de agua (Aw) y pH,
favorece el crecimiento microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso,
manipulacin, conservacin, transporte, distribucin y comercializacin, puede ocasionar
trastornos a la salud del consumidor.
En el control de calidad de alimentos es necesario tomar en cuenta ciertas normas. El
inspector utiliza equipos y materiales diferentes durante la inspeccin, puede utilizar
aquellos de uso comn, tales como cuchillos, cucharones, esptulas, bolsas, frascos
estriles, etc. A veces se puede necesitar material especializado termmetro para medir la
humedad en los cereales y caladores, etc.
2.1 DEFINICIONES
Muestra
Una muestra consiste en una o ms unidades de producto extrado de un lote.
Es definida como la fraccin de un material sobre la que se estudian ciertas caractersticas
que posteriormente se generalizan a todo el conjunto.
Contra muestra
Es una porcin adicional de la muestra tan parecida a la original como sea posible, debe
tomarse al mismo tiempo y en la misma forma y cantidad que la muestra original para
asegurar que las condiciones sean idnticas.
Muestreo
Accin organizada de extraer una muestra para su anlisis. Se muestrea para
obtener una muestra representativa de todas las unidades del lote, es decir una
versin simplificada de la poblacin que reproduzca de algn modo sus rasgos
bsicos; con el propsito de aceptar o rechazar dicho lote.
Lote
Cantidad determinada de unidades de caractersticas similares fabricadas bajo condiciones
presumiblemente uniformes que se identifican por tener el mismo cdigo o clave de
produccin. Una cantidad determinada de un alimento producida en condiciones
esencialmente iguales.
Muestra representativa
Es aquella que es tomada conforme las normas de muestreo establecidas, que toman en
consideracin el tamao del lote, la naturaleza y la forma de acondicionamiento del
producto.
Alimento apto para consumo humano
Alimentos que cumplen con los criterios de calidad sanitaria e inocuidad establecidos por la
norma sanitaria.
Criterios microbiolgicos
Define la aceptabilidad de un producto o un lote de un alimento basado en la ausencia o
presencia en cantidad de microorganismos por unidad de masa, volumen, superficie o lote.
Agentes microbianos: Son los microorganismos de vida til, indicadores y patgenos
sealados en la disposicin.
2.2 PLANES DE MUESTREO
Los planes de muestro solo se aplican a lotes o lote de alimentos y bebidas, se sustentan en el
riesgo para la salud y las condiciones normales de manipulacin y consumo del alimentos. Los
planes de muestreo se expresan en planes de 2 o 3 clases que dependen del grado de peligro
involucrado.
Un plan de muestreo de 2 clases de usa cuando no se puede tolerar la presencia o ciertos
niveles de microorganismo en ninguna de las unidades de muestra. Un plan de muestreo de 3
clases se usa cuando se puede tolerar cierta cantidad de microorganismos en algunas de las
unidades de muestra. Al disear un plan de muestreo para un alimento en particular deben
establecerse los valores de n, m, M y c en donde:
Categora: grado de riesgo que representan los microorganismos en relacin a las
condiciones previsibles de manipulacin y consumo del alimento.
n: nmero de unidades de muestra seleccionada al azar de un lote, que se analizan para
satisfacer los requerimientos de un determinado plan de muestreo.
c: nmero mximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de muestreo
de 2 clases o un nmero mximo de unidades de muestra que puedan contener un numero
de microorganismos comprendidos entre n y m en un plan de muestreo de 3 clases. Cuando
se detecta un nmero de unidades de muestra mayor a c se rechaza el lote.
m: valor umbral o limite microbiolgico que separa la calidad aceptable de la rechazable.
En general un valor igual o menor a m, representa un producto aceptable y los valores
superiores a m indican lotes inaceptables.
M: Los valores de recuentos microbianos superiores a M son inaceptables, el alimento
representa un riesgo para la salud.
El programa de muestreo se aplica a: Registro Sanitario y Certificacin Sanitaria Oficial de
Exportacin y se basa en el tipo y riesgo que conllevan las especies microbianas analizadas
y las condiciones previsibles de manejo y consumo a las que se someter el alimento luego
