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Resumen

Despus de la exposicin a la luz y el logro del estado de equilibrio en el quimiostato,


Neurospora se cultiv en condiciones constantes de oscuridad a 25 C durante 6 das.
Muestras de biomasa fueron tomadas cada 4 h para la extraccin de ARN y de protenas,
y el estado del reloj circadiano se evalu mediante el ensayo de los niveles de tres
mRNAs expresados rtmicamente; frecuencia (FRQ), frq antisentido (qrf) y gene- reloj
controlado 14 (ccg-14), y mediante el control del ritmo de reloj controlado de la
esporulacin. Nuestros resultados indican que el reloj Neurospora continu ejecutar en el
quimiostato. Este es el tiempo ms largo registrado que Neurospora ha crecido en un
quimiostato en forma Wlamentous y abre la posibilidad de estudiar la respuesta de
Neurospora a una variedad de estmulos en ausencia de factores de confusin debido a
eVects; alteraciones en tasa de crecimiento, el envejecimiento y las condiciones
cambiantes del medio de crecimiento.
Introduccin
Neurospora crassa es un hongo Wlamentous del filo Ascomycota y un organismo modelo
muy conocida y utilizada para el estudio de numerosos fenmenos incluyendo; el
circadiano reloj (Dunlap y Loros, 2004), la transduccin de seal de luz (Linden et al,
1999;.. Liu et al, 2003) y silenciamiento gnico (Catalanotto et al., 2006). El genoma de
Neurospora ha sido secuenciado (Borkovich et al., 2004) y la supresin cepas gen y los
chips de microarrays de oligonucletidos estn disponibles facilitando genoma de los
enfoques para el estudio de la biologa de los organismos. Microarrays de
oligonucletidos manchado se han utilizado para siga la abundancia de transcripcin
durante la germinacin de asexual esporas (Kasuga et al., 2005). cDNA arrays tambin
han sido construido por laboratorios individuales y se utiliza para comparar la expresin
de los transcritos en los cultivos de Neurospora cultiva en diVerent fuentes de carbono
(Aign y Hoheisel, 2003; Xie et al., 2004), para identificar las transcripciones hasta
reguladas en respuesta a la luz y sobre-expresin de la componente de reloj y
fotorreceptor WHITE COLLAR-1 (WC-1) (Lewis et al., 2002), y para sondear expresado
circadianly (Correa et al., 2003; Nowrousian et al., 2003) y la temperatura inducida
(Nowrousian et al., 2003) transcripciones.
Hasta la fecha el anlisis molecular y bioqumico ha sido, en la principal, llevado a cabo
en cultivos discontinuos de Neurospora, desde que grandes cantidades de tejido se
pueden cosechar. Uno de los inconvenientes de cultivos discontinuos sin embargo, es que
no pueden ser mantenido durante un largo perodo de tiempo. Cuando Neurospora es
cultivadas en glucosa baja en la que el tejido se muere de hambre y se rompe, mientras
que si se cultiva en los altos de glucosa del tejido crece ms pronto la cultura XASK. Por
lo tanto, a menos que las muestras se pueden transferir a un medio fresco, la lnea de
tiempo de un experimento es limitado por el tamao del recipiente de cultivo y el tiempo
necesario para el agotamiento de los nutrientes y la consiguiente muerte celular. en
experimentos evect se pueden ejecutar para un mximo de 4 das. Otras desventajas de
los cultivos discontinuos son que la tasa de crecimiento y el entorno de crecimiento
cambian constantemente (Gibbs et al., 2000). A medida que el cultivo crece, los nutrientes
se agotan y productos del metabolismo excretan. Por ejemplo, el metabolismo de glucosa
produce CO2 que a su vez disminuye el pH del medio de crecimiento (RuoV et al., 2000).
Adems, la formacin de esteras hongos o pellets en los puertos de cultivo por lotes el
riesgo de condiciones de cultivo anaerobias de piezas de el micelio (Wittler et al., 1986).
As, en cultivo discontinuo, las condiciones pueden cambiar sustancialmente en el curso
de una experimento que complica la interpretacin de experimental resultados.
