El colágeno es la proteína estructural más abundante en los animales. Se compone de tres cadenas polipeptídicas que forman una super hélice filiforme. Las características clave son su longitud, rigidez y estructura helicoidal trimérica. El colágeno tipo I forma fibrillas que son el componente principal de la piel. La comprensión de la estructura y propiedades del colágeno guiará el desarrollo de materiales de colágeno artificiales.
El colágeno es la proteína estructural más abundante en los animales. Se compone de tres cadenas polipeptídicas que forman una super hélice filiforme. Las características clave son su longitud, rigidez y estructura helicoidal trimérica. El colágeno tipo I forma fibrillas que son el componente principal de la piel. La comprensión de la estructura y propiedades del colágeno guiará el desarrollo de materiales de colágeno artificiales.
El colágeno es la proteína estructural más abundante en los animales. Se compone de tres cadenas polipeptídicas que forman una super hélice filiforme. Las características clave son su longitud, rigidez y estructura helicoidal trimérica. El colágeno tipo I forma fibrillas que son el componente principal de la piel. La comprensión de la estructura y propiedades del colágeno guiará el desarrollo de materiales de colágeno artificiales.
RESUMEN El colgeno es la protena ms abundante en los animales. Esta protena fibrosa estructural comprende un ovillo dextrgiro de tres hlices paralelas y levgiras de poliprolina tipo II. Se han realizado grandes avances para establecer la estructura de triple hlice del colgeno y las bases fsico-qumicas para su estabilidad. Nuevas evidencias muestras que los efectos estereoelectrnicos y su preorganizacin juegan un papel clave en que la estabilidad. La estructura fibrilar de colgeno de tipo I-el prototipo de fibrillas de colgeno-se ha revelado en detalle. Fibrillas de colgeno artificial que muestran algunas de las propiedades de las fibrillas de colgeno natural son accesibles a travs de sntesis qumica y de auto-ensamblaje. Una comprensin rpidamente emergente de las propiedades mecnicas y estructurales de las fibrillas de colgeno nativas guiar an ms el desarrollo de materiales de colgeno artificiales para la biomedicina y la nanotecnologa. INTRODUCCIN El colgeno es una protena estructural abundante en todos los animales. En los seres humanos, el colgeno comprende el equivalente a un tercio de las protenas totales, representa tres cuartas partes del peso seco de la piel, y es el componente ms prevalente de la matriz extracelular (ECM). Veintiocho tipos diferentes de colgeno compuestas de al menos 46 cadenas de polipptidos distintas han sido identificados en los vertebrados, y muchas otras protenas contienen dominios de colgeno. Notablemente, colgeno intacto ha sido descubierto en tejidos blandos de huesos fosilizados de un fsil de Tyranosaurus rex de 68 millones de aos (3, 4), por mucho es la protena ms vieja descubierta hasta el momento. La caracterstica definitoria de colgeno es un motivo estructural en el que tres cadenas polipeptdicas paralelas en conformacin helicoidal levgira de poliprolina Tipo II (PPII) se enrollan una sobre otra para formar una triple hlice dextrgira (Figura 1). El apretado embalaje de PPII hlices triples dentro de la hlice hace que cada tercer residuo sea Gly, lo que resulta en una secuencia de repeticin de XaaYaaGly, donde Xaa y Yaa puede ser cualquier aminocido. Esta repeticin se produce en todos los tipos de colgeno, a pesar de que se interrumpe en ciertos lugares dentro del dominio de triple hlice de colgeno no fibrilar (8). Los aminocidos en las posiciones Xaa Yaa y de colgeno son a menudo (2S)-prolina (Pro, 28%) y (2S, 4R) - 4-hidroxiprolina (Hyp, 38%), respectivamente. ProHypGly es el triplete ms comn (10,5%) en colgeno (9). En los animales, triples hlices individuales de colgeno, conocidas como tropocolgeno (TC), se renen en una manera compleja, jerrquica que en ltima instancia conduce a las fibras macroscpicas y redes observadas en tejidos, hueso, y membranas basales (Figura 2).
1 ECM: matriz extracelular PPII: poliprolina tipo II Hyp: (2S, 4R) -4 - hidroxiprolina Tropocolgeno (TC): Triple hlice de colgeno monomrico despus de la protelisis de propptidos de colgeno
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Figura 1: Revisin de la triple hlice de colgeno. (a) primera estructura cristalizada de la triple hlice de colgeno, formada de (ProHypGly)4(ProHypAla)(ProHypGly)5. b) Vista inferior del eje de una triple hlice de colgeno (ProProGly)10, con las tres cadenas que aparecen en las representaciones espacio-relleno (esferas), bola y varilla y cinta. c) Modelo de bola-varilla de un segmento de la triple hlice de colgeno destacando la escalera de puentes de hidrgeno intercatenarios. d) Modelo de las tres cadenas del segmento del panel c.
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Figura 2: Ruta biosinttica de las fibras de colgeno (110), que son el componente principal de la piel. El tamao y la complejidad se incrementa por modificaciones posteriores a la traduccin y al autoensamblaje. La oxidacin de las cadenas laterales de lisina conduce a la formacin espontnea de enlaces cruzados desmosina e isodesmosina. Las caractersticas fundamentales de las molculas de colgeno son su longitud, su rigidez y su estructura helicoida trimrica en la cual tres polipptidos de colgeno, denominados cadenas a se enrollan sobre s mismos formando una super hlice filiforme (19-62)
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Estructura de una molcula tpica de colgeno. (A) Modelo de una regin de una cadena a de colgena en la que cada aminocido est representado por una esfera. La cadena contiene alrededor de 1000 residuos de aminocidos y est estructurada como una hlice levgira de tres residuos de aminocido por vuelta, de los que el tercero es una glicina. Por lo tanto, cada cadena a est constituida por secuencias Gly-X-Y, donde X y Y pueden ser cualquier aminocido (aunque habitualmente X es una prolina y Y una hidroxiprolina). (B) Modelo de una zona de la molcula de colgeno en la que las tres cadenas a, cada una de ellas representada en un color distinto, estn enrolladas entre si dando lugar a una triple hlice. La glicina es el nico aminocido lo bastante pequeo para ocupar la pequea regin central de la triple hlice. Slo se muestra una pequea parte de la molcula, ya que su longitud total es de unos 300 nm de longitud. Los colgenos son muy ricos en prolina y glicina, las cuales son importantes en la formacin la hlice trimrica. Gracias a su estructura anular, la prolina estabiliza la conformacin helicoidal en cada una de las cadenas a, mientras que la glicina se encuentra espaciada regularmente, cada tres residuos de aminocido, a lo largo de la regin central de las cadenas a. Al ser el aminocido ms pequeo (slo tiene un tomo de hidrgeno como cadena lateral, la glicina favorece un denso empaquetamiento de las tres cadenas a formando la superhlice de colgena.
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Las categoras de colgeno incluyen la clsica formacin fibrilar y los colgenos formadores de redes, los FACITs (colgenos asociados a fibras con triples hlices interrumpidas), MACITs (colgenos asociados a la membrana con triples
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hlices interrumpidas) y MULTIPLEXINAS (mltiples dominios de triple hlice e interrupciones . Los tipos de colgeno, su distribucin, composicin, y patologas se enumeran en la Tabla 1. Es de destacar que, a pesar de que las tres cadenas de polipptidos en triple hlice de cada tipo de colgeno pueden ser idnticas, las triples hlices heterotrimricas son ms frecuentes que las triples hlices homotrimricas.
ESTRUCTURA DE LA TRIPLE HLICE DE COLGENO En 1955, estructura triple helicoidal aceptada hoy en da, que tiene un solo puente de hidrgeno intercatenario N-H (Gly) O == C (Xaa) por tripleta. (Figura 1).
Los estudios de difraccin de fibra no pueden revelar la estructura de colgeno a resolucin atmica. Exacerbando esta dificultad, el tamao grande, insolubilidad, secuencia repetitiva, y la estructura jerrquica compleja de colgeno nativo frustra la mayora de los anlisis bioqumicos y biofsicos. Por lo tanto, un enfoque reduccionista usando pptidos relacionados con colgeno triple helicoidal (CRP) se han utilizado ampliamente desde finales de los aos 1960.
En 1994, Berman y colaboradores (19) informaron de la primera estructura cristalina de alta resolucin de ununa triple hlice de PCR (Figura 1a). Esta estructura ha confirmado la existencia de puentes de hidrgeno intercatenarios N-H (Gly) O == C (Xaa) (Figura 1c, d) y proporcion informacin adicional, incluido que puentes de hidrgeno entre el C- H (Gly / Yaa) O == C (Xaa / Gly) podran igualmente estabilizar la triple hlice (20). Usando CRP y cristalografa de rayos X, se observ el efecto estructural de una sola sustitucin de Gly Ala (19), se analizaron los efectos de los residuos vecinos cargados en una triple hlice (21), y una interaccin instantnea de la de un triple-helicoidal PCR con el dominio I de la integrina 21 se obtuvo (Figura 3) (22).