de su fabricacin o elaboracin. Las categoras del Programa de Muestreo se indican en el
cuadro
El plan de dos clases provenientes de un muestreo por atributos; en este caso la aceptacin o
el rechazo estar definido por n y c.; el plan de tres clases proveniente de un muestreo por
atributos; en este caso la aceptacin o el rechazo estar definido por n, m, M y c, donde c
tendr como lmites m y M. Se rechazarn todos aquellos resultados cuyos valores sean
superiores a M; ninguna de las muestras del plan de tres clases sobrepasar el valor de M.
Cuadro 1 Planes de muestreo para combinaciones de diferentes grados de riesgo para
la salud y diversas condiciones de manipulacin (*)
SEVERIDAD, TIPO DE
RIESGO PARA LA
SALUD
CONDICIONES NORMALES DE MANIPULACIN Y
DE RIESGO PARA CONSUMO DEL ALIMENTO LUEGO
DEL MUESTREO
Condiciones que
reducen el riesgo
Condiciones que no
modifican el riesgo
Condiciones que
pueden aumentar el
riesgo
Sin riesgo directo para la
salud (contaminacin
general, vida til y
alteracin)
Categora 1
3 clases
n=5 , c=3
Categora 2
3 clases
n=5 , c=2
Categora 3
3 clases
n=5 , c=1
Riesgo para la salud bajo,
indirecto
(indicadores)
Categora 4
3 clases
n=5 , c=3
Categora 5
3 clases
n=5 , c=2
Categora 6
3 clases
n=5 , c=1
Moderado, directo ,
diseminacin limitada
Categora 7
3 clases
n=5 , c=2
Categora 8
3 clases
n=5 , c=1
Categora 9
3 clases
n=10 , c=1
Moderado, directo ,
diseminacin potencialmente
extensa
Categora 10
2 clases
n=5 , c=0
Categora 11
2 clases
n=10 , c=0
Categora 12
2 clases
n=20 , c=0
Grave directo Categora 13
2 clases
n=15 , c=0
Categora 14
2 clases
n=30 , c=0
Categora 15
2 clases
n=60 , c=0
(*) Fuente: Mtodos de muestreo para el anlisis microbiolgico, principios; principios y
aplicaciones especificas. International Commission on Microbiological Specification for
Foods (ICMFS)
2.3 EXCEPCIONES EN QUE n ES DIFERENTE DE 5
a) Nmero de unidades de muestra para registro sanitario de alimentos y bebidas
En nmero de unidades de muestra de alimentos y bebidas (n) para la inscripcin en el
registro sanitario podr ser igual a uno (n=1) y deber ser calificada con los limites ms
exigentes (m) indicadas en la presente disposicin para este tipo de alimentos o bebidas.
b) Nmero de unidades de muestra para la verificacin del plan HACCP
Para la verificacin del Plan HACCP, el nmero de unidades de muestra de los planes de
muestreo podr ser igual a uno (n=1) y deber ser calificada con los limites ms exigentes
(m) indicadas en la presente disposicin para este tipo de alimentos o bebidas.
Esto proceder si una persona natural o jurdica que opera o intervenga en cualquier
proceso de fabricacin, elaboracin, e industrializacin de alimentos y bebidas, demuestre
mediante documentacin histrica con un mnimo de de 6 meses, que cuentan con
procedimientos eficaces basados en los principios del sistema HACCP.
c) Nmero de unidades de muestra para la vigilancia sanitaria de alimentos preparados
Para el caso de la vigilancia sanitaria de alimentos y bebidas preparados provenientes de
establecimientos de comercializacin, preparacin y expendio, se podr tomar una unidad
(n=1) de muestra por cada tipo de alimento preparado que debern ser calificadas con los
limites ms exigentes (m), indicados en la presente disposicin.
2.4 MICROORGANIMOS QUE CONSTITUYEN PELIGRO Y GENERAN RIESGO PARA
LA SALUD DEL CONSUMIDOR
Los microorganismos correspondientes a las clases de criterios microbiolgicos, se agrupan
como: (i) microorganismos que no implican riesgo para la salud pero s para la vida til del
producto, (ii) microorganismos de riesgo indirecto bajo (indicadores), y (iii) microorganismos
de riesgo directo para la salud (patgenos).
Los microorganismos del grupo (i)
Las categoras 1, 2 y 3 definen los microorganismos asociados con la vida til y alteracin del
producto tales como:
a) Mohos
b) Levaduras, levaduras osmfilas
c) Aerobios mesfilos
d) Psicrotolerantes
e) Hetertrofos
f) Esporulados termfilos
g) Lactobacillus
h) Bacterias acido lcticas
Los microorganismos del grupo (ii)
Estos son los microorganismos indicadores de higiene, incluyen a las categoras 4,5 y 6 se
encuentran los microorganismos no patgenos que suelen estar asociados a ellos como:
a) Escherichia coli
