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Proyect o de investigación Concurso de prof esor agregado, enero 2007

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1. Título de la línea de investigación
Química Analít ica del DNAcuádruple - Analyt ical Chemist ry of Quadruplex DNA
2. Resumen de la línea de investigación
La línea de invest igación que se present a se sit úa en la int ersección de las áreas de conocimiento de la
Química Analít ica y de la Biofísica, lo que se podría denominar "Biofísica analít ica”. Bajo est e t ít ulo
se combinan las dos caract eríst icas más dest acables de la línea de invest igación propuesta: la
aplicación de la metodología propia ("know-how") del t rabajo experimental en Química Analít ica al
est udio de procesos que, t radicionalment e, se han considerado objet o de invest igación de la Biofísica.
En concret o, se pret ende est udiar desde una ópt ica analít ica:
 la est abilidad de las est ruct uras complejas de ADN cuádruple frent e a cambios en el pH,
t emperat ura, fuerza iónica y nat uraleza de los iones met álicos, y
 la influencia que det erminados compuestos con potencial int erés biomédico pudieran t ener
sobre dichas estruct uras.
3. Introducción: antecedentes yestado actual
3.1. Estructuras de ADN formadoras de hélices triples y cuádruples
En los últ imos años, la Biología Molecular y la Genét ica han experiment ado avances sorprendent es,
fruto del crecient e conocimient o de las biomoléculas relacionadas con la información genét ica. La
mayoría de los aspect os relacionados con est a información t iene su origen en los vehículos port adores
de ést a que son los ácidos nucleicos. Así, los ácidos ribonucleicos (ARN) y los ácidos
desoxirribonucleicos (ADN) t ienen un papel det erminant e en la duplicación celular (como vehículo de
t ransmisión de la información genét ica) y en la sínt esis de proteínas.
La mayor part e del ADN present e en el genoma humano está en forma de hélice o cadena doble
(Figura 1), que es la est ruct ura más conocida y la primera que se caracterizó en la década de los
cincuent a. Además de est a est ruct ura, exist en ot ras más complejas que pueden exist ir únicament e in
vitro o t ambién en una cant idad minorit aria in vivo. A menudo, no se conoce su papel biológico pero,
aún así, la invest igación en este campo es muy act iva, como se puede deducir en el número y calidad
de los t rabajos recient ement e publicados (como ejemplo, los t rabajos de Ourliac-Garnier, 2005;
Kankia, 2005; o Granot ier, 2005). Las helices t ríples y cuádruples se encuent ran en est e grupo de
est ruct uras complejas.
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Figura 1. Estructura típica del ADN
de cadena doble mostrando las cuatro
bases nitrogenadas presentes en el
ADN: adenina y guanina (bases
purínicas) y timina y citosina (bases
pirimidínicas). Los pares de bases que
estabilizan la estructura de hélice
doble se denominan de Watson-Crick
y corresponden a los pares de bases
adenina·timina y guanina·citosina.
Las est ruct uras de hélice t riple ya se describieron por vez primera al final de la década de los cincuent a
en experimentos con homopolínucleót idos sint ét icos (polinucleót idos que cont ienen un único t ipo de
base nit rogenada), pero no es hast a el final de la década de los ochent a que se comienzan a est udiar en
profundidad. En la act ualidad, se conoce que las hélices t riples se pueden formar sobre tramos de
ADN de cadena doble que muest ran una secuencia específica de bases nit rogenadas (Fi gura 2). Estos
t ramos pueden representar hasta un 1% del genoma t ot al y est án present es en la secuencia de
numerosos genes.
En las hélices t riples, un oligonucleót ido (secuencia cort a de ADN que cont iene menos de veint e
bases, aproximadament e) se une a la región del ADN de cadena doble, en la que una de las cadenas es
ricas en bases purínicas y la ot ra en bases pirimidínicas, de manera paralela o ant iparalela. En ambos
casos, est a unión puede dificult ar o incluso inhibir la expresión del gen cont enido en el t ramo de ADN
de cadena doble. De est a manera, los oligonucleót idos formadores de hélices triples (Triplex Forming
Oligonucleotides, TFO) const it uyen uno de los pocos ejemplos de compuestos capaces del
reconocimiento específico de ADN de cadena doble con capacidad de una posible ut ilización para la
inhibición específica de genes. La ut ilización de los oligonucleót idos formadores de hélices t riples en
la regulación de la expresión génica se ha convenido en llamar estrat egia "ant igen" o t erapia ant igénica
para diferenciarla de la ut ilización de oligonucleót idos para bloquear el RNA mensajero que se ha
