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Discusión de Resultados

En la técnica de Perclorato de sodio se utilizan Buffer de Lisis 1 y 2 que se utilizan para lisar primero a los glóbulos
rojos que son los más abundantes en sangre periférica, pero que carecen de núcleo (lugar donde reside el DNA
en las células) para evitar su interferencia; se centrifuga y se realizan los lavados correspondientes. Después se
lisan a los leucocitos con buffer de lisis 2 y SDS, para la liberación del contenido celular y con esto el núcleo. El
NaCl y perclorato de sodio crean una alta concentración de sales en la muestra y actúan como quelantes del
DNA, y con isopropanol se promueve que el DNA precipite, por el cambio de constante dieléctrica del agua,
permitiendo separar al DNA de la fase acuosa. Finalmente con etanol al 70% se remueven sales, SDS e
isopropanol, para poder tener solamente DNA en agua estéril. (Giraldo, G. 2010).
En la técnica de Fenol/cloroformo no se lisan los eritrocitos del todo, ya que se transfiere directamente la
capa de glóbulos blancos a otro tubo para hacerle el tratamiento adecuado con RCLB (Buffer de lisis de
eritrocitos) para lisar los eritrocitos que se hayan pasado con la trasferencia de la capa leucocitaria, después
hacer los lavados correspondientes para su eliminación. La lisis de leucocitos se debe al SDS 10% para liberación
del material genético y de igual manera el NaCl actúa como agente quelante del DNA, pero a diferencia de la
técnica de perclorato, la separación de DNA se realiza con una extracción fenólica. Esta solución contiene
Fenol, Cloroformo y alcohol isoamílico. Éste último previene la formación de espuma y facilita observar las fases
acuosa y orgánica para una mejor separación. Se utiliza Isopropanol para precipitar el DNA y separarlo de la
fase acuosa y la remoción de los demás componentes con Etanol 70%. (Zumbo,2011)
Con base en los resultados obtenidos, se puede observar que la extracción superior de ADN fue con la
técnica de fenol-cloroformo, como se puede observar en la tabla No.1. Sin embargo la relación de DO 260/280
obtenida (2.082), fue notablemente superior al rango de 1.7-1.91.8, como se encuentra en la literatura, lo que
nos indica que la muestra de DNA no es pura; y, debido a que la relación se encuentra más elevada, nos orilla a
pensar una posible contaminación con RNA.
El ADN puro tiene una razón ADN/proteína (D260/DO280) de 1.8 (Sambrook & Russell, 2001). Si la razón es
mucho menor a este número hay contaminación por proteínas. Si es mayor a 2.0 hay contaminación por ARN.
De acuerdo al CIMMYT, en vez de un número hay un rango de 1.8 – 2.0 en el que se cree que la absorción es
causada por ácidos nucleicos, aquí se afirma que una relación inferior a 1.8 indica que pueden existir proteínas
y/u otros elementos absorbentes de UV en la muestra. En ese caso, es conveniente volver a precipitar el ADN.
Una relación superior a 2.0 indica que las muestras pueden estar contaminadas con cloroformo o fenol y se
debe volver a efectuar la precipitación con etanol (CIMMYT, 2006).
En el caso de la técnica de perclorato, como s puede observar en la table No. 1, la relación DO DO
260/280 obtenida (1.78) fue ligeramente menor al rango 1.8-2.0 de acuerdo al DIMMYT, debido a
contaminación por proteínas, como se mencionó anteriormente. Sin embargo se considera el ADN extraído por
perclorato como el más puro ya que es más cercano a 1.8.
Para caracterizar el DNA que se tenía se utilizó la electroforesis en gel de agarosa que es una de las más
utilizadas, ya que forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no
iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamaño del poro.5 Ésta funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño (en este caso de
DNA) migran hacia el ánodo más rápidamente que los de mayor tamaño, permitiendo de esta manera la
separación, purificación e identificación de DNA en la muestra, debido a que el DNA está cargado
negativamente por los grupos fosfatos de la molécula, La electroforesis en gel de agarosa es un método
bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA (Uruena, C. 2009)
Por otro lado la agarosa tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente
pero que a altas temperaturas se torna líquida, además de que no es un compuesto tóxico a diferencia de la
acrilamida y permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder
de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración a usar se escoge según el
tamaño del ácido nucleico a analizar.(3) ,esto porque la concentración de agarosa define el tamaño de los
poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa.
Como se puede observar en la imagen 1 en el primer carril se colocó el marcador de peso molecular que son
fragmentos de DNA de tamaño conocido con el fin de calcular el tamaño aproximado del DNA.(4)
En los siguientes carriles se cargaron 10 µL (8 µL de muestra + 2 µL de buffer de carga, y colorante Gel
Red que permite visualizar la muestra con luz U.V.). (En los reactivos ocupados no se utilizó Bromuro de etidio
como solución de revelado, debido a sus características tóxicas, el cual se cambió por Gel Red).
El buffer de carga contiene glicerol, EDTA, Azul de Bromofenol y Xilencianol el cual tiene como objetivo
añadir una parte del color a la muestra que pueda desplazarse también en el campo eléctrico al que se le va a
someter, aumentar la densidad de la muestra ya que deben caer uniformemente dentro del pocillo de
electroforesis (cubierto por solución tampón) ya que de lo contrario no se quedaría dentro de éste.(7)
En cuanto a la placa obtenida de la electroforesis, para el corrimiento de nuestras muestras ubicadas en
el carril 2 y 3, por el método de perclorato de sodio, el desplazamiento no es tan representativo, sin embargo es
evidente su presencia; esto se debe a que el tamaño de las moléculas que permite separar el gel de agarosa
son de mayor tamaño, lo que se confirma con el corrimiento del marcador de peso molecular ubicado en el
primer carril, el cual mostro el recorrido esperado para muestras de tamaño molecular más pequeño; para las
muestras tratadas, el material genético extraído representaba el DNA genómico, es decir la totalidad del
genoma en las células tratadas, por lo tanto el desplazamiento en el gel es escaso o nulo.
Se puede estimar la aproximación de las pb en los fragmentos obtenidos, en el caso de perclorato de
sodio es mayor a 11,000 pb (11kb) ya que está por encima del rango mayor de los marcadores de peso
molecular tomando en cuenta el % de agarosa usado. En lo que se debe a la muestra de fenol/cloroformo, hay
dificultad para la estimación, por motivos de contaminación mencionados anteriormente.
Para cualquier determinación deben tenerse en cuenta las condiciones de trabajo ya que el más
mínimo error puede afectar los resultados, este seguimiento conlleva desde la preparación del material a
emplear en las extracciones hasta la emisión de resultados, esto es que desde las soluciones a emplear para
extraer el material genético deben prepararse con las concentraciones exactas para así asegurar su
funcionamiento y el material debe cumplir especificaciones de lavado para eliminar cualquier contaminación,
pues el material genético que se extraerá puede no ser de la muestra que deseamos y pertenecer a
contaminantes (bacterias o células provenientes del personal que maneja la muestra.