b) Coliformes totales
c) Enterobacterias
A excepcin de preparacin en polvo o frmula para lactantes que se consideran en el grupo
de microorganismo patgenos
Los microorganismos del grupo (iii)
estn subdivididos en:
(1) Microorganismos de riesgo moderado, directo de diseminacin limitada:
Las categoras 7,8 y 9 corresponden a microorganismo patgenos cuya cantidad en los
alimentos condiciones su peligrosidad para causas enfermedades alimentarias tales como
a) Staphylococcus aureus
b) Clostridium perfringens
c) Bacillus cereus
d) Pseudomonas aeruginosa
e) Campylobacter jejuni
f) Yersinia enterocoltica
g) Vibrio cholerae
h) Vibrio parahaemolyticus
i) Listeria monocytogenes
(2) Microorganismos de riesgo para la salud moderado, directo, diseminacin
posiblemente extensa: Estn las categoras 10, 11 y 12
a) Salmonella
b) Shigella
c) Escherichia coli patgeno
(3) Microorganismos de riesgo para la salud grave directo:
Las categoras 13, 14 y 15
a) Brucella
b) Clostridium botulinum A, B, E y F
c) Clostridium perfringens tipo C
d) Shigella disenteriae
e) Vibrio cholerae O1
f) Virus de la hepatitis A
g) E. coli enterohemorrgico O 157:H7
h) Salmonella typhi
i) Salmonella paratyphi A, B y C
2.5 INDICACIONES PARA EL MUESTREO
Las razones principales que llevan a la toma de muestra son:
Para controlar la calidad y establecer la vida til.
Para controlar la higiene durante la produccin y las tcnicas de manipulacin
Cuando se sospecha que el alimento es la responsable de la toxi-infecciones
alimentarias o como consecuencia de denuncias de los consumidores.
La mayora de las de las pruebas de control de calidad se realizan a peticin del
fabricante, interesado en demostrar la calidad de su producto.
2.6 MUESTRA NO REPRESENTATIVA
Se toma con fines de investigacin en laboratorio, utilizando la tcnica de muestreo casual y en
cantidades mnimas. Esta muestra se toma con la finalidad de: prevenir infracciones de la ley.
Cuando se muestrean en locales de produccin, en las diferentes fases de transformacin como
en producto terminado que aun no est comercializado o puede estar en comercio.
Tambin se realiza con la finalidad de apoyar a los productores a mejorar la calidad de los
alimentos y preservar al mismo tiempo la salud pblica.
Estas muestras no representan o no reflejan las caractersticas del lote. Sera un error escoger de
un lote solo la muestras deteriorada, el inspector tambin debe escoger muestras buenas.
2.7 MUESTRA REPRESENTATIVA
Se ejecuta muestreos representativos solo en casos particulares, esto es cuando despus de un
control previo surgen algunas dudas como la calidad de la partida o lote.
La toma de muestra representativa puede ser motivada principalmente por razones de carcter
higinico sanitario o para determinar la calidad del producto. Estas muestras representan
reflejan las caractersticas del lote.
2.8 TCNICAS DE MUESTREO SEGN EL TIPO DE MUESTRA
2.8.1 Toma de muestra de Productos a granel
Para productos ensacados o a granel el plan de muestreo se aplica de acuerdo a la
tabla 3. Cuando el producto es homogneo es preciso utilizar una sonda caladora
para tomar las muestras del saco seleccionado. Cuando los productos no son
homogneos es necesario extender el producto en el suelo y mezclar al azar para
obtener una capa uniforme. La muestra se debe obtener de 5 puntos diferentes como
mnimo. Deben ser tomadas aspticamente, usando contenedores y utensilios
estriles y debidamente protegidos contra las contaminaciones externas, adems
estas deben ser mantenidas en condiciones que no permitan la multiplicacin o
destruccin de la microflora original presente.
2.8.2 Toma de muestra de Productos Acondicionados
Es necesario tomar las muestras de acuerdo a la tabla N 2, que toma en
consideracin el peso del embalaje y el tamao del lote, permitiendo as la toma de
muestra representativa.
Las muestras deben tomarse al azar de la parte superior, central y de la base,
evitando que la muestra sea de un solo lugar.
Por ejemplo si tenemos un lote constituido por 1,200 cajas, que contiene cada uno
12 latas de 1 kg, para calcular el nmero total de unidades tenemos: 1,200 x 12 =
14,400 unidades, con este nmero se busca en la tabla N 2 el nmero de muestras a
recolectar, en la tabla se observa 13 unidades.