denominado est rat egia "ant isent ido" [Praseut h, 1999; Frank-Kamenet skii, 1995; Sun, 1996].
Las cadenas de ADN que forman est ruct uras t ipo hélice cuádruple present an, como en el caso de las
hélices t ríples, caracterist icas que las hacen especiales. En este caso, las est ruct uras de hélice
cuádruple se forman cuando una secuencia de ADN es rica en bases nitrogenadas del t ipo guanina o
bien rica en bases nitrogenadas del t ipo cit osina. Una secuencia rica en guaninas puede originar
est ruct uras de hélices cuádruples conocidas como G-quadruplex (Fi gura 3). Una secuencia rica en
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bases cit osinas, por su part e, puede dar lugar a est ruct uras de hélices cuádruple conocidas como i-motif
[Phan, 2000].
Figura 2. Ejemplo de estructura tipo
hélice triple. La cadena de color
naranja representa la tercera hebra,
localizada en la hendidura mayor del
ADN (entre las hebras amarilla y
azul). Éstas dos hebras son ricas en
bases purínicas (guanina, adenina) y
pirimidínicas (citosina, timina),
respectivamente.
Las est ruct uras i-motif precisan de la prot onación de una parte de las bases nit rogenadas citosinas, por
lo que su presencia a pH neut ro es minorit aria. Por ello, se ha invest igado mucho más el posible papel
biológico de los G-quadruplex que sí se forman a pH neutro [Simonsson, 2000; Phan, 2002; Canalia,
2005].
Figura 3. Estructuras tipo hélice cuádruple [Phan, 2000]: A) disposición de cuatro bases guanina (tetrada)
que da lugar a la estructura G-quadruplex mostrada a la derecha. Esta estructura está formada por tres
tetradas superpuestas, donde las bases guanina se han representado como rectángulos. B) disposición de
dos bases citosina (una de ellas protonada) que da lugar a la estructura i-motif mostrada a la derecha.
Esta estructura está formada por seis pares intercalados de bases citosina, representadas por triángulos.
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Las hélices cuádruples t ipo G-cuadruplex e i-motif se pueden encontrar in vivo en los t elómeros y en
ciertos oncogenes (genes que se sabe o sospecha est án relacionados con det erminados cánceres), como
bcl-2, c-myc, c-kit, ... [Ambrus, 2005; Dai, 2006; Dexheimer, 2006; Xu, 2006]. El caso de los
t elómeros es el que más se ha est udiado hast a la fecha ya que la relación exist ente ent re la longit ud de
los t elómeros y la capacidad que t iene la célula para dividirse t iene un gran int erés en la t erapia del
cáncer [Ambrus, 2006; Luu, 2006]. Se sabe que es necesario el desenrollamient o de los telómeros del
ADN celular como paso previo a la replicación de ést e. Una vez ést a se ha producido los t elómeros
vuelven a enrollarse pero, durant e el proceso, se ha producido un acort amiento de su secuencia,
perdiéndose una part e pequeña de las bases guanina necesarias para la formación del t elómero.
Después de un ciert o número de replicaciones celulares, la longit ud del t elómero es lo suficient ement e
cort a como para que ya no se pueda formar la est ruct ura G-quadruplex, y es ent onces cuando se
considera que la celula muere. Curiosament e, en las células de t ejidos cancerosos no se da est a
circunst ancia, y la longit ud de los t elómeros permanece práct icament e inalt erada después de muchos
ciclos de división celular, lo que hace que las células cancerosas t engan una gran facilidad de
reproducción. Es por est e papel t an import ant e en la replicación celular que hay un gran int erés
biomédico en conocer los fact ores que afect an a la est abilidad de est a est ruct ura, así como el
desarrollo de compuest os que puedan modificar su est abilidad.
Hast a la fecha, un número considerable de grupos de invest igación ha t rabajado en el desarrollo de
compuest os capaces de est abilizar o desest abilizar las est ruct uras G-quadruplex [Reed, 2006; Wei,
2006]. El compuesto que ha most rado un mayor poder de est abilización de est a est ruct ura es el
5,10,15,20-t et rakis(N-met il-piridinium-4-il)-21H, 23H-porfirina (Figura 4). La nat uraleza de su
interacción con las est ruct uras G-quadruplex aún es mot ivo de discusión ya que, mient ras algunos
invest igadores defienden un mecanismo de int ercalación entre las t et radas, ot ros defienden una
interacción con los bucles de los ext remos de la estruct ura G-quadruplex.
Figura 4. Estructura molecular del compuesto
TmPyP4.
3.2. El papel de la Química Analítica
La invest igación experimental de la est abilidad de las est ruct uras complejas de las biomoléculas y de
su int eracción con otros compuest os (lo que ent raría dent ro del campo de la Biofísica) se suele realizar