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Figura 3. Estructuras cristalinas de las triple hlices de colgeno. (a) Impacto de una sustitucin sustitucin Ala Gly en la estructura de una triple hlice de colgeno formado a partir del pptido relacionado con colgeno (PCR) (ProHypGly) 4 - (ProHypAla) - (ProHypGly) 5. Los residuos de Ala (rojo) alteran la estructura. Las mutaciones que conducen a tales irregularidades estructurales son comunes en la osteognesis imperfecta (OI 2 ) y pueden ser letales. (b) Representacin del efecto de una sola tripleta GluLysGly en el empaquetamiento de una triple hlice de CRP vecina en forma cristalina (ProHypGly) 4 - (GluLysGly) - (ProHypGly) 5 , el escalonamiento axial de las triples hlices individuales, presumiblemente obligado por interacciones de Coulomb nocivas entre residuos cargados, es una reminiscencia de la estructura D- peridica de las fibrillas de colgeno. Interacciones similares podran contribuir a la morfologa de las fibrillas de colgeno. (c) Triple hlice de CRP que contiene el dominio de unin a integrina GFOGER en complejo con el dominio I de la integrina 21. Se cree que la curva en la triple hlice surge de la interaccin protena-protena. Un residuo de Glu en la mitad de la cadena de la triple hlice se une al cobalto (II), del dominio I de la integrina 21.
ENTENDIMIENTO Y ESTABILIDAD DE LA ESTRUCTURA DE LA TRIPLE HLICE La importancia vital de colgeno como estructura de soporte en animales exige una multiplicidad de caractersticas esenciales. Estas caractersticas incluyen estabilidad trmica, resistencia mecnica, y la capacidad de participar en interacciones especficas con otras biomolculas. La comprensin de cmo tales propiedades se derivan de la unidad estructural fundamental de colgeno-la triple hlice-exige un amplio conocimiento de los mecanismos que subyacen en la estructura de triple hlice y de su estabilidad.
2 IO: Osteognesis Imperfecta
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Interacciones de Puentes de Hidrgeno La ubicuidad del colgeno hace de la escalera de recurrentes enlaces de hidrgeno NH(Gly)O==C(Xaa) que se forman en la triple hlice (Figura 1 c,d) el ms abundante enlace de hidrgeno amida-amida en el reino animal. Reemplazando un enlace amida Yaa-Gly por un ster en un CRP hospedador-husped (Figura 4a, b) permitiendo estimar la fuerza de cada enlace de hidrgeno amida-amida en G o =2.0 kcal/mol (30). Otros autores emplearon otras tcnicas experimentales para evaluar este mismo parmetro, estimando la fuerza de cada enlace de hidrgeno amida-amida dentro de un CRP poli (GlyProPro) en G o = 1.8 kcal/mol y dentro del colgeno nativo en G o =1.4 kcal/mol.
Figura 4: Importancia de los enlaces de hidrgeno intercatenarios para la estabilidad de la triple hlice de colgeno (a) Un segmento de una triple hlice (ProProGly) 10. (b) Comparacin de la estabilidad de una triple hlice formada a partir de (ProProGly) 4-ProProOGly-(ProProGly) 5, en el que un enlace amida Gly-Pro se sustituye con un ster, con lo que en el panel a revela que cada enlace de hidrgeno intercatenario contribuye G = -2,0 kcal / mol a la estabilidad de una triple hlice (30). (c) Estructura cristalina de una triple hlice formada a partir de un pptido relacionado con colgeno que imita una secuencia comn en colgeno de tipo IV, (GlyProHyp)3 - (3S-HypHypGly) 2 - (GlyProHyp) 4, mostrando que 3S- Hyp en la posicin Xaa produce una triple hlice de colgeno prototpica. (d) (2S, 3S)-3-Fluoroprolina en la posicin Xaa desestabiliza una triple hlice del colgeno, tal vez mediante la retirada de la densidad electrnica desde el carbonilo Xaa proximal y reduciendo de este modo la fuerza del enlace de hidrgeno intercatenario (79).
Sustituciones de Glycina Numerosas enfermedades relacionadas con el colgeno se asocian con mutaciones tanto en dominios triple helicoidales como en notriple-helicoidales de varios colgenos (Tabla 1). El residuo Gly en la repeticin XaaYaaGly es invariable en el colgeno natural, y se desconocen sustituciones favorables en CRP (33). Un estudio computacional sugiri que la
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sustitucin de los residuos de Gly de colgeno con D-alanina o D-serina podra estabilizar la triple hlice (34) y que por lo tanto que los residuos de Gly en el colgeno eran sustitutos de los D-aminocidos no naturales. Datos experimentales posteriores demostraron, sin embargo, que esta aseveracin era errnea (35).
Muchas de las mutaciones ms perjudiciales para los genes de colgeno dan como resultado la sustitucin de un residuo Gly dentro de la triple hlice (Figura 1c, d). Tanto la identidad del aminocido que reemplaza la Gly como la ubicacin de la sustitucin, puede afectar la patologa, por ejemplo, la osteognesis imperfecta (OI) (33, 36). Sustituciones de Gly en porciones ricas en prolina de la secuencia de colgeno (Figura 3a) son mucho menos perjudiciales que los de las regiones pobres en prolina, lo cual recalca la importancia de los derivados Pro para la nucleacin de triple hlice (37). In vivo, triples hlices se pliegan de manera N-terminal C-terminal (38). El tiempo entre la interrupcin del plegado de la triple hlice por una sustitucin de Gly y la renucleation del proceso de plegado N-terminal al sitio de sustitucin, es mucho ms corto que la nucleacin dela triple hlice, cuando secuencias ricas en prolina estn cerca al sitio de sustitucin N- terminal (37). Cualquier retraso en el plegado de la triple hlice resulta en sobremodificacin de las cadenas protocolgeno [en particular, la hidroxilacin excesiva de residuos de Lys N-terminal a la sustitucin de Gly y glicosilacin excesiva de los residuos de hidroxilisina resultantes (Figura 2)], desestabilizando la estructura de triple hlice y contribuyendo a la gravedad de esta enfermedad (39). Por lo tanto, la gravedad de esta enfermedad se correlaciona con la abundancia de nucleacin de triple hlice, secuencias ricas en prolina cerca al sitio de sustitucin N- terminal (36).
Prolinas en posiciones Xaa y Yaa En las cadenas de colgeno humano, ~ 22% de todos los residuos son Pro o Hyp (9). La abundancia de estos residuos preorganiza las cadenas individuales en una conformacin PPII, disminuyendo de ese modo el costo entrpico para el plegado de colgeno (40). A pesar de sus propiedades estabilizantes, los derivados Pro tambin tienen ciertas consecuencias perjudiciales para el plegado y estabilidad de la triple hlice que compensa parcialmente sus efectos favorables. Por ejemplo, Pro tiene un grupo amino secundario y forma amidas terciarias dentro de un pptido o protena. Las amidas terciarias tienen una poblacin significativa tanto de ismeros trans como de cis ismeros (Figura 5), mientras que todos los enlaces peptdicos en el colgeno son trans. Por lo tanto, antes de que una cadena (ProHypGly)n pueda plegarse en una triple hlice, todos los enlaces peptdicos cis deben isomerizarse a trans. N- Methylalanine (una amida acclica, terciaria carente nicamente de Pro de C
) disminuye la estabilidad de triple hlice,
en sustitucin de Pro o Hyp en CRP, presumiblemente debido a que carece de la preorganization debido al anillo de pirrolidina de derivados Pro (41). En contraste, evitando el problema de la isomerizacin cistrans por completo mediante la sustitucin de un enlace amida Gly-Pro con un isstero alqueno trans-bloqueado tambin conlleva a la desestabilizacin de la triple hlice, a pesar de dejar intactos todos los enlaces de hidrgeno intercatenarios (42). Claramente, los factores que dictan la estructura y estabilidad de la triple hlice estn entrelazados de una manera compleja (vase ms adelante).