Cuadro N 2 Cantidad mnima de muestras para anlisis
Tipo de alimento Cantidad
Cereales
Harinas
Masa alimentara
Pan
Pasteles y kekes
Aceite
Grasa hidrogenadas
Cacao
Chocolate
Leche
1,000 g
1,000 g
1,000 g
1,000 g
300 g
1,000 g
1,000 g
200 g
200 g
1 L
Leche en polvo
Pudn
Helado
Vinos
Cerveza
Vinagre
Licores
Refrescos
Miel
Caf
Frutas, hortalizas frescas
Jugos
Carne fresca
Carne en conserva y embutidos
Conserva
500 g
250 g
200 g
1 L
1 L
1 L
750 g
1 L
250 g
250 g

500 ml.
250 g
250 g
1,000 g

Fuente: Direccin General de Salud Ambiental









Cuadro N 3 Plan de muestreo para productos acondicionados
Tamao de lote (N) Tamao de la muestra (N)
Peso neto igual o menor de 1
kg
4,800 o menos
4,801- 24,000
24,001- 48,000
48,001-84,000
48,001-114,000
84,000-240,000
144,001-240,000

6
13
21
29
38
48
60
Peso neto mayor de 1K pero
menor de 4.5K
2,400 o menos
2,401 15,000
15,00 24,000
24,000 42,000
42,000 72,000
72,000 120,000
Mas de 120,000


6
13
21
29
38
48
60
Peso neto mayor de 4.5 K

600 o menos
601 2,000
2,001 7,200
7,001 15,000
15,001 24,000
24,001- 42,000
Ms de 42,000


6
13
21
29
38
48
60
Fuente Direccin General de Salud Ambiental DIGESA

Cuadro N 4 Plan de muestreo para productos en sacos
N Total de sacos N de sacos para
colectar la muestra
Cantidad de cada
muestra primaria
(K)
Cantidad de
muestra
global (K)
Cantidad de muestra
definitiva (K)

1-50
51-55
56-60
61-65
66-70
71-75
76-80
81-85
86-90
91-95
96-100
101-150
151-500
501-2500
2501-5000
5001-7000
7001-8000
8001-10000