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combinando est udios de caráct er estruct ural con ot ros de enfoque t ermodinámico. Los primeros t ienen
como objet ivo la elucidación de la estruct ura espacial de las biomoléculas así como de los procesos
que llevan a la formación de est as est ruct uras. Por su part e, los est udios de caráct er t ermodinámico
t ienen como objet ivo final la especiación del sist ema, entendida ést a como la det erminación de las
especies químicas o conformaciones present es en unas condiciones experiment ales especificas y su
concent ración relat iva. Ést a es, probablement e, la int ersección más evidente de las áreas de
invest igación que, tradicionalment e, se han ident ificado con la Biofísica y con la Química Analít ica.
Así, los est udios de las propiedades ácido-base, de complejación con iones met álicos o con complejos
de ést os, o incluso los cambios de conformación de una molécula, se pueden incluir dentro de la
cat egoría de est udios t ermodinámicos que pueden ser realizados “desde un punto de vist a analít ico”.
La línea de invest igación propuest a plant ea la aplicación de la metodología analít ica, ent re la que
dest aca la aplicación de mét odos quimiomét ricos de análisis de dat os espect roscópicos, a est udios de
caráct er termodinámico en la invest igación biofísica de est ruct uras complejas de ADN.
3.2.1. La Quimiometría en la investigación biofísica
En la act ualidad, los avances en informát ica y elect rónica hacen posible el regist ro de grandes
conjuntos de dat os en cortos períodos de t iempo. En el caso de la espect roscopía, est e hecho se
observa en la disponibilidad de det ect ores rápidos y fiables que permit en el seguimiento de procesos
bioquímicos o biofísicos midiendo espectros complet os en cada punt o del proceso. Hace escasos años,
est a clase de procesos podía ser únicamente seguida midiendo la señal espect roscópica a una o, como
mucho, unas pocas longit udes de onda.
Los datos obt enidos con un único canal de medida se conocen como univariant es. Un ejemplo de datos
univariantes sería las medidas de absorbancia realizadas durant e un experimento de desnat uralización
de un ácido nucleico a una única longit ud de onda. Por otra part e, los datos mult ivariant es son aquellos
que son result ado de medidas ut ilizando varios canales. En algunos casos, los dat os univariant es son
suficient es para seguir satisfactoriament e un proceso, habiéndose desarrollado métodos de análisis que
proporcionan result ados fiables [Breslauer, 1995]. Así, parámetros t ermodinámicos como la entropía o
la ent alpía asociados a la desnat uralización de un ADN se han calculado t radicionalmente a part ir del
análisis de dat os univariant es registrados a lo largo de su desnat uralización. Ot ros ejemplos del
análisis de dat os univariantes son el cálculo de las est equiomet rías y de constant es de equilibrio
mediant e la aplicación de los métodos de Job o de razones molares [Huang, 1982]. Sin embargo, en
algunos casos, el seguimiento de un proceso a una única longit ud de onda no es suficient e y ciert as
ambiguedades relacionadas con la det erminación del número de especies químicas (o conformaciones)
present es o con su rango de exist encia (temperat ura, pH) no se resuelven sat isfactoriament e. En estos
casos, la disponibilidad de dat os mult ivariant es y su post erior análisis proporciona una posible vía para
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superar est as dificult ades.
240
260
280
300
320
340 20
40
60
80
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Long. de onda (nm)
Temperatura (oC)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Figura 5. Ejemplo de datos multivariantes obtenidos en el seguimiento mediante espectroscopía de
absorción molecular de la desnaturalización de un ADN inducida por un incremento de temperatura. Los
datos se han registrado en 101 canales de medida (n =101) y a 30 condiciones experimentales diferentes (m
=30). A temperaturas bajas predomina la estructura de hélice doble del ADN, en tanto que a temperaturas
altas predomina una estructura de ovillo aleatorio (random coil)
Los mét odos mat emát icos empleados en Química Analít ica para el análisis de dat os espectroscópicos
(como los most rados en la figura ant erior) se denominan mét odos de resolución mult ivariant e. El
objet ivo de estos métodos es la descomposición (resolución) de la mat riz de datos original en las
cont ribuciones cuant itat ivas (concent ración) y cualit at ivas (caract eríst icas espectrales) de t odos los
fact ores (que suelen relacionarse direct ament e con especies químicas o est ruct uras) ópt icament e
act ivos siguiendo un modelo bilineal (Figura 6).
=
D