Las desventajas antes mencionadas de cultivos discontinuos son superar en cultivo
continuo o chemostat que factores conocido para impactar sobre la expresin gnica se
puede monitorizar y se mantiene a un valor predeterminado. En tales culturas tasa de
crecimiento y el rendimiento pueden ser controlados independientemente por alterando la
velocidad de dilucin y condiciones de nutrientes, respectivamente; y el pH y la
temperatura pueden ser controlados y ajustados de manera que Xuctuations se reducen
al mnimo para la duracin deun experimento. Dos estudios recientes utilizando
Saccharomyces cerevisiae (Hayes et al, 2002;.. Piper et al, 2002) subrayar la ventaja de
quimiostato en cultivos discontinuos para la obtencin la informacin ms fiable sobre la
evect de un tratamiento dado. Piper et al. la expresin de genes examinados en aerbico
y anaerbicamente crecimiento de cultivos de S. cerevisiae en dos diVerent laboratorios.
Ellos encontraron que las condiciones de cultivo eran un fuente importante de variacin
entre laboratorios, sino quevariacin se redujo en chemostat contra cultivos discontinuos.
Hayes y sus colegas informan los eVects de carbono y nitrgeno limitacin de la
expresin gnica global en S. cerevisiae. Este estudio pone de relieve la utilidad de las
culturas chemostat en el que la tasa de crecimiento puede ser controlada
independientemente de otras variables, permitiendo a los eVects principales de un
tratamiento y confundiendo eVects relacionados con el crecimiento secundario de ser
distinguido. Aunque los estudios antes mencionados tienen centrado en el transcriptoma,
claramente el resultado de protemico y los estudios metabolmicos tambin beneWt
desde el uso de cultivos chemostat.
El aspecto de la biologa de Neurospora nos interesa es la base molecular de la ritmicidad
circadiana. en Neurospora moleculares, bioqumicas, y los ritmos de desarrollo, son
controlados por un reloj circadiano; un controlador de tiempo biolgica con una
periodicidad de aproximadamente 24 h (Liu y Bell- Pedersen, 2006). Los relojes
circadianos se encuentran en miembros de La planta, reinos animal y de hongos y en
algunos procariotas (Bell-Pedersen et al., 2005). Ellos permiten a los organismos para
regular procesos celulares temporal y, a causa de esto, confiere una ventaja selectiva
(WoelXe et al., 2004; Green et al., 2002; Dodd et al., 2005). Varios genes que codifican
componentes del reloj de Neurospora; FRECUENCIA (FRQ), WHITE COLLAR-1 (WC-1),
BLANCO-COLLAR- 2, helicasa (WC-2) FRQ-asociado (FRH) y las quinasas y fosfatasas
que modifican estas protenas se conocen (Liu y Bell-Pedersen, 2006). Algunas de las
ltimas transcripciones y sus protenas codificadas son producidas y rtmicamente, junto
con los genes del reloj controlado rtmicamente expresadas, que se pueden utilizar para
controlar el tiempo en el reloj. Reloj el tiempo tambin se puede deducir por la
observacin de reloj controlado procesos de salida ms comnmente seguido siendo el
cambiar entre crecimiento de las hifas vegetativas y esporulacin asexual. Esporulacin
Rtmica de Neurospora en agar slido medio se mantiene durante perodos prolongados
en la oscuridad con una periodicidad de aproximadamente 22 h (Pittendrigh et al.,
1959).La regulacin de los genes del reloj y las interacciones de su ARN y protenas
productos han sido hasta ahora investigado el uso de tejido de cultivos discontinuos de
Neurospora. Perlman et al. (1981) fueron los WRST para mostrar que el reloj Neurospora
se ejecuta en cultivo discontinuo. Mantuvieron discos de Neurospora micelios en bajos
niveles de glucosa o medio de etilo en el que el crecimiento y diVerentiation fue
severamente restringido. los cultivos se cultivaron en luz constante (LL) a 25 C con
agitacin durante 33 o 48 h, respectivamente, entonces transferidos a 25 C DD. en
veces diVerent despus de la luz a individuo transferencia oscuro discos se colocaron en
medio de crecimiento slido y despus de varios crecimiento da el patrn de formacin
de conidios se utiliz para ensayar la tiempo en el reloj. En comparacin con un cultivo de
control inocul en medio slido al comienzo del experimento, los resultados indicaron que
el reloj contina funcionando en el cultivo lquido. Adems, la exposicin de los cultivos
lquidos a la luz (Perlman et al., 1981) y los pulsos de cicloheximida (Nakashima et al.,
1981), se mostr a restablecer el tiempo en el reloj, como se esperaba. El mtodo de
cultivo lquido Perlman et al. permitido a los eVects de productos qumicos en el
circadiano reloj a ensayar y el tejido que se recogern para bioqumica y el anlisis
molecular. Sin embargo, por las razones dado anteriormente, para ciertos estudios de
cultivos discontinuos estn a menos de ideal.