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
30
40
50
70
80
90
100

200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200

2
2
2.4
2.6
3
3
3
3.4
3.6
4
4
6
8
10
14
16
18
20

2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

Fuente: Direccin General de Salud Ambiental DIGESA
2.8.3 Muestreo de Alimentos de Venta Ambulatoria
La toma de muestra se realizara considerando a los productos de mayor riesgo
epidemiolgico, de acuerdo a los productos de mayor preferencia por los consumidores.
Entre los alimentos considerados de alto riesgo para la salud del consumidor son aquellos
con excesiva manipulacin, ejemplo ceviche de pescado, mariscos, ensaladas de verduras,
salsa, aj a base de queso, carnes, leches, refrescos, etc.
La cantidad de muestra a recogerse deber ser de 100 a 200 g ml. La recoleccin de la
muestra se debe llevar a cabo en las mismas condiciones en que es distribuido en el punto
de venta. Deben ser recolectadas en frascos, en bolsas estriles y debidamente identificadas,
deben acondicionarse en cajas refrigerantes con paquete de hielo. El transporte de las
muestras al laboratorio deber efectuarse en el menor tiempo posible.
De acuerdo al tipo de estudio que se est realizando ser necesario llenar formularios con
datos del lugar de muestreo, de los manipuladores, entre los datos del alimento se debe
considerar los siguientes datos:
La hora en que fue preparada
Tiempo aproximado de exposicin del alimento
Temperatura aproximada a la que se ha mantenido
Fecha y hora de muestreo
Lugar de recoleccin de la muestra.
2.9 ALIMENTOS DE MAYOR RIESGO EN SALUD PBLICA
Carne, productos crnicos y sus preparados.
Leche y derivados lcteos.
Productos de la pesca y sus derivados.
Productos preparados a base de huevo.
Alimentos de baja acidez empacados en envases sellados hermticamente (pH > 4.5).
Alimentos o comidas preparados de origen animal listos para el consumo.
Agua envasada.
Alimentos infantiles.
2.10 TRANSPORTE DE MUESTRAS
Para obtener resultados microbiolgicos confiables, la muestra debe ser examinada a la
brevedad posible y debe cumplir los siguientes requisitos:
Si no se procesa de inmediato la muestra debe mantenerse a temperatura baja de 6
o
C en
cajas trmicas para su transporte.
Si las muestras son enviadas de lejos, la muestra debe ser tomada en material estril y
enviada en caja trmica u otro material resistente que permita mantener temperaturas
inferiores a 10
o
C y convenientemente acondicionada para evitar la ruptura de los frascos.
2.11 METODOS DE ENSAYO
Con el fin de que los resultados deben comprables y reproducibles, los mtodos de ensayo
utilizados en cada una de las determinaciones deben ser mtodos internacionales o nacionales
normalizados, reconocidos y acreditados por el organismo nacional de acreditacin
2.12 REPORTE DE ENSAYO
Los informes de ensayo, certificados de anlisis y otra forma de reporte emitidos por los
laboratorios, debern indicar los mtodos de anlisis empleados y la expresin de resultados
acorde con el mtodo debe expresarse en UFC/g, UFC/mL, NMP/g, NMP/mL, NMP/100 mL,
Ausencia o presencia/25 g o mL.
III. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
Bolsa de polietileno estril o de primer uso de 30 x 15 cm
Frascos de muestreo con tapa rosca estriles de 250 ml de capacidad
Caldo peptonado bufferado.
Guantes descartables
Papel toalla
Plumones de tinta indeleble de punta gruesa
Etiquetas
Precinto de seguridad
Tarjetas de identificacin
Guantes descartables
Cajas conservadoras con paquete de hielo
3.2 MTODOS
3.2.1 Procedimiento para el muestreo de alimentos
Para realizar esta actividad tambin es necesario la concurrencia de 2
muestreadores y se procede de la siguiente forma:
Uno de los muestreadores con guantes descartables abre la bolsa
Hacer que el manipulador introduzca las 2 manos dentro de la bolsa
El otro muestreador va echando el caldo peptonado finamente para que el
manipulador lave sus manos.
El lquido de lavado se recupera en el mismo frasco del medio de cultivo
Identificar la muestra colocando la etiqueta de identificacin y tomar nota del
precinto de seguridad. Anotar los datos de inters.
Las muestras de alimentos preparados deben ser transportados al laboratorio en
cajas conservadoras de hielo para evitar su deterioro.

3.2.2 Muestreo de Superficies Inertes
El muestreador con guantes descartables toma los hisopos
Empapar o embeber bien los hisopos en el caldo peptonado bufferado para lavar
las superficies a muestrear.
En el caso que superficies planas realizar el hisopado con movimientos de
arriba abajo, con movimientos transversales, diagonalmente y finalmente con
movimiento circular y levantar todo el lquido, exprimiendo constantemente el
hisopo dentro del frasco.
Colocar el hisopo contaminado dentro del frasco con el medio de cultivo
Cerrar el frasco, identificar la muestra colocando la etiqueta de identificacin,
paralelamente al muestreo se deben anotar todos los datos de inters.