n



m
C



m
NC
S



n
NC
E

 
n



m
+
=
D





n

n





m

m
C



m





m

m
NC NC
S





n

n
NC
E



 
n

n





m

m
+
Figura 6. Descomposición de la matri z de datos multivariantes mostrados en la figura anterior en sus
contribuciones cuantitativas (concentraciones, matri z C) y cualitativas (espectros, matri z S). m y n son el
número de espectros y el número de canales de medida, respectivamente. NC es el número de factores
ópticamente activos. E es la matri z de residuales, es decir, datos de absorbancia no explicados por la
multiplicación de C · S
T
.
Un grupo de mét odos de resolución mult ivariant e incluye aquéllos basados en la aplicación de
modelos explícitos post ulados a priori. Éstos son básicament e la ext ensión de los métodos
univariantes ya ut ilizados, y se les suele denominar como métodos de modelado rígido o hard-
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modeling. Así, por ejemplo, para est udios sobre equili brio químico, el modelo que se post ula consist e
en las est equiometrías de t odas las especies químicas present es en el sist ema y en un conjunt o de
valores aproximados de las const antes de equilibrio [Belt rán, 1993; Toptygin, 1995; Gans, 1996]. El
mét odo de modelado rígido ut iliza est e modelo inicial para calcular los valores de las const ant es de
equili brio que mejor explican los dat os experiment ales. Los métodos de modelado rígido proporcionan
excelent es result ados siempre que su aplicación sea fact ible. Sin embargo, a menudo, ést a no es
posible debido a las dificult ades halladas en la post ulación de un modelo explícito de especies, bien
sea porque no se conoce la est equiomet ría de las especies o bien porque el modelo de const ant es de
equili brio “fijas” no es válido. Ést e es el caso de las macromoléculas t ipo ADN en las que no es
posible a menudo post ular un único y const ant e valor del pKa para todas las unidades monómeras que
forman la molécula. Ot ro caso son los cambios de conformación no acompañados de cambios en la
composición química.
Algunas de est as dificult ades pueden ser superadas mediant e la ut ilización de mét odos de modelado
suave, t ambién conocidos como soft- o self-modeling, que no precisan de un modelo explícit o a priori.
[Gampp, 1985; de Juan, 2003; Windig, 1992; Zimanyi, 1999]. De hecho, el objet ivo final de estos
mét odos sería la post ulación de un modelo a posteriori. En la práct ica, sin embargo, es difícil
recuperar perfect ament e el modelo químico que est á det rás de los datos experiment ales debido a la
presencia de una serie de ambigüedades inherent es al análisis de fact ores. En el campo de la Química
Analít ica se ha experimentado un gran desarrollo de est os mét odos, entre los que se encuent ra el
mét odo de Resolución Mult ivariant e de Curvas basado en opt imización de mínimos cuadrados
alt ernados (Multivariate Curve Resolution based on Alternating Least Squares optimization, MCR-
ALS), desarrollado en el grupo de Equilibrios en solución y Quimiometría de la Universidad de
Barcelona [Tauler, 1995]. MCR-ALS se ha empleado sat isfactóriament e en el est udio de los
equili brios en solución de los ácidos nucleicos [Jaumot , 2003] y de las prot eínas [Navea, 2003].
Los mét odos de resolución rígidos son los más ut ilizados en los est udios biofísicos, especialment e en
el modelado de reacciones (est udios cinét icos). Al igual que en el campo de la Química Analít ica, los
mét odos de modelado suave han ido ganado terreno en aquellas aplicaciones donde la aplicación de
mét odos rígidos era difícil. El mét odo de modelado suave más ut ilizado es Singular Value
Decomposition (SVD) [Henry, 1992; Henry, 1997]. Es de dest acar la ut ilización de ést e método como
paso previo al modelado de datos experimentales mediant e mét odos rígidos, con el fin de reducir el
t amaño de la matriz de dat os que se pret ende analizar. Varios t rabajos han revisado las principales
aplicaciones de los métodos de resolución mult ivariant e en est udios biofísicos [Goldbeck, 1993,
Jaumot 2004; Vandegriff, 1994].
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4. Objetivos de la línea de investigación
4.1. Antecedentes y resultados previos
Los ant ecedent es de proyect o de invest igación que aquí se describe son los est udios del papel que
sobre los equili brios ácido-base y de complejación juegan los efect os secundarios relacionados con la
est ruct ura de los polímeros. Estos est udios se iniciaron con la Tesis de Licenciat ura (1993) en el marco
de la invest igación realizada en el grupo de Equilibrios en solución y Quimiomet ría. Est os efectos
secundarios, que se clasifican en efectos polifuncionales, polielect rolít icos y conformacionales, se
comenzaron a est udiar en polinucleót idos sintét icos, como los ácidos poliuridílico (poli(U)) y
poliinosínico (poli(I)). Est os est udios consist ían en el seguimiento mediant e pot enciomet ría de la
protonación y de la complejación con el ion met álico cobre(II) de estos polímeros. Post eriormente, se
pasó al est udio de estos mismos equilibrios seguidos mediant e técnicas espect roscópicas. En estos
est udios, los datos espect roscópicos obt enidos a largo de valoraciones ácido-base se analizaron con las