Figura 5: Pro isomerizacin cis-trans. A diferencia de otros aminocidos proteinognicos, La Pro forma enlaces amida terciarios, lo que resulta en una poblacin significativa de la conformacin cis. Pgina 10
Residuos de Pro en la posicin Yaa de tripletas protocolgeno son modificados por la prolil 4 - hidroxilasa (P4H), una enzima de hierro no hemo que cataliza la hidroxilacin postraduccional y estereoselectivad de residuos Pro del carbono -carbono no activado en la posicin Yaa de secuencias de colgeno para formar Hyp (Figura 6). Se requiere la actividad P4H para la viabilidad del nemtodo Caenorhabditis elegans y del ratn Mus musculus (43, 44). Por lo tanto, Hyp es esencial para la formacin de colgeno de sonido en vivo.
Figura 6: Reaccin catalizada por la prolyl 4-hydroxilasa (P4H). Residues Pro en la posicin Yaa de la cadena de colgeno son convertidos a Hyp antes de la formacin de la triple hlice.
Papel de Hyp La hidroxilacin de los residuos de Pro en posicin Yaa de la triple hlice de colgeno aumenta drsticamente la estabilidad trmica de triples hlices (Tabla 2). Esta estabilizacin se produce cuando la Hyp resultante est en la posicin Yaa (45, 46), pero no en la posicin Xaa, ni cuando el grupo hidroxilo est instalado en la configuracin 4S como en (2S, 4S)-4-hidroxiprolina (HYP) (Tabla 2) (47, 48). Estos hallazgos llevaron a la propuesta de que la configuracin 4R de un grupo hidroxilo prolilo es privilegiada solamente por permitir la formacin de enlaces de hidrgeno agua que unen la triple hlice plegada (49). En efecto, dichos puentes de agua entre Hyp y heterotomos de la cadena principal fueron observados por Berman y colaboradores (19, 50) en sus estudios de cristalografa de rayos X seminales de CRP. La frecuencia de Hyp en la mayora de colgeno natural es, sin embargo, insuficiente para soportar una amplia red de puentes de agua. Por ejemplo, cuatro o ms tradas repetidas de Xaa-Hyp-Gly se producen slo dos veces en la secuencia de aminocidos del colgeno tipo I humano. Pgina 11
Los valores de Tm dependen tanto de la concentracin de CRPs como de la tasa de calentamiento. Por tanto, comparaciones detalladas requieren del conocimiento de procedimientos experimentales.
La hiptesis de que los puentes de agua observados en triple hlices cristalinas (ProHypGly) n son significativos se puso a prueba mediante la sustitucin de residuos de Hyp en CRP con (2S, 4R) -4 - fluoroproline (FLP). Como los grupos fluoro no forman enlaces de hidrgeno fuertes (51), los puentes de agua no pueden jugar un papel importante en la estabilizacin de una triple hlice (ProFlpGly) 10. No obstante, triples hlices (ProFlpGly) 10 son hiperestable (Tabla 2) (52, 53). En consecuencia, los puentes de agua no deben ser de importancia fundamental para la estabilidad. Cmo, entonces, la hidroxilacin 4R de residuos de Pro en posicin Yaa estabilizan la triple hlice?
3 Efecto gauche. Sustituyendo Hyp en la posicin Yaa con (2S, 4S)-4-fluoroproline (FLP), un diasteremero de Flp, se previene la formacin de una triple hlice (Tabla 2) (54). Este descubrimiento de que la estereoqumica de los sustituyentes electronegativos en la posicin 4 del anillo de Pro es importante para la formacin de triples hlices estables sugiere que FLP y Hyp en la posicin Yaa estabilizan la triple hlice de colgeno a travs de un efecto estereoelectrnico, en lugar de un efecto inductivo sencillo (54 ). Pro y sus derivados prefieren uno de los dos principales pliegues cclicos de pirrolidina, que se denominan C exo-y C -endo (Figura 7). [El anillo en realidad prefiere
3 Hyp: (2S,4S )-4-hydroxyproline Flp: (2S,4R)-4-fluoroproline flp: (2S,4S )-4-fluoroproline Efecto estereoelctrico: Relacin entre estructura, conformacin, energa, y reactividad que resulta del alineamiento u ocupacin de orbitales electrnicos. Pgina 12
dos giros distintos, en lugar de la conformacin de envoltura (55). Como C experimenta un gran desplazamiento hacia fuera del plano en los anillos entrelazados, nos referimos al pliegue del anillo pirrolidina simplemente como C exo-y C- endo.]
La Pro en s tiene una ligera preferencia por el pliegue C-endo (Tabla 3) (56). Un atributo clave de un grupo fluoro 4R en La Pro (as como el grupo hidroxilo 4R natural) es su imposicin de un pliegue C-exo en el anillo de pirrolidina a travs del efecto gauche (Figura 8a, b) (56-58). El pliegue del anillo C-exo preorganiza los principales ngulos de torsin de la cadena (, C i-1-Ni-C i-i C; , Ni-C i-Ci-Ni +1, y , i-C C? i-Ni +1- Ci 1) a aquellos en la posicin Yaa de una triple hlice (Tabla 4). Por lo tanto, la hidroxilacin -4R de los residuos de Pro en la posicin Yaa de de la triple hlice de colgeno estabiliza la triple hlice a travs de un efecto estereoelectrnico. FLP es ms estabilizador de Hyp porque fluorina (F = 4,0) es ms electronegativo que el oxgeno (O = 3,5), y un grupo fluoro (FF = 0,45) manifiesta un mayor efecto inductivo que el del grupo hidroxilo (FOH = 0,33). Por lo tanto, un grupo fluoro 4R fuerza el plegamiento del anillo C-exo de un derivado de Pro con ms fuerza que lo que lo hara un grupo hidroxilo 4R.
Figura 7: Conformaciones en anillo de derivados Pro y Pro. La conformacin C-endo se favorece fuertemente por los efectos estereoelectrnicos cuando R1 = H, R2 = F (flp) o Cl (clp), y por efectos estricos cuando R1 = Me (MEP) o SH (mcp), R2 = H. La conformacin C-exo se favorece fuertemente por los efectos estereoelectrnicos cuando R1 = OH (Hyp), F (flp), OMe (Mop), o Cl (Clp), R2 = H, y por efectos estricos cuando R1 = H, R2 = Me (Mep) o SH (Mcp). La relacin C-endo: C- exo es ~ 2 cuando R1 = R2 = H (56).
Tabla 3 Conformacin de Pro y sus derivados 4-sustituidos que prefieren la posicin Xaa * = -75 , = 164 (7)+ en una triple hlice del colgeno. a. A partir de clculos DFT. b. Los valores de y (aqu, de Ni-C i-c'i Oi-1) son de la Pgina 13
estructura cristalina de Ac-Pro-OMe, que tiene un enlace peptdico cis. c. Valores de Ktrans / cis (figura 5) se determinaron en solucin por espectroscopa de RMN.
Tabla 4 Conformacin de los derivados de Pro 4-sustituidos que prefieren la posicin Yaa * = -60 , = 152 (7)+ en una triple hlice del colgeno. a. A partir de clculos DFT. b. Los valores de y (aqu, de Ni-C i-c'i Oi-1) son de la estructura cristalina de Ac-Yaa-OMe, que tiene un enlace peptdico cis. c. Valores de Ktrans / cis (figura 5) se determinaron en solucin por espectroscopa de RMN.
Para investigar adems el papel de Hyp en la estabilidad del colgeno, un residuo (2S, 4R)-4-methoxyproline (Mop) se incorpor a la posicin de Yaa de un CRP (ProYaaGly) 10 (59). O-metilacin es quizs la ms simple modificacin covalente posible de un residuo Hyp y reduce el grado de hidratacin sin alterar significativamente la capacidad de retirada de electrones del sustituyente 4R. En consecuencia, los residuos Mop e Hyp tienen conformaciones similares (Tabla 4). Curiosamente, la reduccin de la hidratacin de (ProHypGly) 10 por metilacin de residuos Hyp mejora significativamente la estabilidad de la triple hlice (Tabla 2). Por otra parte, la alquilacin con grupos funcionales ms grandes que un grupo metilo no necesariamente perturban la estabilidad de triple hlice (60). Notablemente, residuos (2S, 4R) -4 - cloroprolina (Clp) tambin estabilizan la triple hlice en la posicin Yaa (Tabla 2) (61). Como Flp, Clp tiene una fuerte preferencia por el anillo C-exo, una triple hlice (ProClpGly) 10 es entonces ms estable que una triple hlice (ProProGly) 10. Por lo tanto, una gran cantidad de datos indican que el grupo hidroxilo de Hyp estabiliza el colgeno a travs de un efecto estereoelectrnico. Puentes de agua proporcionan poca (si alguna) ventaja neta termodinmico al colgeno natural (59).