El objetivo de este estudio fue obtener condiciones que permitan cultivo continuo de N.
crassa en quimiostato. Una vez que esto era logrado lo que queramos saber si el reloj
circadiano estaba corriendo y si continu funcionando durante el estado de equilibrio el
cultivo. Aunque Neurospora se ha cultivado por mucho tiempo perodos de tiempo en
fermentadores condiciones de estado estacionario fueron no alcanzado (Rajan y Virkar,
1987; Su y He, 1997). en el ex fermentador estudio, air-lift se utiliza para la cultura
Neurospora en forma de grnulos para la produccin de tirosinasa. En estos ltimos
grnulos fngicas estudio se cultivaron durante 30 das en un biorreactor de perfusin en
el que la biomasa se llev a cabo de nuevo y provisto de nutrientes frescos. En el trabajo
Neurospora aqu se cultiv en forma continua en Wlamentous cultura quimiostato durante
7 das durante los cuales el circadiano reloj sigui corriendo. A nuestro entender este es el
Informe WRST del crecimiento de N. crassa en una cultura quimiostato.
Materiales y mtodos
Cepas y condiciones de cultivo de hongos
Neurospora crassa 30-7 bd A se utiliz como cepa en peso para el fermentacin y
mutante de delecin [93-4 bd; su-3; frq10 A](frq10) se utiliz como control para el anlisis
de protenas FRQ (Aronson et al., 1994). El medio deWned de Vogel (Vogel, 1956) se
utiliz, con glucosa (5 g l1 ) sustituido por sacarosa como fuente de carbono. Sales de
Vogel se prepararon a Concentracin 50 veces y esterilizado por membrana Wltration
(0,22? M de tamao de poro). Medios para cultivos XASK Shake (precultivos para
biorreactores) contenan 1,5 g EUR l1 Junlon (Joneset al., 1988) para promover el
crecimiento Wlamentous. Junlon eratambin se utiliza durante el cultivo utilizando una
concentracin quimiostatode 0,15 g l1 libras. Para placas de agar, los medios de
comunicacin se solidiWed porAdems de agar (15 g l1 ). Los conidios fueron
cosechadas a partirculturas de aproximadamente 4 das de edad cultivadas en agar-
solidiWedmedio de modiWed Vogel, con sacarosa (10 g l1 ) como lafuente de carbono.
Los conidios se lavaron oV la superficie del agar en10 ml de Tween 20 estril solucin
(20% w / v) mediante agitacin suavey Wltered a travs de dos capas de tejido del
cristalino. Elsuspensin de conidios se centrifug y se lav dos veces conagua estril
desionizada y se almacena a 4 C.
Cultivos discontinuos en Xasks sacudida se cultivaron en 250 ml Erlenmeyer Xasks que
contiene 50 ml de medio de cultivo. Los matraces se inocularon con 106 esporas ml1.