primeras versiones de MCR-ALS para obt ener los perfiles de concent ración y los espect ros puros de
cada una de las especies consideradas. A part ir de est os perfiles, se calculaba una est imación de las
const ant es de equilibrio y se caract erizaba el comport amiento polielectrolít ico de cada sist ema
est udiado. A part ir de est os est udios iniciales, se pasó a est udiar polinucleót idos sint ét icos de cadena
doble, del t ipo ácido poliinosínico-policit idílico (poli(I)·poli(C). Por otra part e, se pasó de est udiar la
complejación con cobre(II) a est udiar la int eracción de compuest os de plat ino y de agent es
intercaladores, como el bromuro de et idio, con polinucleót idos de cadena doble. El diseño
experiment al aplicado en estos últ imos t rabajos fue la ext ensión mult ivariant e de métodos analít icos
conocidos, como los de razones molares o de variaciones cont inuas. Además, la int eracción fue
segui da no únicament e con espectroscopía de absorción molecular, sino t ambién con DC y
fluorescencia molecular, simult áneament e. El análisis global de los t res conjuntos de dat os permit ió
una complet a especiación de los sist emas est udiados, así como el cálculo de los espect ros puros de
absorción, DC y fluorescencia de los complejos de int ercalación.
En cuant o al est udio de los equilibrios en solución de los ácidos nucleicos, el paso nat ural siguient e es
el est udio de las hélices triples y cuádruples.
Por ot ra part e, en los últ imos años se ha t rabajado int ensament e en la mejora de los algoritmos de
MCR-ALS con el objet ivo de mejorar la fiabilidad de los result ados obt enidos. Así, se pasó del
análisis de una única mat riz de dat os espectroscópicos al análisis simult áneo de varias matrices
correspondient es a diferent es experimentos y/o dat os obt enidos con diferent es t écnicas
espect roscópicas. En los últ imos años se ha t rabajado en la incorporación de modelos físico-químicos
en el cálculo, en lo que se ha denominado aproximación rígido-suave (hard-soft). Est o se ha
conseguido de manera sat isfact oria en el caso de los equilibrios ácido-base y de los est udios cinét icos.
Sin embargo, aún no se ha incorporado un modelo físico-químico para el caso de los procesos de
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desnat uralización t érmica (Figura 5) con el fin de calcular, además de los perfiles de concent ración y
de los espect ros, valores de magnit udes t ermodinámicas como la ent alpía, ent ropía o energía libre.
Además, el hecho de forzar a los resultados a cumplir un modelo permit e una resolución libre, o
práct icament e libre, de algunas de las ambigüedades relacionadas con los métodos de modelado suave.
4.2. Objetivos
El plan que se pretende desarrollar plant ea el est udio desde una ópt ica mult idisciplinar de los
equili brios en solución de estruct uras complejas de ácidos nucleicos y de su int eracción con
compuest os de posible int erés biomédico.
Los objet ivos concretos del plan propuesto son:
1. Especiación de los sist emas químicos en los que int ervienen secuencias de ADN formadoras de
hélices triples y cuádruples. Como ya se ha coment ado, el t érmino especiación implica la
caract erización exact a de las propiedades ácido-base y de los cambios conformacionales inducidos
por la t emperat ura, fuerza iónica y la presencia de algunos iones met álicos.
2. Especiación de los sist emas químicos en los que, además de las secuencias formadoras de hélices
t riples y cuádruples, int ervienen det erminados compuest os capaces de int eraccionar con est as
est ruct uras (act inomicina D, alt romicina H, mitoxant rona, quelatos de plat ino o europio,
TmPyP4). Se pret ende det erminar las condiciones ópt imas para la int eracción y el efect o de ést a
sobre la est ruct ura inicial del ADN. Se est udiaría t ambién la influencia que sobre la est abilidad de
la estruct ura t iene la mut ación de algunas bases nitrogenadas en la secuencia. En concreto, se
est udiaría la mut ación de las bases adenina o guanina por las bases 2- o 8-aminopurina,
respect ivamente.
3. Desarrollo y validación de mét odos de resolución mult ivariant e basados en el modelado suave y
rígido-suave para el análisis de datos espect roscópicos obt enidos a lo largo de los est udios de
desnat uralización de biomoléculas.
5. Metodología y plan de trabajo
Para conseguir el primer y el segundo objet ivos descritos ant eriorment e se ut ilizará la siguient e
met odología:
a) Sínt esis de las secuencias de ADN capaces de formar estruct uras t ipo hélice triple y cuádruple.
Est a sínt esis se realizará en colaboración con el Grupo de Química de áci dos nucleicos, del
Inst it ut o de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), ut ilizando la t ecnología de la sínt esis en fase
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sólida. Est a misma t ecnología se ut ilizará en la sínt esis de las secuencias que incluyan bases
nitrogenadas modificadas.
b) Est udio experiment al de los equilibrios ácido-base de las secuencias de ADN. Se considera
necesario est e est udio como paso previo a los post eriores sobre int eracción o cambios