Sorprendentemente, una CRP hospedador-husped de la forma AcGly-(ProHypGly) 3-ProFlpGly-(Pro HypGly) 4-GlyNH2 en realidad forma una triple hlice menos estable que AcGly-(ProHypGly) 8 - GlyNH2 (62). Por el contrario, un CRP hospedador-husped de la forma (GlyProHyp) 3 GlyProFlp-Gly-ValCys GlyAspLys-GlyAsnPro-GlyTrpPro-GlyAlaPro- (GlyProHyp) 4-NH2 forma una triple hlice ms estable que uno que contiene Hyp en lugar de Flp (63 ). Estos resultados sugieren que un grupo fluoro podra interrumpir la hidratacin inducida por una larga cadena de residuos Hyp. Pgina 14
Kobayashi y colaboradores (64) utilizaron la calorimetra diferencial de barrido para demostrar que triples hlices (ProHypGly) 10 se estabilizan por entalpa, mientras que triples hlices (ProFlpGly) 10 se estabilizan por la entropa. Estos resultados son consistentes con que Hyp disminuye el costo entrpico para el plegado a travs de la preorganizacin de la cadena principal, pero aumentando el costo por hidratacin especfica. Esta interpretacin est de acuerdo con la estabilidad de triples hlices (ProMopGly) 10 que surgen de una contribucin casi igual de entalpa y entropa (59).
Efecto estrico Sustituyentes electronegativos en anillos Pro no son el nico medio de hacer un anillo plegado ventajoso. El anillo Pro plegado tambin puede ser inducido por efectos estricos, como en (2S, 4S)-4-metilprolina (Mep) (65) y (2S, 4R)-4- mercaptoproline (Mpc) (Figura 7) (66). El sustituyente 4-metil de Mep prefiere la orientacin seudoecuatorial y por lo tanto induce el anillo plegado C-exo de Pro (se observaron resultados anlogos para Mpc) (Tabla 4). En efecto, triples hlices formadas a partir de (ProMepGly) 7 tienen una estabilidad similar a los formados a partir de (ProHypGly) 7 (Tabla 2) (65).
Derivados de prolina en posicin Xaa El anillo plegado C-exo de residuos de Pro en la posicin Yaa mejora la estabilidad de la triple hlice. Del mismo modo, el anillo plegado de Pro en la posicin Xaa es importante para la estabilidad de la triple hlice. Tpicamente, los residuos de Pro en la posicin Xaa del colgeno biolgico no estn hidroxilados y por lo general muestran el anillo plegado C- endo (67). Mediante el empleo de sustituyentes C, tanto el efecto gauche como los efectos estricos pueden estar disponibles para la preorganizacin del anillo plegado C-endo (Figuras 7 y 8). Cuando se instalan residuos de flp, (2S, 4S)-4-cloroprolina (clp), o (2S, 4R)-4-metilprolina (mep) (todos los cuales prefieren el anillo plegado C-endo) (Tabla 3) en posicin Xaa de colgeno hay estabilizacin a Pro, pero la instalacin de Flp, Clp, o Hyp (que prefieren anillo plegado C-exo) tiene efecto desestabilizador (Tabla 2) (61, 65, 68-70). Estos resultados sugieren que la preorganizacin del anillo plegado C-endo en la posicin Xaa de CRP estabiliza triples hlices. Esta conclusin es razonable porque los derivados Pro con anillo plegado C-endo tienen ngulos de torsin y de la cadena principal similares a los observados en la posicin Xaa de triples hlices (Tabla 3).
En particular, reemplazando Pro en posicin Xaa de (ProProGly) 10 con hyip, un derivado Pro que, como flp y clp, deberan preferir el anillo plegado C-endo por efecto gauche, produce CRP que no forman triples hlices (Tabla 2) (47). Este resultado anmalo para hyp en la posicin Xaa podra ser atribuible a hidratacin deletrea, preferencias conformacionales idiosincrticas de residuos de hyp, o ambos (71).
El colgeno tipo IV, que es el componente principal de las membranas basales, tiene una alta incidencia de (2S, 3S)-3- hidroxiprolina (Hyp-3S) en la posicin Xaa (72). Esta modificacin est presente en algunos otros tipos de colgeno y en colgenos de invertebrados. 3S-Hyp, que prefiere un anillo plegao C-endo (73), se introduce casi exclusivamente dentro de tripletas ProHypGly a travs de la modificacin postraduccional de cadenas de colgeno individuales por prolil 3- hidroxilasa (P3H), que es distinta de P4H (74). Una forma recesiva de OI se asocia con una deficiencia P3H (75, 76). Ciertas mutaciones en el gen que codifica la protena asociada al cartlago, una protena P3H ayudadora, previene la 3S- hidroxilacin de 1 (I) Pro986, as como la 3S-hidroxilacin de algn otro residuo de Pro en posicin Xaa, lo que resulta en un fenotipo casi idntico a la OI clsica. La base subyacente de la importancia de 3S-hidroxilacin de 1 (I) Pro986 no es clara, pero podra implicar menores tasas de secrecin de triple hlice (76). La sustitucin de Pro con 3S-Hyp en la posicin Xaa de CRP puede mejorar la estabilidad de la triple hlice (73, 77). Una estructura cristalina de una triple hlice que contiene sustituciones 3S-Hyp revela el mantenimiento de la estructura de triple hlice prototpica y la ausencia de interacciones estricas desfavorables (Figura 4c) (78). En contraste, la sustitucin de 3SHyp con (2S, 3S)-3-fluoroprolina Pgina 15
desestabiliza la triple hlice notablemente, posiblemente debido a un efecto inductivo a travs de enlaces que disminuye la capacidad de su oxgeno de la cadena principal para aceptar un enlace de hidrgeno (Figura 4d) (79 ).
Interaccin n Un principio general en el diseo de CRP es que los residuos de Pro , ya sea con un anillo plegado C - endo o C - exo estabilizarn triples hlices en posiciones Xaa y Yaa , respectivamente ( Tablas 2-4 ) . El anillo plegado adecuado, inducido por efecto estereoelectrnico o estrico , preorganiza los ngulos de torsin la y a los requeridos para la formacin de una triple hlice.
Curiosamente , la estabilidad de una triple hlice ( flpProGly ) 7 o ( clpProGly ) 10 es significativamente menor que la de una triple hlice ( ProFlpGly ) 7 o ( ProClpGly ) 10, respectivamente ( Tabla 2 ) ( 61 , 68 ) . Del mismo modo , una triple hlice ( mepProGly ) 7 es menos estable que una triple hlice ( ProMepGly ) 7 ( Tabla 2 ) ( 65 ) . Dos factores contribuyen a la baja estabilidad de triples hlices formadas a partir de CRP con derivados Pro estabilizados sustituidos en la posicin Xaa ms que en la Yaa . En primer lugar, un anillo plegado C - endo ya se ve favorecido en Pro ( 56 ) ; flp , clp , y mep apenas mejoran esa preferencia ( Tabla 3 ) . En contraste, Flp , Clp , Hyp , and Mep tienen el efecto ms dramtico en la inversin del anillo plegado preferido de Pro , aliviando en gran medida la falta entrpica para la formacin de triple hlice ( Tabla 4 ) . En segundo lugar, Flp , Clp , y Mep en la posicin Yaa causa preorganizacin favorable de los tres principales ngulos de torsin de la cadena ( , , y ) ( Tabla 4 ) . Por el contrario, flp , clp y mep tienen una baja probabilidad de adoptar un enlace peptdico trans ( = 180 ) ( 54 , 61, 65 ) con respecto a Pro ( Tabla 3 ) , mitigando as el beneficio acumulado de preorganizacin apropiada de y . En particular, estudios con C- RMN sobre el colgeno in vitro demuestran que el 16 % de enlaces Gly - Pro en el colgeno no plegado estn en conformacin cis, mientras que slo el 8 % de los enlaces Xaa - Hyp son cis, una observacin que confirma el efecto de sustitucin C en la conformacin del enlace peptdico precedente ( 80 ) .
Cmo afecta el efecto de un sustituyente 4 -X en el anillo plegado Pro influencia la constante de equilibrio de isomerizacin del enlace peptdico (K trans/cis) (Figura 5 y Tablas 3 y 4)? La explicacin se debe a otro efecto estereoelectrnico: una interaccin n * (56, 81). En una interaccin n *, el oxgeno de un enlace peptdico (Oi - 1) dona electrones desde sus pares solitarios en el orbital antienlazante del carbonilo en el enlace peptdico subsiguiente (Ci`= Oi ) ( Figura 8c , d ) . El anillo plegado C -exo de un residuo de Pro proporciona una distancia ms favorable Oi- 1. . . Ci `= Oi y un ngulo para interaccin n * que el anillo plegado C - endo (56 ) . Es importante destacar que, Ktrans / cis para los enlaces peptidil prolil amida es determinada por el anillo plegado de pirrolidina y en general no se ve afectada por la identidad de los sustituyentes en la posicin 4 del anillo de pirrolidina ( 82 ) . Debido a que una interaccin n * puede ocurrir slo si el enlace peptdico que contiene Oi- 1 es trans, la interaccin n * tiene un impacto sobre el valor de Ktrans / cis de cadenas principales con ngulos de torsin apropiados (Tabla 4). Por lo tanto, la imposicin de un anillo plegado C - exo en un anillo de pirrolidina en la posicin Yaa de un CRP preorganiza no slo los ngulos a y para la formacin de la triple hlice, sino tambin el ngulo . De hecho, una sola interaccin n * puede estabilizar la conformacin trans por G = -0,7 kcal / mol (81, 83).