PRACTICA N 3
EVALUACIN MICROBIOLGICA DE SUPERFICIES VIVAS E
INERTES

I. OBJETIVOS
Evaluar la calidad microbiolgica de superficies inertes (tabla de picar)
Evaluar la calidad microbiolgica de manos de manipuladores de alimentos
II. FUNDAMENTO TERICO
Sea por mtodos rpidos o convencionales, los ensayos microbiolgicos se realizan
utilizando mtodos normalizados por organismos internacionales como la Organizacin
Internacional para la Estandarizacin (ISO). Mtodos Oficiales de Anlisis de la
Asociacin Internacional de Qumicos Analticos Oficiales (AOAC), as como la Comisin
Internacional de Especificaciones Microbiolgicas para Alimentos (ICMSF), entre otros,
utilizando la tcnica de recuento en placa.
El procedimiento para seleccionar muestras debe estar en funcin de los riesgos sanitarios
relacionados a las diferentes etapas de la cadena alimentaria, sea la de fabricacin, la
elaboracin y/o expendio. Las evaluaciones microbiolgicas de superficies considera a los
indicadores de higiene como los Coliformes totales y Staphylococcus aureus. Tambin se
considera patgenos como Salmonella sp. Vibrio Cholerae en caso signifiquen un peligro
para el proceso.
2.1 MUESTREO DE SUPERFICIES
a.- Superficies inertes
Se seleccionan aquellas que estn o tendrn contacto directo con los alimentos, que no sern
sometidos a un proceso trmico posterior u otro que disminuye la carga microbiana.
b.- Superficies vivas
Se seleccionaran las manos de los manipuladores, con o sin guantes que estn en contacto con los
alimentos destinados al consumo humano.
Se debe seleccionar el mtodo de muestreo que debe estar en funcin de las caractersticas de las
superficies a muestrear.
2.2 MTODOS DE MUESTREO
a.- Mtodo del hisopo
Se utiliza en superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla de picar, bandejas, mesas de
trabajo, utensilios, cuchillas de equipos, cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas
transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos, paredes y otros.
b.- Mtodo de esponja
Se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor rea.
c.- Mtodo del enjuague
Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeos o para el muestreo de superficies
interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc.
2.3 PARMETROS PERMISIBLES
Cuadro N 5 Lmites microbiolgicos permisibles
SUPERFICIES
Mtodo de
enjuague
Superficies Vivas Superficies inertes
Ensayo Limite de
deteccin
mtodo
Limite
permisible
Limite de
deteccin mtodo
Limite
permisible
Coliformes totales < 100
ufc/manos
< 100
ufc/manos
< 25 ufc/super.
Muestra
< 25 ufc/super.
Muestra
Staphylococcus
aureus
< 100
ufc/manos
< 100
ufc/manos
----- -------
Patgenos Ausencia manos Ausencia
manos
Ausencia Ausencia
Fuente: Direccin General de Salud Ambiental - DIGESA
III. MATERIALES Y MTODOS
3.1 MATERIALES
Hisopos de almidn u otro material equivalente de largo aproximado 12 cm.
Esponja estril de poliuretano o de celulosa de 5 cm x 5 cm
Plantilla estril con un rea abierta en el centro de 5cm x 5 cm
Frasco con tapa rosca de 250 ml con 100 ml de solucin diluyente
Pinzas estriles
Bolsas de polietileno de primer uso
Tubo de ensayo con tapa hermtica de 10 ml.
Solucin diluyente estril
Plantilla estril con un rea abierta en el centro de 100 cm
2
(10 cm x10cm) o
alternativamente, plantilla estril con un rea abierta en el centro de 25 cm
2
(5cm x 5 cm).
Guantes descartables de primer uso
Caja trmica
Refrigerantes
3.2 METODOS
3.2.1 Procedimiento para la toma de muestra
a.- Mtodo del hisopo
Colocar la plantilla 10 cm x 10 cm sobre la superficie a muestrear.
Humedecer el hisopo, en la solucin diluyente y presionar ligeramente en la pared del
tubo con un movimiento de rotacin para quitar el exceso de solucin.
Con el hisopo inclinado en un ngulo de 30 frotar 4 veces la superficie delimitada por
la plantilla. Asegurar el hisopado en toda la superficie.
En el caso de utilizar la superficie de 5 cm x 5 cm repetir esta operacin tres veces ms,