conformacionales, ya que es la mejor opción para conseguir una correct a especiación de los
dist intos sist emas est udiados en las condiciones fisiológicas de pH. La formación de las hélices
t riples y cuádruples en función del pH se visualizará mediant e el seguimiento de sencillas
valoraciones ácido-base mediant e t écnicas inst rument ales apropiadas, como las espectroscopias de
absorción molecular, de fluorescencia molecular (t ant o su aplicación tradicional como la basada
en la t ecnología de las almenaras moleculares -molecular beacons-), de dicroísmo circular (DC) o
de resonancia magnét ica nuclear (RMN). El result ado final será la obt ención de conjuntos de datos
similares a los descrit os en la Figura 5. Para el análisis de los dat os espect roscópicos se ut ilizarán
t ant o los mét odos de resolución mult ivariante basados en el modelado rígido, como los basados en
un modelado suave, así como la combinación de ambos.
c) Est udio experiment al de los cambios conformacionales inducidos por la t emperat ura o la fuerza
iónica en las est ruct uras de hélice t riple y cuádruple. Una vez definida la composición de cada
sist ema en las condiciones fisiológicas de pH, se procederá a est udiar la desnat uralización de las
est ruct uras inducida por la t emperat ura y la est abilización, en general, de las mismas con la fuerza
iónica. En est e caso, el procedimiento experiment al que se ut ilizará en el seguimiento de los
cambios conformacionales y el análisis de los dat os obt enidos será similar al descrit o en el
apart ado anterior. Además, se ut ilizarán t écnicas complement arias como la electroforesis en gel o
la cromatografía de líquidos, ent re ot ras. En est e punto t ambién se incluye el est udio de la
compet encia entre la formación de est ruct uras cuádruples y la formación de est ruct uras Wat son-
Crick, cuando en el mismo sist ema coexist en secuencias complement arias formadoras de G-
quadruplex e i-motif.
d) Una vez conocida la composición de cada sist ema en función del pH, t emperat ura y fuerza iónica,
se procederá est udiar la int eracción de las est ruct uras t ipo hélice cuádruple con compuest os del
t ipo act inomicina D, alt romicina H, mitoxant rona o TmPyP4. En est e caso, el procedimient o
experiment al se basará en la ext ensión mult ivariante de los métodos de razones molares y
variaciones cont inuas. Las t écnicas inst rument ales ópt icas y los métodos ut ilizados en el análisis
de dat os serán similares a los descrit os ant eriorment e. Además, se ut ilizarán t écnicas
complement arias como la diálisis compet it iva o la elect roforesis en gel, entre otras.
El t ercer objet ivo de est e plan es el desarrollo y validación de un programa informát ico, basado en la
combinación de modelado rígido y suave, para el análisis de dat os mult ivariant es regist rados a lo largo
de procesos de desnat uralización térmica. Est os procesos suelen ser seguidos mediant e t écnicas
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espect roscópicas como la absorción molecular o DC ut ilizando para ello modernos espectrofot ómet ros
que permit en la medida de la señal analít ica (absorbancia o elipt icidad) en un rango amplio de
longit udes de onda. A menudo, la no disponibilidad de programas informát icos adecuados hace que el
análisis de los dat os experiment ales se limit e a la señal registrada a una longit ud de onda,
desaprovechando gran part e de los dat os originales. Un ejemplo concret o es el ya coment ado en la
Figura 5. Aunque es posible medir el espect ro en un rango amplio de longit udes de onda, el análisis de
los dat os se acost umbra a realizar únicament e a part ir de la señal regist rada a 260 y /o 295 nm, lo que
frecuent ement e hace difícil la detección de est ruct uras int ermedias en est e t ipo de procesos.
La herramient a informát ica que se pret ende desarrollar y validar es un programa de acceso libre, con
código abierto y disponible vía Int ernet . El programa servirá para analizar dat os mult ivariant es
obt enidos con cualquier t écnica espect roscópica, haciendo especial énfasis en la espect roscopía de
absorción molecular y en el DC, que son las más ut ilizadas en est e t ipo de est udios.
El programa se basará en la combinación de modelado rígido y modelado suave. El primero servirá
para modelar la contribución espectral de las especies asociadas a las biomoléculas y permit irá el
cálculo fiable del valor de magnit udes t ermodinámicas como la ent alpía, ent ropía o energía libre, y
empíricas como la t emperat ura de fusión (T
m
). El modelo físico-químico propuesto a priori est ará
definido por: a) el número de transiciones estruct urales que se dan en el rango de t emperat uras
est udiado, y b) un conjunto inicial de valores (entalpía, entropía y T
m
) para cada una de est as
t ransiciones. Mediant e un procedimient o it erat ivo, los valores de est as magnit udes se refinarán de t al
manera que la magnit ud de los residuales se minimice. Por ot ra part e, el modelado suave servirá para
explicar la contribución espect ral de aquellos factores no relacionados con especies o conformaciones
de la biomolécula, como puede ser la deriva de la línea base.
El programa se escribirá en el ent orno de programación Mat lab®, con el que ya se ha trabajado