culturas se incubaron en un agitador rotatorio a 200 rpm a 30 C. cultivos lote utilizado
para la inoculacin de las fermentaciones se hicieron crecer en medio que contiene el
doble de la cantidad de glucosa (10 g l1 en vez de 5 g l1 ). Las fermentaciones se
llevado a cabo en un Applikon (FT Applikon Ltd., Tewkesbury, Reino Unido) biorreactor
(2,3 l de volumen de trabajo total) segn a los mtodos de (Wiebe y Trinci, 1991), el
medio que contiene 5 g de glucosa l1 EUR durante cultivos chemostat. Los cultivos se
inocularon con 5 EUR 50ml sacudir Xasks,mantenido a 25 C1 C y pH 5.50.1, agitado
en 900 rpm con un 3 de seis palas (dimetro 48 mm) Rushton impulsor de turbina y se
aire con 0.7vvm (EUR aire l [l culture1 EUR min1]). La formacin de espuma fue
controlada por continuo adicin de una mezcla de glicol de polipropileno (PPG) dediVerent
pesos moleculares PPG 1025 (BDH): PPG 2025 (BDH): FoamMaster PPG (peso
molecular mezclada; Henkel Performance Chemicals, Leeds, Reino Unido) en la
proporcin de 2: 2: 1 (Wiebe et al., 2001) para dar una concentracin de
aproximadamente Wnal 0,01% (v / v) PPG. La velocidad de dilucin se mantuvo constante
en 0.0740.004 h1. Traslado de lote a chemostat el cultivo se realiz a 23.25h, cuando
los niveles de CO2 de escape empezado a disminuir, lo que indica que el crecimiento
exponencial fase fue completa. Neurospora fue criado en la luz y mantenido a la luz de la
WRST 28 h, antes de cambiar a DD. muestras (50 ml) se tomaron en intervalos de 4 h
una vez el fermentador haba sido cambiado a DD.
La esterilidad de la chemostat
La esterilidad de la quimiostato se comprob para cada muestreo intervalo mediante la
difusin de 50? l de cultivo en placas de agar (2% w / v de sacarosa, medio de Vogel). Las
placas fueron luego se incuba a 30 C. Se tomaron muestras para microscopauna vez al
da y se analizaron utilizando un contraste de fase y 400 doblar magniWcation.
Fotografas fueron tomadas con una cmara digital (Olympus C5050Z, Olympus, Tokio,
Japn) que fue unido a la binocular del microscopio.
Medicin del crecimiento y biomasa
El crecimiento y la tasa de crecimiento speciWc mximo (? Max) durante la fase de
crecimiento por lotes en biorreactores se estim a partir la produccin de CO2 utilizando
un ADC 7000 analizador de gases infrarrojo (El Desarrollo Analtico Co Ltd. Reino Unido).
La biomasa de los biorreactores se midi por Wltering 2 8 ml de la cultura tomada
directamente desde el recipiente biorreactor en pre-sec y se previamente pesado de
papel Whatman No. 1 Wlter. la cosecha la biomasa se sec hasta peso constante (70 C
durante al menos 3 das).
Racetubes
Se utilizaron 30 cm estndar "tubos" de carreras (tubos de vidrio largas) para el anlisis
de la esporulacin asexual como se describi anteriormente (Kramer et al., 2003). Tubos
de carreras previamente calentado a 25 C se inocularon en DD usando 20? l de la
cultura que fuerontransferido desde el quimiostato a la superficie de agar de la tubo de
carrera. Tubos de carreras fueron incubadas en DD y en 25 C de temperatura y luz
controladas cmaras de prueba (Sanyo MLR-350, Sanyo, Osaka, Japn). El hongo crece
a lo largo del tubo a una velocidad constante de produccin de vegetativo hifas, y bandas
de esporas asexuales (conidios naranja). El frente de crecimiento fue marcado cada da a
las 10 pm y la patrones de bandas de conidios fueron analizados mediante CHRONO
(Roenneberg y Taylor, 2000).
La microscopa electrnica
Microscopa Electrnica de Transmisin (TEM) se utiliz para observar la estructura de
ultra de hifas vegetativas de N. crassa en medio con y sin Junlon. Pequeos trozos de de
tejido se Wxed en glutaraldehdo al 1% y 4% de formaldehdo en 0,1 M de cacodilato
buVer (pH 7,4) que contiene 0,15 M sacarosa y 2 mM de CaCl2 durante 1 h. Mensaje
Wxation se llev con reducida tetrxido de osmio (OsO4 al 1% + 1,5% K4Fe (CN) 6)
durante 2 h seguido por toda la noche en un Wxation solucin acuosa de 1% de acetato
de uranilo. Las muestras de tejido fueron despus se deshidrat a travs de una serie de
etanol, se transfirieron a acetona absoluta y inWltrated con baja viscosidad TAAB resina.