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Figura 8: Efectos estereoelectrnicos que estabilizan la triple hlice del colgeno. (a) Un efecto gauche y una interaccin n * preorganizan los ngulos de torsin de la cadena principal y mejoran la estabilidad de una triple hlice. (b) Un efecto gauche, provocada por un grupo aceptor de electrones (EWG) en la posicin 4R, estabiliza el anillo plegado C-exo. (c) una interaccin n * estabiliza el ismero trans del enlace peptdico, pero es sustancial slo cuando son derivados Pro en el anillo plegado C-exo (por ejemplo, R1 = OH o F, R2 = H). (d) Representacin de superposicin entre orbitales de enlace naturales n y * bonos en un residuo Pro con plegado C-exo.
Hyp en posicin Xaa En posicin Xaa, un residuo Pro con plegado C-endo generalmente estabiliza la triple hlice, mientras que uno con plegado C-exo desestabiliza una triple hlice. Por ejemplo, triples hlices (HypProGly) n son mucho menos estables que triples hlices (ProProGly) n (Tabla 2) (84), porque Hyp prefiere el anillo plegado C exo-y por lo tanto preorganiza los ngulos de torsin y incorrectamente para la posicin Xaa de una triple hlice de colgeno (Tabla 4). Sorprendentemente, triples hlices (HypHypGly) 10 son en realidad ligeramente ms estables que triples hlices (ProHypGly) 10 (Tabla 2) (85, 86) a pesar de los residuos de Hyp en la posicin Xaa de (HypHypGly) 10 con anillo plegado C-exo en la triple hlice (87, 88). Es de destacar que las estructuras cristalinas de (HypHypGly) 10 muestran que los ngulos de torsin en la posicin Xaa de la cadena principal de una triple hlice (HypHypGly) n se ajustan para acomodar un anillo plegado C-exo en esa posicin (87, 88).
El hallazgo de que Hyp puede estabilizar triples hlices en la posicin Xaa de manera dependiente del contexto se presagiaba en un estudio realizado por Gruskin (89) con base en la sustitucin global de Hyp por Pro en polipptidos de colgeno tipo I recombinante que formaron triples hlices estables. En particular, Hyp se encuentra en la posicin Xaa del colgeno de algunos invertebrados (90) y puede ser aceptable en CRP en los que el residuo en posicin Yaa no es Pro (86, 91, 92). Berisio y colaboradores (93) han sugerido que triples hlices (HypHypGly) 10 podran ser hiperestable s debido a interacciones dipolo-dipolo intercatenarias entre enlaces proximales C-OH de residuos Hyp adyacentes. Kobayashi y colaboradores (87) han propuesto que la estabilidad de triples hlices (HypHypGly) 10 es atribuible al alto nivel de hidratacin de las cadenas de pptidos en el estado espiral individual antes de la formacin de triple hlice, lo que podra reducir el costo entrpico de formacin de puentes de agua. Es probable que una combinacin de estos factores sea responsable de esta anomala.
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Triples Hlices Sintticas Heterotrimricas
Tanto flp y Flp mejoran en gran medida la estabilidad de la triple hlice cuando estn en posicin Xaa y Yaa , respectivamente . No obstante , ( flpFlpGly ) n forma triples hlices mucho menos estables que ( ProProGly ) n ( Tabla 2 ) ( 79 , 94 ) . En tales una hlices, los tomos de flor de residuos FLP y Flp en hebras alternantes seran proximales, y los dipolos C - F interactuaran desfavorablemente (Figura 9a ) ( 79 ) . Estas interacciones estricas y electrnicas negativas presuntamente comprometen la estabilidad de triple hlice a pesar de la preorganizacin adecuada de los ngulos de torsin de la cadena principale. Esta hiptesis fue confirmada por otros dos hallazgos. En primer lugar, una triple hlice ( clpClpGly ) 10 ni siquiera se forma a 4 C, mientras que una triple hlice ( flpFlpGly ) 10 tiene Tm = 30 C ( Tabla 2 ) ( 61 , 94 ) . El choque estrico entre tomos de cloro de residuos opuestos clp y Clp se ve agravada por el gran tamao del cloro con respecto al flor ( Figura 9b ) . En segundo lugar, triples hlices (mepMepGly ) 7 son ms estables que los correspondientes CRP mono sustituidos , ( mepProGly ) y 7 ( ProMepGly ) 7 (Tabla 2 ) . Los grupos 4 - metilo sobresalen radialmente desde la triple hlice (Figura 9c) y por lo tanto no pueden interactuar perjudicialmente entre s ( 65 ) .
Figura 9: Triples hlices heterotrimricas de colgeno sinttico. (a-c) Enfoque estrico. Modelos de espacio-relleno (esferas) de segmentos de triple hlice construidos a partir de la estructura de una triple hlice (ProHypGly) n [AP entrada 1cag (19)] con el programa SYBYL (Tripos, St. Louis, MO). En el panel a, rF F = 2,4 en una triple hlice (flpFlpGly) n (79). En el panel b, rCL Cl = 1,9 (61) en una triple hlice (clpClpGly) n. En el panel c, los grupos metilo en una triple hlice (mepMepGly) n son radiales y distales. (d) El enfoque de Coulomb. Interacciones Coulombicas favorables dirigen el ensamblaje preferencial de triples hlices que tienen una relacin 1:1:1 de (ProLysGly)10 :(AspHypGly) 10: (ProHypGly) 10 (96).
Los efectos estricos y estereoelectrnicos sobre la estabilidad de triple hlice manifestados en los CRP (flpFlpGly) 7 proporcionan, por primera vez, un medio para generar triples hlices heterotrimricas no-covalentemente unidas y con Pgina 18
estequiometra definida. El anlisis de secciones transversales de triple hlice sugiri que una triple hlice compuesta de (flpFlpGly ) 7 : ( ProProGly ) 7 , ya sea en relacin de 1:2 2:1 podra ser estable , en la medida en que la presencia de algunos residuos de Pro en posiciones l Xaa y Yaa eliminara las interacciones estricas deletreas entre los residuos de flor en cadenas opuestas . Una proporcin (flpFlpGly ) 7 : ( ProProGly ) 7 de 2:1 dio estabilidad a las triples hlices, demostrando el primer ensamblaje heterotrimrico de hlices triples con estequiometra controlada ( 79) y sugiriendo la posibilidad de desarrollar un "cdigo" para el ensamblaje de triples hlices siguiendo las lneas del cdigo de Watson- Crick para el ensamblaje de ADN .
Gauba y Hartgerink ( 95 ) desarrollaron una estrategia alternativa que emplea interacciones de Coulomb para guiar el ensamblaje de triples hlices heterotrimricas . Ellos observaron que una mezcla 1:1:1 (ProArgGly ) 10 : (GluHypGly ) 10 : ( ProHypGly ) 10 produca triples hlices que contenan una cargada negativamente , otra positivamente , y un CRP neutro. Curiosamente , triples hlices (ProLysGly ) 10 : ( AspHypGly ) 10 : ( ProHypGly ) 10 tienen un valor de Tm similar a la de un homotrmero ( ProHypGly ) 10 , a pesar de que, como es sabido, Asp y Lys desestabilizan significativamente la triple hlice con respecto a Pro y Hyp (Figura 9d ) . Este hallazgo demuestra la utilidad de las interacciones de Coulomb para la estabilizacin de triples hlices (96 ) .
Heterotrmeros de colgeno sinttico son imitadores atractivos de cadenas naturales de colgeno, en la medida en que la mayora de los tipos de colgeno son en s mismos heterotrmeros (Tabla 1). Gauba y Hartgerink (97) emplearon el mtodo de Coulomb para generar variantes imitadoras de colgeno tipo I que llevan a la OI. En concreto, estudiaron la estabilidad de heterotrmeros triple helicoidales que contienan uno, dos, o tres sustituciones Ser Gly. Ellos observaron que una sustitucin Gly Ser en una o dos cadenas no era tan debilitante para la estabilidad y el plegamiento de triple hlice como lo era la sustitucin Gly Ser en las tres cadenas.