ant eriorment e, ya que es la herramienta más común de programación de los invest igadores que
t rabajan en Quimiomet ría. El programa incluirá una int erfaz gráfica y será disponible vía Int ernet a
t ravés de la página web del Grupo de equili brios en solución y Quimiomet ría.
6. Recursos necesarios para el desarrollo del plan
6.1. Espacio físico e instrumentación básica
El proyecto de invest igación propuest o se desarrollaría en el marco de la Facultad de Química de la
UB; en concret o, en los laborat orios del Grupo de Equilibrios en solución y Quimiomet ría del
Depart amento de Química Analít ica. Los laborat orios incorporan t odas infraestruct uras necesarias
(vit rinas, ext ractores, climat ización, et c.) para el desarrollo de la invest igación que se ha descrit o, así
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como el equipamiento básico de un laboratorio analít ico (mat erial volumét rico, pot enciómet ros,
agit adores, pipet as, mat erial informát ico, neveras, est ufas, et c.), además de espect rofotómetros de
absorción molecular y de fluorescencia molecular o equipos de cromatografía de líquidos.
6.2. Grandes equipos
Los grandes equipos que se ut ilizarán en el desarrollo del proyect o son básicament e dos:
espect rofotómet ros de DC y espect rómetros de RMN.
Los equipos de DC se encuent ran sit uados físicament e en los laboratorios de los Servicios Cient ífico-
Técnicos de la Universidad de Barcelona, a cien met ros del edificio de la Facult ad de Química. Se
dispondrá de ellos en régimen de aut oservicio y con una t arifa especial para los usuarios de la
Universidad de Barcelona.
Los espect rómetros de RMN t ambién se encuent ran físicament e en los espacios de los Servicios
Cient ífico-Técnicos de la Universidad de Barcelona. Los equipos de campo bajo (hast a 400 MHz) se
encuent ran en el subt erráneo de la propia Facult ad de Química. Los equipos de campo alt o (de 500 a
800 MHz) se encuent ran en un edificio independiente, a 500 met ros de la Facult ad.
6.3. Recursos humanos
El desarrollo del plan de invest igación propuest o necesit a de la part icipación de más personas para
llevarlo a t érmino. En est e sent ido, los recursos humanos que se espera poder disponer para su
realización son:
 Est udiantes de Química de la asi gnat ura “Experimentación Avanzada en Química Analít ica B”.
Est os est udiant es t ienen la posibilidad de realizar la asignat ura en laboratorios del depart amento de
Química Analít ica, t rabajando en proyectos de invest igación, durant e, aproximadament e, un mes.
 Licenciados en Química que cursen el “Máster en Química Experiment al” (mient ras ést e siga
ofert ándose), y que opt en por un t rabajo experiment al de, aproximadament e, un año de duración
en el marco de est e proyect o de invest igación.
 Est udiantes extranjeros de Química que realicen part e de sus est udios en la Universidad de
Barcelona.
A largo plazo, se intent ará conseguir una beca predoctoral asociada a algún proyecto nacional
financiado.
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6.4. Recursos económicos
La financiación, a corto y medio plazo, para llevar a cabo el proyect o de invest igación propuest o se
obt endrá a part ir de los dos proyectos en curso en los que part icipo. Además, part icipo en el grupo de
invest igación consolidado “SIBA-TEQ: Sistemes d'Interès Biomèdic i Ambiental: Tècniques
Experimentals i Quimiomètriques”, reconocido por la Agencia de Gest ión de ayudas universitarias y
de invest igación, de la Generalitat de Catalunya.
6.5. Colaboraciones científicas
El plan de invest igación se desarrollaría con la colaboración del Grupo de Química de ácidos
nucleicos, del Inst it uto de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), y el Grupo de Quimiomet ría
Ambient al, del Inst it ut o de Invest igaciones Químicas y Ambient ales de Barcelona (CSIC). Con el
primer grupo se ha colaborado act ivament e desde el año 1999 y con el segundo desde su creación en
2003, tras la marcha del Dr. Romà Tauler, ant erior miembro del grupo de Equilibrios en Solución y
Quimiomet ría de la UB, al CSIC.
El Grupo de Química de ácidos nucleicos est á dirigido por el doctor Ramon Erit ja Casadellà. El doct or
Erit ja es doct or en Química por la UB y ha est ado t res años en el Beckman Research Institute of City
of Hope de Los Angeles, California, un año en la Universidad de Colorado y cinco años en el
Laborat orio Europeo de Biologia Molecular (EMBL) de Heidelberg, Alemania. Su invest igación se
cent ra en la sínt esis y en el est udio de las propiedades de los oligonucleót idos [Williams, 2002; Aviñó,
2003; Aviñó, 2004; Nadal, 2005]. Con ant erioridad al present e proyect o de invest igación, se ha
colaborado con el grupo del Dr. Erit ja en el est udio de los equili brios en solución de oligonucleót idos
cuya secuencia incluían bases nitrogenadas anómalas del t ipo zebularina o 2-aminopurina. La
cont ribución del laboratorio del Dr. Erit ja se mat erializó en la sínt esis de las secuencias cuyos
equili brios en solución se est udiaron post eriormente.
Por su part e, la colaboración con el grupo del Dr. Tauler se cent raría en el desarrollo de programas de