La polimerizacin se lleva a cabo durante al menos 24 h. Secciones de 70 nm de espesor
se cortaron en un Reichert-Jung Ultracut microtomo, en contraste con acetato de uranilo
acuoso 1% y 0,3% de citrato de plomo y observados con la FEI Tecnai 12 electrones
microscopio a 100 kV voltaje de aceleracin.
Preparacin de ARN y RT-PCR
Las muestras para el ARN y preparacin de protena (100 ml en total) fueron tomadas en
DD, Wltered a travs de 2? m Wlters, envuelta en papel de aluminio, inmediatamente
transferido a N2 lquido y se almacenaron a 80 C hasta que sea necesario. para el
extraccin de ARN del tejido en 50 ml de medio de cultivo(una media de 1 g de tejido) se
moli hasta en N2 lquido utilizando mortero. El ARN se extrajo posteriormente de 100
mg de tejido tierra usando la" Planta RNeasy Mini Kit "de Qiagen (Hilden, Alemania). la
extraccin se realiz de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes
modiWcations. Las clulas fueron zadas utilizando buVer RLC lugar de RLT y el volumen
buVer se multiplicaron por cuatro. RLC BuVer tiene la mayor capacidad de buVer y por lo
tanto ayudado a compensar el pH extremadamente baja encontrado en el lisado de tejido
crecido en presencia de Junlon. Cualquier contaminacin de ADN restantes fueron
eliminados por utilizando el "Kit de RNasa libre de DNasa" opcional (Qiagen). El ARN fue
preparado usando un quantiWed -spectrophotometer "Nanodrop" (Nanodrop
Technologies, Wilmington, EE.UU.) y se almacena a 80 C.
ARN utilizado para la transcripcin inversa semi-cuantitativa (RT)-PCR se verific a estar
libre de cualquier contaminante ADN utilizando 200 ng de ARN como molde en un ciclo
de 40 Reaccin de PCR (20? L) junto con los mismos cebadores y condiciones utilizadas
para la correspondiente RT-PCR. para transcripcin inversa del ARN (400 ng) de la "H
RevertAidMinus Primera Strand cDNA sntesis kit "(MBI Fermentas, Vilnius, Lituania) se
utiliza junto con los primers "frq r1702 "," F71 FRQ "o un oligo (dT) 18-cebador, la
orientacin transcripciones speciWc para frq, qrf o ARN-poli adenilado, respectivamente
(Tabla 1). Tras PCR (20? L) se llev a cabo con 1? l de RNasa tratado ADNc, Roche PCR
buVer (Roche, Basilea Suiza) con 1,25 mM MgCl2 y 10% (v / v) de DMSO, Taq-
polimerasa (Bioline, Londres, Reino Unido), 500? DNTPs M (Bioline) y 300 nmol de
cebadores bajo la ciclismo condiciones indicadas en la Tabla 1 productos PCR fueron
analizados mediante electroforesis en gel de agarosa estndar (Sambrook et, 1989), con
la consiguiente quantiWcation densitomtrico al. en un sistema de documentacin de gel
(Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) y el software "Scion Image" para Windows PC versin 4.0.2
(Rasband, 2000). Los datos se normalizaron utilizando niveles de actina mRNA basado en
(Pokorny et al., 2005).
Preparacin y anlisis de protena soluble total
Las muestras para la preparacin de protena fueron tomadas en DD, Wltered a travs de
2? M Wlters, envuelto en papel de aluminio, inmediatamente transferido a N2 lquido y se
almacenaron a 80 C . Los extractos de protena de 400 mg de tejido fundamental eran
obtenido en base a un protocolo previamente publicado (Garceau et al., 1997). Lisis de la
clula de tejido cultivado en presencia de Junlon demostrado ser insuYcient utilizando el
protocolo de Garceau et al. As, el protocolo fue modiWed mediante la adicin de un etapa
de sonicacin (15 explosiones de 240W 2 s cada uno, interrumpido por Intervalos de 1 s
de pausa, el uso de un aparato de ultrasonidos 600 W VCX, Sonic y Materiales, Newtown,
EE.UU.) despus de la incubacin de las muestras en buVer lisis. La protena soluble fue
quantiWed segn Bradford (Bradford, 1976) y se analizaron en desnaturalizante Geles de
SDS-PAGE (Sambrook et al., 1989) usando 150 g de protena por muestra.