Sustituciones diferentes a prolina en las posiciones Xaa y Yaa Brodsky (9) determinan la frecuencia de aparicin de todos los posibles tripptidos en un conjunto de secuencias de colgeno fibrilar y no fibrilar. Slo unos pocos de los 400 posibles tripletes formados a partir de los 20 aminocidos naturales se observan en el colgeno. Adicionalmente, examinaron la incorporacin de todos los 20 aminocidos comunes en las posiciones el Xaa y Yaa de CRP utilizando un modelo de hospedador-husped en el que un solo triplete XaaYaaGly se coloca dentro de un CRP (ProProGly) n o (ProHypGly) n (98 ). Estos estudios hospedador-husped revelaron una correlacin entre la propensin de un residuo particular, a adoptar una conformacin PPII y su contribucin a la estabilidad de una triple hlice (98). En particular, Arg en la posicin Yaa confiere estabilidad de triple hlice similar a la de Hyp (99). Los residuos de aminocidos aromticos Trp, Phe, Tyr son fuertemente desestabilizadores de la triple hlice (98), aunque la base estructural para esta desestabilizacin es poco clara. Brodsky (100) utilizan sus datos en CRP hospedador-husped para desarrollar un algoritmo que permita el clculo a priori del efecto de sustituciones Xaa y Yaa en la estabilidad de triple hlice. ESTRUCTURA DE COLGENO DE ORDEN SUPERIOR 4
In vivo, el colgeno tiene una estructura jerrquica (Figura 2). Monmeros de TC individuales se auto-ensamblan para formar las fibras macromoleculares que son componentes esenciales de los tejidos y los huesos. Los procesos de autoensamblaje que participan en fibrilognesis del colgeno son de enorme importancia en patologas de la ECM y para
4 Auto-ensamblaje: Proceso en el cual, interacciones locales especficas entre los componentes desordenados conducen a una estructura organizada, sin direccin externa. Fibrilognesis de Colgeno: Proceso de ensamblaje de monmeros de tropocolgeno en fibrillas maduras. Pgina 19
el adecuado desarrollo de los animales (vase el recuadro "Evitando la agregacin" para una discusin de cmo el autoensamblaje de colgeno podra conducir a agregacin de protenas nocivas).
Estructura fibrilar 5
Hay muchas clases de estructuras de colgeno en la ECM, incluyendo fibrillas, redes y dominios de colgeno transmembrana. Por razones de brevedad, nos centramos aqu en fibrillas compuestas principalmente de colgeno tipo I.
Los monmeros TC de colgeno tipo I tienen la propiedad nica de estar realmente inestables a temperatura corporal (101); esto es que, la conformacin espiral aleatoria es la preferida. Cmo pueden estructuras tisulares estables formarse a partir de una protena inestable? La respuesta debe ser que la fibrilognesis de colgeno tiene un efecto estabilizador sobre las triples hlices. Adems, el ensamblaje de estructuras macromoleculares fuertes es esencial para que el colgeno pueda soportar el estrs en una, dos y tres dimensiones (102). La importancia de la fibrilognesis del colgeno se ve subrayada por la conclusin de Kadler (103) de que los principios fundamentales que subyacen a la formacin de algunos tipos de fibrillas modernas de colgeno se establecieron en por lo menos 500 Mya.
La fibrilognesis de colgeno in situ se produce a travs del ensamblaje de segmentos de fibrillas de tamao intermedio, llamadas microfibrillas (Figura 2) (104). Por lo tanto, hay dos cuestiones importantes para entender la estructura molecular de la fibrilla de colgeno. En primer lugar, cul es la disposicin de los monmeros individuales de TC dentro del microfibrilla? En segundo lugar, Cul es la disposicin de las microfibrillas individuales dentro de la fibrilla de colgeno? Estas preguntas han sido difciles de responder, ya que microfibrillas naturales individuales no son aislables y el gran tamao y la insolubilidad de las fibrillas de colgeno maduro impiden el uso de tcnicas de determinacin estructural estndares.
Las fibrillas de colgeno formadas principalmente de colgeno tipo I (todos los tejidos fibrosos, excepto cartlago) y fibrillas formadas principalmente de colgeno tipo II (cartlago) tienen estructuras ligeramente diferentes. Aunque nos centramos nicamente en las fibrillas de colgeno de tipo I, datos recientes han permitido la determinacin de la estructura fibrilar del cartlago a resolucin intermedia (~ 4 nm). Esta estructura sugiere que las fibrillas de colgeno del cartlago tienen un 10 + 4 de estructura microfibrilar heterotpica - lo que significa que la superficie de fibrillas presentan diez microfibrillas igualmente espaciadas y que hay cuatro microfibrillas igualmente espaciadas en el ncleo de la fibrilla ( 105 ) .
Las fibrillas de colgeno de tipo I en el tendn son de hasta 1 cm de largo (106) y un mximo de ~ 500 nm de dimetro. Una triple hlice individual en el colgeno tipo I es <2 nm de dimetro y ~ 300 nm de longitud. Claramente, la fibrilognesis en una escala extraordinaria es necesaria para lograr las dimensiones estructurales de las fibrillas naturales de colgeno. El rasgo ms caracterstico de las fibrillas de colgeno es que son D - peridicas con D = 67 nm. La estructura de bandas observada en imgenes de microscopa electrnica de transmisin (TEM ) de fibrillas de colgeno se produce debido a que la longitud real de un TC monmero no es un mltiplo exacto de D, pero L = 4.46D , resulta en
5 D-Periodicidad: El escalonamiento axial de las molculas adyacentes de tropocolgeno por una distancia, D, que es la suma de la brecha y regiones sobrepuestas Telopptidos del colgeno: N-y C-terminal de dominios no triple helicoidales de 11 - a 26-residuos de cadenas de tropocolgeno involucrados en fibrilognesis y entrecruzamiento Procolgeno: Forma hidroxilada de colgeno antes de la escisin de propptido de colgeno Propptidos de colgeno: N-y C-terminal de dominios no triple helicoidales de cadenas de colgeno que direccionan el plegamiento de la triple hlice antes de la fibrilognesis Pgina 20
espacios de 0.54D y sobrelapamientos de 0.46D ( Figura 2 ) . Esta disposicin regular de espacios y de regiones que se sobreponen debe tenerse en cuenta en los modelos estructurales de fibrilla y microfibrillas de colgeno.
La propuesta inicial de la estructura tridimensional de colgeno fibrilar era un modelo estructural simplificado de microfibrillas de colgeno expuestas por Hodge y Petruska (107) en 1963. Su modelo consiste en una pila de dos dimensiones en la que cinco monmeros de TC dentro de una microfibrilla se sobreponen D = 67 nm entre cadenas vecinas (Figura 2) . Este modelo ha demostrado que las molculas de colgeno que forman las microfibrillas se sobreponen linealmente, en tal forma que dejan pequeos huecos de secuencia definida maduro (Estudios por TEM y microscopa de fuerza atmica -AFM 6 ). Muchos grupos de investigacin han intentado determinar la estructura tridimensional de las fibras de colgeno tipo I en una resolucin ms alta. Numerosos modelos se han propuesto para explicar las caractersticas observadas mediante las tcnicas de difraccin de fibra y de TEM y AFM de dichas fibrillas ( 108-111 ) . Los investigadores en general estn de acuerdo en una unidad cuasi - hexagonal con cinco monmeros de TC como base de un modelo preciso de la fibrilla de colgeno, pero los detalles importantes estaban en controversia. Hallazgos recientes indican que la estructura controversial de las fibrillas est ce. Ca de ser resuelta.
En 2001, Orgel (112, 113) report el primer mapa de densidad electrnica de fibras de colgeno tipo I en resolucin anisotrpica molecular (axial: 5,16 ; lateral: 11,1 ) utilizando radiacin sincrotrn (La radiacin de sincrotrn es la radiacin electromagntica generada por partculas cargadas (tales como electrones) que se mueven segn una trayectoria curva a alta velocidad (una fraccin apreciable de la velocidad de la luz) en un campo magntico. Cuanto ms rpido se mueven los electrones, ms corta es la longitud de onda de la radiacin). Sus datos confirman que las microfibrillas de colgeno tienen una unidad celular cuasi-hexagonal. El empaquetamiento molecular de los monmeros de TC en este modelo resulta en vecinos de TC dispuestos para formar microfibrillas supertrenzadas, dextrgiras que entrelazan con las microfibrillas vecinas, dando lugar a la estructura en espiral del colgeno fibrilar maduro ( 113 ). El modelo promueve la idea de que la fibrilla de colgeno es una cuerda red a nivel de nano-escala idea tambin sugerida por los estudios de AFM de Bozec (111).