análisis de dat os basados en mét odos mult ivariant es. Est a colaboración seguiría en la línea ya
est ablecida ant eriorment e.
Finalmente, se ha de mencionar los cont actos que se mant ienen con ot ros invest igadores, expertos en
sus respect ivas áreas cient íficas, como son:
 Dr. Carlos González, (Inst it ut o de Química Física “Rocasolano”, CSIC) y Dr. Enrique Pedroso
(depart ament o de Química Orgánica, Universidad de Barcelona), en el campo del análisis
est ruct ural mediante RMN bidimensional.
 Dr. Petr Taborsky (depart ament o de Química, Masaryk University, Brno, República Checa), en el
est udio de la int eracción de compuest os fluorescent es de europio.
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 Dr. Baldomero Oliva, (Departament o de Ciencias Experiment ales y de la Salud, Universidad
Pompeu Fabra), en el campo del modelado molecular de prot eínas y ácidos nucleicos.
7. Beneficios del proyecto
7.1. Grado de innovación, interés y oportunidad
Varios son los aspect os innovadores de este proyect o:
 La ut ilización de hélices t riples para la capt ura de secuencias de int erés de ADNha sido propuest a
por varios grupos invest igadores. Sin embargo, exist en algunos inconvenient es que dificult an su
est udio y ut ilización. Uno de los inconvenient es principales que limit a su est udio es la det ección
en el caso de las est ruct uras paralelas. Est e inconvenient e se podría solvent ar mediant e la
ut ilización de la metodología mult ivariant e descrit a. Por ot ra part e, un inconvenient e en la
ut ilización médica de las hélices t riples es la poca estabilidad de ést as en medios neut ros. Uno de
los punt os innovadores de est e proyect o es la ut ilización de bases modificadas, del t ipo 2- y 8-
aminopurina, que aumentan de forma considerable la est abilidad de las hélices t riples incluso a
pH neut ros.
 El est udio de secuencias de ADN formadoras de est ruct uras cuádruples es muy recient e y hay en
la act ualidad un número crecient e de invest igadores t rabajando en los est udios est ruct urales de las
mismas. Sin embargo, la caract erización desde el punt o de vist a analít ico no avanza al mismo
ritmo, por lo que se det ect a un ciert o vacío en est e campo. El proyect o propuest o será innovador
en est e aspecto por cuanto no se ha encont rado en la bibliografía cient ífica ningún grupo que
t rabaje en un proyecto similar al descrito, y que complement ará los est udios est ruct urales ya en
marcha.
 En la act ualidad, es absolut amente necesaria la disponibilidad de herramient as informát icas
capaces de obt ener información físico-química, fiable, a part ir de las medidas inst rument ales. Se
ha demost rado que la combinación de los métodos de resolución mult ivariant e basados en el
modelado rígido-suave es una buena alt ernat iva para conseguir est a fiabilidad. En est e sent ido, el
proyecto propone el desarrollo de un programa basado en la aproximación hard-soft para el
análisis de dat os de desnat uralización que, act ualmente, no existe (o bien no se ha publicado su
desarrollo). Por ello, se considera un aspecto t ot alment e innovador de est e proyecto.
7.2. Plan de difusión: publicaciones y congresos
 Publicación de trabajos de invest igación en revist as ampliament e reconocidas en el Science
Citation Index, especialment e en las que se consideran import ant es en las áreas de aplicación del
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proyecto (Analytical Chemistry, Analytica Chimica Acta, Analytical Biochemistry, Biophysical
Journal, Nucleic Acids Research ...).
 Present ación de la invest igación en congresos nacionales e int ernacionales, dent ro del campo de la
Quimiomet ría (Chemometrics in Analytical Chemistry, Colloquium Chimiometricum
Mediterraneum), la invest igación de los ácidos nucleicos (Reunión de Ácidos nucleicos y
nucleósidos, reuniones anuales de la Biophysical Society) y de la espectroscopía de biomoléculas
(International Conference on Spectroscopy of Biological Molecules).
 Cont ribución a la act ualización y mejora de los programas de libre acceso diseñados por el grupo
de invest igación, y que est án disponibles via Int ernet (en la dirección htt p://www.ub.es/mcr).
7.3. Capacidad formativa
La capacidad format iva del proyect o present ado viene respaldada por los resultados obt enidos en los
últ imos años, en los que se ha codirigido dos Tesis Doctorales y t res t esinas de Licenciat ura o Mast er
Experiment al en Química Analít ica. Además, se ha dirigido el t rabajo experiment al de una decena de
est udiant es nacionales y ext ranjeros, pre y post-grado.
Además, en est e período de t iempo se han generado alrededor de 50 publicaciones en revist as
nacionales e int ernacionales de not able índice de impacto y numerosas comunicaciones en congresos
nacionales e int ernacionales. Uno de los aspectos que se consideran más destacables son las
colaboraciones que se han iniciado y mantenido con diversos grupos de invest igación nacionales y
ext ranjeros. En los últ imos años se ha publicado los result ados de invest igaciones realizadas en
colaboración con una decena de grupos diferent es.
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