El anlisis de transferencia Western
La deteccin inmunolgica de FRQ despus de SDS-PAGE se hecho por Western Blot-
siguiendo protocolos estndar (Rosenberg, 1996). Las membranas (Millipore-P, Millipore,
Schwalbach, Alemania) se hibridaron con anti-FRQ anti-suero como se describi
previamente (Garceau et al., 1997) y tratadas conforme a las instrucciones del fabricante
(Kit de deteccin de quimioluminiscencia Supersignal, Pierce Biotechnology, Rockford,
EE.UU.). Los resultados se visualizaron en HyperWlm ECL Wlm (Amersham, Little
Chalfont, Reino Unido).


Resultados y discusin
Curva de crecimiento y la morfologa celular
Cada cultivo quimiostato establece un equilibrio nico o en estado estacionario en el que
la tasa de crecimiento del organismo es igual a la tasa de dilucin (D). D se deWned como
el volumen (V) de medio que se suministra por unidad de tiempo (es decir, XOW tasa; dV
/ dt) dividido por el volumen de trabajo (V; volumen de el lquido de cultivo). Condiciones
de cultivo en estado de equilibrio fueron alcanzado en la velocidad de dilucin DD0.074
h10.004 h1. como tasa de dilucin en el estado de equilibrio es igual a la de
crecimiento speciWc tasa (?) del organismo, tambin est vinculado a la duplicacin
tiempo o tiempo de generacin (Tg) del organismo a travs de tgDln 2 /? (Herbert et al.,
1956).
Despus de alcanzar el estado de equilibrio del fermentador se mantuvo en la luz durante
28 h antes del cambio a la oscuridad constante. El experimento luego corri durante 6
das durante los cuales Se tomaron muestras para comprobar la morfologa de hongos,
peso seco, y el estado del reloj circadiano. CO2 fue de control permanente y dio una
medida de la respiracin. respiracin y peso seco mostr Xuctuations mnimos alrededor
de 2000 ppm y l1 6g EUR durante todo el experimento, respectivamente (Fig. 1).
La fermentacin de hongos Wlamentous puede ser problemtico con cambios en la
morfologa resultantes en la formacin de grnulos pesados que pueden conducir a una
acumulacin de biomasa, que prohben mantenimiento de las condiciones de cultivo
precisos y reproducibles (revisado en Gibbs et al., 2000). Durante nuestra primera
experimentos ajustados pellets esfricos compactos formados. Sin embargo, en presencia
de cido poliacrlico (Junlon) (Jones et al., 1988) no hay pastillas nunca se observaron, ni
problemas asociados con fijacin de las hifas al recipiente de cultivo, tubos asociados o
un agitador. Examen macro y microscpico de la culturadurante el curso del experimento
revel libremente grumos agregados de micelio en la suspensin dispersa (datos no
mostrados). Diluciones seriadas de la cultura en placas sobre medio mnimo creci con
morfologa normal y mostr No hay signos de contaminacin con otros hongos o
bacterias.
Aunque los eVects de polmeros como Junlon, Hostacerino Carbopol en la morfologa de
los hongos y Wlamentous Streptomycetes crecidas en cultivo lquido han estado bajo
investigacin durante algn tiempo (Elmayer et al, 1973;. Trinci, 1983; Hobbs et al., 1989)
y revisado en (Metz y Kossen, 1977), todava no est claro cmo su presencia se traduce
en morfologa alterada. Jones et al. (1988) encontraron que la adicin de tensioactivos
aninicos polmeros como Junlon y Carbopol impidieron la formacin de pellets de hongos
y el crecimiento Wlamentous mejorada y sugirieron que estos polmeros pueden
adsorberse a la superficie de las esporas y as evitar la agregacin de esporas por
electrosttica repulsin. Otros posibles mecanismos de accin que tienen ha sugerido son
revisados en Gibbs et al. (2000).