Orgel determina la ubicacin axial de la N - telopptidos 7 de colgeno N y C-terminales y encontraron que telopptidos vecinos dentro de un monmero de TC interactan unos con otros y son entrecruzados covalentemente despus de la accin de la lisil oxidasa ( 114 ) . Los puentes pueden estar tanto dentro como entre las microfibras. Curiosamente, la naturaleza de la microfibrillas supertrenzadas de colgeno se mantiene a travs de las regiones telopeptdicas no helicoidales ( 113 ) .
6 TEM: Microscopa Electrnica de Transmisin AFM: Microscopa de Fuerza Atmica 7 Telopptido: Es un pptido terminal no helicoidal de una cadena de colgeno. Los Telopptidos tienen un grupo carboxilo (c- telopptido) o amino (N-telopptido) en su extremo terminal. Los Telopptidos se unen entre s o con pptidos de la regin helicoidal de la molcula de colgeno mediante puentes de piridolina o desoxipiridolina. Su medicin en orina indica resorcin sea. Pgina 21
Este nuevo modelo de la fibrilla de colgeno de tipo I explica el fracaso de los investigadores anteriores para aislar microfibrillas de colgeno individuales a partir de muestras de tejido: La microfibrillas se entrelazaban y reticulaban, evitando as la separacin intacta entre ellas. El nuevo modelo tambin justifica la observacin de que el CT en fibrillas es mucho ms resistente a la protelisis de colgeno por metaloproteinasa 1 de matriz (MMP-1 ) que es TC monomrico ; la fibrilla de colgeno protege regiones vulnerables a la protelisis por MMP1 . Se requiere protelisis del telopptido C-terminal de TC en una fibrilla antes de MMP1 puede tener acceso al sitio de escisin de un monmero de TC (115).
Nucleacin y modulacin de la fibrilognesis de colgeno
La fibrilognesis de colgeno requiere la realizacin de dos etapas de auto-ensamblaje: nucleacin y crecimiento de la fibra. La fibrilognesis del colgeno comienza slo despus de que procolgeno N-y C- proteinasas escinden los propptidos de colgeno en cada triple hlice terminal para generar monmeros de TC. Los propptidos C-terminales son esenciales para la formacin de la triple hlice adecuada pero impiden la fibrilognesis (116). Despus de la escisin de los propptidos, los monmeros de TC se componen de un dominio de triple hlice larga que consiste en una secuencia de repeticin de XaaYaaGly rodeada por telopptidos cortos, notriple-helicoidales (Figura 2).
Los telopptidos C-terminales de TC son importantes para el inicio de la adecuada fibrilognesis. Prockop y Fertala (117) sugirieron que el auto-ensamblaje de colgeno en fibrillas era impulsado por la interaccin de telopptidos C-terminales con sitios especficos de unin en los monmeros de la triple hlice. La adicin de imitadores sintticos de telopptidos puede inhibir la fibrilognesis del colgeno, presumiblemente mediante la prevencin de la interaccin entre los telopptidos de colgeno y monmeros de TC. Triples hlices que carecen de los telopptidos pueden, sin embargo, ensamblarse en fibrillas con morfologa adecuada (118). Por lo tanto, los telopptidos de colgeno podran acelerar el ensamblaje de fibrillas y establecer el registro apropiado dentro de microfibrillas y fibrillas, pero pueden no ser esenciales para la fibrilognesis.
Los telopptidos de colgeno tienen una segunda funcin en la estabilizacin de fibrillas de colgeno maduro. Cadenas laterales de Lys en los telopptidos son entrecruzadas despus del ensamblaje de las fibrillas, formando enlaces de desmosina e isodesmosina entre Lys y residuos de hidroxilisina con la ayuda de lisil oxidasa (Figura 2) (119). El proceso de entrecruzamiento aporta a las fibrillas de colgeno maduro fuerza y estabilidad, pero no est implicado en la fibrilognesis. Por lo tanto, a pesar de que los telopptidos de colgeno pueden no ser esenciales para la nucleacin, su Pgina 22
ausencia debilita en gran medida las fibrillas maduras debido a la falta de enlaces cruzados dentro y entre las triple hlices (119).
PROPIEDADES MECNICAS DE LAS FIBRILLAS DE COLGENO
La naturaleza jerrquica de la estructura de colgeno tericamente permite la evaluacin de las propiedades mecnicas del colgeno en diferentes niveles de complejidad estructural, incluyendo el monmero TC, fibrillas de colgeno individuales, y las fibras de colgeno. Tal vez la mayora de los estudios de las propiedades mecnicas del colgeno se han obtenido mediante el estudio de monmeros de CT y de las fibrillas formadas a partir de colgeno de tipo I. Los investigadores han empleado diversas tcnicas biofsicas y tericas en los ltimos 20 aos, y los ltimos avances en la metodologa AFM han permitido evaluaciones ms refinadas.
En 2006, Buehler estima la resistencia a la fractura de un monmero TC en 11 GPa , que es significativamente mayor que la de una fibrilla de colgeno ( 0,5 GPa ) ( 102 ) . Esta diferencia es razonable, dado que la fractura de un monmero TC requiere desintegracin de la triple hlice y en ltima instancia, la ruptura de enlaces covalentes, mientras que la fractura de una fibrilla no requiere necesariamente la ruptura de los enlaces covalentes. Para la comparacin, la resistencia a la traccin del colgeno en el tendn se estima en 100 MPa ( 120 ) .
El mdulo de Young (El mdulo de Young o mdulo de elasticidad longitudinal es un parmetro que caracteriza el comportamiento de un material elstico, segn la direccin en la que se aplica una fuerza ) de un monmero de TC es E = 6-7 GPa ( 102 , 121 ) , mientras que las mediciones con AFM muestran que fibrillas deshidratadas de colgeno tipo I de tendn de Aquiles bovino ( 122 ) y de tendn de cola de rata ( 123 ) tienen E 5 GPa y E 11 GPa , respectivamente . Debido a que las fibrillas de colgeno son anisotrpicas, el mdulo de torsin (que es una medida de la rigidez) es tambin una medida importante de la fuerza de una fibrilla de colgeno. En 2008, AFM revel que fibrillas deshidratadas de colgeno de tipo I de tendn de Aquiles bovino tienen G = 33 MPa (124) . La hidratacin de estas fibrillas reduce su mdulo de torsin significativamente, mientras que la reticulacin mediada por carbodiimida aument el mdulo de torsin. Es de destacar que cierto nivel de reticulacin es favorable para las propiedades mecnicas de las fibrillas de colgeno, pero excesiva reticulacin resulta en fibrillas de colgeno extremadamente frgiles (102) , un sntoma comn de envejecimiento .
Un anlisis por Buehler ( 102 ) de las propiedades mecnicas de las fibrillas de colgeno sugiere que la naturaleza ha seleccionado una longitud para el monmero de TC que maximiza la robustez de la fibrilla de colgeno ensamblada a travs de la disipacin de energa eficiente . Las simulaciones indican que los monmeros TC ms largos o ms cortos de ~ 300 nm (que es la longitud de una triple hlice colgeno de tipo I) formaran fibrillas de colgeno con propiedades mecnicas menos favorables.
BIOMATERIALES COLAGENOSOS
Las investigaciones sobre estructura y estabilidad de triples hlices de colgeno se han centrado en triples hlices de extremos romos compuestas de (XaaYaaGly) n 10 CRP. Estas triples hlices cortas, aunque valiosas para los estudios dirigidos a la comprensin de la base fsico-qumica de la estructura y estabilidad de la triple hlice, no son tiles para muchas aplicaciones potenciales de biomaterial debido a su pequeo tamao, que no se acerca a la escala de las fibras de colgeno naturales (Figura 2).
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El colgeno bovino es fcilmente disponible til para algunos propsitos biomdicos, pero desafortunadamente se caracteriza por heterogeneidad, inmunogenicidad potencial, y prdida de la integridad estructural durante el proceso de aislamiento. Una fuente recombinante o sinttica eficiente de colgeno podra evitar estas complicaciones. La produccin heterloga de colgeno se hace problemtica debido a la dificultad de incorporar modificaciones postraduccionales, como la que conduce a los residuos Hyp esenciales (Figura 6), y requiere de sistemas de expresin de complejos (125). Estos desafos ponen de relieve la necesidad sintetizar fuentes de protenas y fibrillas semejantes al colgeno.