en lugares diferentes de la misma superficie para obtener 100 cm
2
.
Colocar el hisopo en el tubo con la solucin diluyente, quebrando la parte de hisopo que
estuvo en contacto con los dedos del muestreador.
Para superficies irregulares en el caso de utensilios, se repetir la operacin con 3
utensilios ms (total 4 como mximo) con el hisopo considerando el rea que est en
contacto con el alimento o con la boca.
b.- Mtodo de esponja
Procedimiento
Retirar la esponja de su envoltura con la pinza estril o con guantes descartables
Humedecer la esponja con la solucin diluyente estril
En condiciones aspticas frotar vigorosamente el rea a muestrear, en el caso de
superficies regulares frotar el rea delimitada por la plantilla y en superficies irregulares
frotar abarcando la mayor cantidad de superficie.
Colocar la esponja en el frasco con el resto de la solucin diluyente o alternativamente
colocar en una bolsa con diluyente.
c.- Mtodo de enjuague para manos de manipuladores
El mtodo consiste en realizar un enjuague (botellas frascos, utensilios) o inmersin
(manos, objetos pequeos) en una solucin diluyente.
Vaciar el diluyente del frasco (100ml) en una bolsa plstica de primer uso.
Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la mueca
Solicitar al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente alrededor
de las uas y la palma de las manos, adicionalmente el muestreador deber realizar la
misma operacin a travs de las paredes de la bolsa.
Luego de retirar las manos se regresa el lquido al frasco o se anuda la bolsa y esta se
coloca en otra bolsa para que quede segura.
3.2.3 Clculo y expresin de resultados
Para superficies vivas, el numero de colonias obtenidas (ufc) se multiplicar por el
factor de dilucin y por el volumen de la solucin diluyente utilizando en el
muestreo (100ml).
Para objetos pequeos o para el muestreo de superficies interiores de envases,
botellas, bolas de plstico, entre otros el nmero de colonias obtenidas se multiplica
por el factor de dilucin y por el volumen de solucin diluyente y se divide entre las
4 superficies muestreadas.
Los resultados se expresaran:
Para superficies vivas: ufc/manos
Para superficies inertes: ufc/superficie muestreada (envase, botellas)
IV. RESULTADOS
Describir los resultados con tablas, ilustraciones y/o grficos, reportar la
variabilidad microbiana presente en manos de manipuladores y superficies de los
utensilios. Reportar la numeracin de microorganismos indicadores de la mala higiene
en manos y superficie inerte.
V. CONCLUSIONES
En directa relacin a los objetivos, es decir para cada objetivo una respuesta puntual
VI. DISCUSIONES
Interpreta y explica los resultados en forma amplia con sustento bibliogrfico y
antecedentes referidos al ensayo.

PRCTICA N 4
NUMERACIN DE MICROORGANISMO MESFILOS AEROBIOS VIABLES EN
ALIMENTOS NO FERMENTABLES

I. OBJETIVOS

Realice el flujo de operaciones para la numeracin de Microorganismos Mesfilos Aerobios
Viables.
Realice la tcnica de siembra por incorporacin en el medio Plate Count la muestra de alimento
previamente diluido.
Realiza el clculo y reporte de resultados para rechazar o aceptar el producto

II. FUNDAMENTO TERICO

Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento, esta prueba
permite determinar la calidad del alimento, los microorganismos mesfilos aerobios viables se
consideran como indicadores de las caractersticas higinicas generales del alimento. En general se
investiga la presencia de microorganismos aerobios, anaerobios facultativos; aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios
totales, coliformes, mesfilos aerobios, mohos y levaduras, etc.
III. MATERIALES Y MTODOS
3.1 MATERIALES
Medios de cultivo:
Agar plate count
Agua peptonada
Reactivos y medios de confirmacin
TTC (2,3,5 trifenil tetrazolium chloride)

3.2 METODOS
Ver Apndice 1 (Diagrama del flujo de operaciones, ISO 4833:2003)