Circadiano reloj de salida
Una pequea cantidad de tejido fue transferido a la raza tubos cada 4 horas para analizar
el tiempo en el reloj circadiano. Varios posibles resultados pueden preverse (Fig. 2a). (1)
Si el reloj contina funcionando en el chemostat entonces la hora del reloj debe ser el
mismo en todas las muestras no importa en qu momento se inoculan en tubos de
carrera. As, cuando el crecimiento frentes se marcan las cultivos deben estar en el mismo
desarrollo etapa (. Fig 2a-1). (2) El reloj contina funcionando en la chemostat pero en la
transferencia a un medio slido se restablece por una cantidad dependiente del tiempo en
el reloj en la inoculacin (Fig. 2a-2). En este escenario la diVerence en el tiempo de la
formacin de conidios no ser consistente entre los tubos, pero vara segn la misma
cantidad cuando se transfiere al mismo reloj circadiano tiempo en das consecutivos, es
decir, para un reloj con un perodo de 20 h, las muestras inoculadas a las 2 de la maana
del primer da del experimento y 20 horas ms tarde a las 10 pm debe restablecerse a la
misma tiempo en la transferencia a un medio slido. (3) Los relojes en persona hifas se
desincroniza o ausente y permanecer as sucesivamente transferir a un medio slido para
que conidiacin es arrtmico (Fig. 2a-3). (4) Los relojes de hifas individuo se desincroniza
y en la transferencia a un medio slido correr con la fase media de los relojes en la
muestra (Fig. 2a-4). (5) La relojes en hifas individuales ya sea de ejecucin en la cultura
chemostat, se desincroniza, o ausente, pero el traslado a slido medio el reloj est
ajustado a un tiempo deWned. En este caso en transferir el ritmo en la cultura recin
inoculado ser retrasado por 4 h con respecto a la muestra inoculada previamente (Fig.
2a-5).
Hemos encontrado que la formacin de conidios de las muestras fue chemostat rtmica
con un perodo de 20.20.8h. La razn de esto ms corto que la duracin previsible no se
conoce. Seguidamente graficamos el calendario de la tercera cumbre de conidiacin de
culturas transferido a medio slido en 4 intervalos h el da 1 hasta el da 6 de DD (. Fig
2b). Se encontr que las muestras chemostat a seguir una lnea recta que se desvi en su
vertiente de la pendiente espera que si el reloj se restablece siempre a la misma hora
transferir a un medio slido. Por lo tanto, la comparacin con los resultados esperado en
los escenarios hipotticos (1) - (5) anterior indica que, o bien el reloj no se est ejecutando
en la cultura chemostat y comienza a oscilar de un pequeo rango de tiempos en traslado
al nuevo medio, o que la transferencia de la chemostat cultura en medio slido restablece
el reloj a una pequea rango de tiempos que son dependientes de la hora en el reloj
momento de la inoculacin. En este ltimo caso, los cultivos tomados de la chemostat a
veces de reloj similares deber ser repuesto en el mismo tiempo en la transferencia a un
medio slido. A la inversa, las muestras tomada en tiempos de reloj diVerent no debe
reiniciar con el mismo fase. En la fig. 2c el momento de la formacin de conidios de las
muestras transferidas de raza tubos a las 2 am en das consecutivos se traza y la fase
promedio de tiempo de la formacin de conidios de muestras tomadas 20 h aparte se da
debajo de la grfica. Si un reloj con un 20 h perodo se est ejecutando en el chemostat
estas muestras todos deben estar a la misma hora del reloj y, por tanto, poner a cero al
mismo tiempo en la transferencia de raza tubos. De hecho, esta es exactamente lo
muestran los datos.
Molculas del reloj circadiano
Otro medio para ensayar la funcin de reloj es buscar expresin circadiana del reloj
conocida y los genes del reloj controlado. Por lo tanto, monitoreamos los niveles de 3 reloj
regulados-transcripciones: frq, qrf y ccg-14. Inicialmente extraccin de ARN y protenas
del tejido era problemtica. Siguiendo los protocolos recomendados de Qiagen dieron
como resultado ARN degradado y bajo rendimiento de protena. La razn de esto fue
rastreado hasta el pH cido del extracto de clulas derivadas de la utilizacin de Junlon
en el medio de cultivo. Junlon es un cido poliacrlico que signiWcantly reduce el soluble
en agua pH del medio. Sin embargo, durante el cultivo en quimiostato la pH se mantuvo
constante a 5,5. El tejido se recoge mediante vaco Wltration, chupar rastros OV de buVer
unidos a los micelios. Sin embargo, el tejido crece en la presencia de Junlon result en un
lisado con un pH de 4,3, 2,2 unidades menor que para un no-Junlon tratada control. Esto
sugiere que el pH bajo se debe a algo liberada por las clulas cultivadas en presencia de
Junlon. Este bien podra ser en s Junlon o un metabolito fngico sintetiza como una
reaccin a la exposicin a Junlon. Adems, la tensin de oxgeno y / o la fuerza mecnica
ejercida sobre las clulas fngicas puede alterar la morfologa de la pared celular que
dificulta la extraccin de protenas eYcient. Sin embargo, la microscopa electrnica lleva
a cabo en quimiostato y cultivos discontinuos cultivadas en presencia y ausencia de
Junlon exhibi pocos o ningn diVerences obvias (Fig. 3).