Sntesis qumica de colgeno
Los primeros enfoques a largas triple hlices de colgeno sinttico se basaron en la condensacin (126 , 127 ) o uniones qumicas de CRP cortos ( 127 ) . Curiosamente, soluciones acuosas concentradas de (ProHypGly ) 10 auto-ensamblan en fibrillas altamente ramificadas ( 128 ) . Brodsky ( 129 ) han demostrado que la tasa de auto-ensamblaje de ( ProHypGly ) 10 y la morfologa de las fibrillas resultantes son dependientes de la secuencia . CRP que contienen una sola sustitucin Pro Ala o Pro Leu muestran autoensamblaje ms lento; la morfologa fibrilar puede ser modificada por una sustitucin Gly Ser, o impedida mediante una sola sustitucin Gly Ala o sustituciones globales Hyp Pro. En cualquier caso, las estructuras de orden superior formadas por autoensablaje de ( ProHypGly ) 10 y CRP no ensamblan fibrillas de colgeno natural .
Largas triple hlices de colgeno se han preparado mediante el uso de un diseo que aprovecha la propensin intrnseca de las hebras individuales de PCR para formar triples hlices. Especficamente, enlaces entre cistinas dentro de fragmentos cortos de colgeno se utilizaron para establecer cadenas individuales de colgeno de tal manera que terminaciones cortas y " pegajosas " preorganizadas para su posterior formacin de triple hlice se evidenciaron al final de cada segmento monomrico triple helicoidal ( Figura 10a ) ( 130 , 131 ) . El auto-ensamblaje de estos fragmentos cortos de triple hlice, fue mediado por la asociacin de los extremos pegajosos, resultando en conjuntos de colgeno de 400 nm - significativamente ms largos que los monmeros TC naturales (131). Koide (132) utiliza este sistema para preparar geles de colgeno - con aplicaciones potenciales como biomateriales.
Maryanoff ( 133 ) desarroll otro enfoque para triples hlices largas , uno que se basaba en la predileccin de anillos de fenilo ricos en electrones de residuos fenilalanina C-terminales instalados en un PCR corto para participar en las interacciones de -apilamiento preferencialmente con anillos pentafluorofenilo pobres en electrones de residuos pentafluorofenilalanina N-terminales ( Figura 10b ) . Su estrategia produjo fibras de triple hlice a escala micromtrica. Este enfoque de - apilamiento se ha usado para generar fibrillas tipo colgeno - trombognicas para aplicaciones en biomedicina (134). Adems, la unin de nanopartculas de oro a estas fibrillas y posterior recubrimiento en plata electroltica produjo nanocables a base de colgeno que conducan la electricidad ( 135 ) .
Przybyla y Chmielewski (136) utilizaron autoensamblaje desencadenado por metales para obtener fibras de colgeno a partir de CRP . Un nico residuo de Hyp en Ac - (ProHypGly ) 9 - NH2 fue reemplazado con un residuo de Lys - bipiridilo modificado . La adicin de Fe (II) a una solucin de estos CRP activ el autoensamblaje en fibrillas morfolgicamente diversas de hasta 5 m de longitud con un radio promedio de 0,5 micras.
Un avance importante en el desarrollo de CRP sintticos ensamblados con similitud mayor a las fibrillas de colgeno fue reportado por Chaikof y col. (137). Ellos sintetizaron un CRP con secuencia ( ProArgGly ) 4 - ( ProHypGly ) 4 - ( GluHypGly ) 4 y observaron auto-ensamblaje en solucin en fibrillas de 3-4 micras de longitud y 12 - 15 nm de dimetro . Despus de calentar la solucin de pptidos a 75 C durante 40 min y despus de enfriarla a temperatura ambiente, observaron Pgina 24
fibrillas ms gruesas (~ 70 nm de dimetro). Es importante destacar que estas fibrillas exhiben dos caractersticas clave de fibrillas de colgeno naturales. En primer lugar, las fibrillas muestran puntas cnicas en sus extremos, una caracterstica observada en las fibras de colgeno tipo I y que se consideran importantes para el crecimiento de la fibra (138). En segundo lugar, Chaikof y colaboradores observaron estructura D -peridica de fibrillas de colgeno sinttico, con D 18 nm. El proceso de auto-ensamblaje se basa supuestamente en la interaccin de Coulomb y enlaces de hidrgeno entre residuos cargados Arg y Glu en triples hlices individuales, axialmente activadas (Figura 10c).
Las metodologas descritas anteriormente permiten la creacin de fibrillas largas triple hlice, semejantes a colgeno. A pesar de los grandes avances, las fibrillas sintticas semejantes a colgeno carecen todava de muchas de las caractersticas estructurales de orden superior del colgeno. Adems, las propiedades mecnicas de los materiales sintticos de colgeno no se han estudiado hasta la fecha. Colgenos sintticos que imitan la longitud, el grosor, los patrones, las propiedades mecnicas y la complejidad de las fibrillas de colgeno natural an no se han desarrollado, pero el rpido progreso en los ltimos aos engendra un gran optimismo.
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Figura 10: Estrategias para el auto-ensamblaje de largas fibrillas y triples hlices de colgeno sinttico. (a) Los enlaces disulfuro obligan a una cadena con extremos pegajosos a autoensamblarse (131). (b) las interacciones de apilamiento entre anillos pentafluorofenlicos pobres en electrones y anillos fenilo ricos en electrones llevan a auto-ensamblaje (133, 134). (c) fuerzas de Coulomb entre los bloques catinicos y aninicos promueven el autoensamblaje. Imagen de MET de una fibra resultante que muestra D-periodicidad con D = 17,9 nm (137). El colgeno natural Tipo I tiene D = 67 nm. Aplicaciones biolgicas y biomdicas del colgeno sinttico Pgina 26
Son relativamente pocos los CRP que han sido probados como biomateriales. Goodman y col. (139) mostraron que CRP que contenan peptoide tenan una notable capacidad de unirse a clulas epiteliales y fibroblastos, en particular cuando se encontraban en una superficie. Los CRP tambin son tiles para inducir la agregacin plaquetaria, lo que puede ayudar al proceso de curacin de heridas (140, 141).
Un paso clave para la utilizacin de biomateriales de colgeno con fines teraputicos es el desarrollo de CRPs que podan adherirse o insertarse dentro del colgeno biolgico. La mayora de los esfuerzos hacia estos objetivos se han basado en la inmovilizacin de CRP sobre una sustancia relacionada. Yu y col. (142) prepararon CRP funcionalizados con nanopartculas de oro y demostraron la unin de las nanopartculas de oro a la regin vaca de colgeno natural. Maryanoff y colaboradores encontraron que CRP fijados sobre nanopartculas de ltex pueden estimular la agregacin plaquetaria humana con una potencia similar a la del colgeno tipo I (140). En una extensin importante de este trabajo, se demostr que las fibrillas de triple hlice obtenidas a travs de interacciones aromticas tenan un nivel similar de actividad trombognica de los CRP inmovilizados sobre nanopartculas de ltex (134). Por ltimo, cadenas simples de CRP y CRP polietilen- glicol conjugados se unen a pelculas de colgeno incluso sin inmovilizacin en nanopartculas (143) lo cual tendra uso potencial en curacin de heridas. El futuro de estos enfoques parece ser especialmente brillante.
RESUMEN 1. Las estructuras cristalinas de alta resolucin y los enfoques biofsicos modernos han permitido el estudio detallado de la estructura y la estabilidad de la triple hlice del colgeno. La escalera de enlaces de hidrgeno observados en estas estructuras cristalinas es esencial para formacin de la triple hlice, y su ausencia en el colgeno natural conduce a una variedad de condiciones patolgicas.
2. Efectos estereoelectrnicos imparten estabilidad estructural significativa al colgeno por preorganizacin de polipptidos individuales para la formacin de triple hlice. Por ejemplo, Hyp en la posicin Yaa estabiliza la triple hlice a travs de un efecto estereoelectrnico. Los efectos estereoelectrnicos tambin son importantes para la estructura y estabilidad de otros numerosos pptidos y protenas.
3. Las modificaciones postraduccionales a protocolgeno son de importancia fundamental para la sntesis de una ECM estable. Estas modificaciones incluyen la hidroxilacin y las reacciones de reticulacin.
4. La fibrilognesis de colgeno es un proceso esencial para la formacin de andamios biolgicos macromoleculares. Modelos de relativa alta resolucin de fibrillas de colgeno tipo I y tipo II estn ahora disponibles y, para el colgeno tipo I, muestran que las fibrillas de colgeno se pueden describir como cuerdas a nanoescala.
5. Medios simples para sintetizar largas hlices triples y fibrillas de colgeno se han hecho evidentes. Los materiales resultantes estn listos para su uso en biomedicina y la nanotecnologa.