Con el fin de comprobar el reloj molecular, el ARN se extrajo a partir de tejido quimiostato
se utiliz para RTPCR semi-cuantitativa focalizacin frq, qrf y ccg-14. Se utilizaron los
niveles de ARN de actina para calcular los niveles relativos de transcritos (Fig. 4). Dado
que los niveles de ciclismo de transcripcin frq son indicativos de un reloj funcional que
analizaron el ARN frq y tambin el ARN antisentido frq, qrf. Estas transcripciones ciclan
fuera ofphase uno con el otro como se inform anteriormente (Kramer et al., 2003), pero
la periodicidad vari entre 16 y 24 h. en el cultura chemostat CCG-14 picos alrededor de
DD 18 y para el WRST de 5 das en DD ciclo de niveles, en consonancia con la presencia
de un reloj circadiano en la cultura quimiostato que se establece en subjetivo oscuridad
por la luz de transferencia oscuro y se ejecuta con una aproximadamente el 22 perodo h.
Periodicidad similar y fase de los niveles mximos de CCG-14 mRNA han sido reportados
por Zhu et al. (2001), utilizando el tejido cultivado en cultivos discontinuos.
Funcin de reloj no depende nicamente de ciclismo frq Protena de ARN, tambin debe
FRQ ciclo en el transcurso de un da. Por lo tanto, se extrajeron las protenas totales de
las muestras y se sondearon transferencias Western para FRQ. Obtuvimos tan baja
rendimientos de protena utilizando nuestro mtodo de extraccin estndar que Se
ensayaron una serie de protocolos (Fig. 1, complementaria datos). Cuando los volmenes
iguales de muestras de protena extrada desde el mismo peso del tejido por mtodos
diVerent eranseparados por SDS-PAGE, la protena extrada de quimiostato muestras
mediante incubacin en un buVer basado en HEPES siguieron por sonicacin dio un
rendimiento y protena Prowle similares extraer de cultivo discontinuo crecido en ausencia
de Junlon. Sin embargo, la concentracin de protena de las muestras chemostat tal como
se mide por los mtodos de Lowry o Bradford dio concentraciones consistentemente ms
altos que los indicados en Geles teidos con Coomassie. Por lo tanto de acuerdo con
Lowry y Ensayos de Bradford que cargan 5 veces ms protenas de chemostat en
comparacin con muestras de protena extrada de lote cultivo. Creemos que algo en el
chemostat extractos interfiere con los ensayos de protenas nos la dasuperior a lecturas
esperados. Por tanto, comparamos los volmenes de los extractos de las muestras
chemostat que nos dio tincin similar al cultivo discontinuo extrae en geles de
poliacrilamida teidos con azul Coomassie. Sin embargo, encontramos que en protena
extrada de las muestras durante el segundo da de oscuridad constante en la protena
FRQ chemostat no poda detectar, y nuestra mejor evidencia de que un reloj se est
ejecutando en la cultura chemostat mantiene los niveles de ciclismo de frq, qrf y ccg-14
ARNm y el hecho de que la formacin de conidios en la carrera tubos no sigue el patrn
esperado si el reloj es restablecer a una vez speciWc. Estudios anteriores han
demostrado que FRQ es un componente clave de la frq Neurospora basa wc-/ reloj
circadiano y que en nulo frq cepas ritmicidad circadiana de ciertos genes de la
esporulacin y se pierde (Dunlap y Loros, 2004). Aunque frq-menos osciladores son
conocidos de existir (de Paula et al., 2006) y revisado en (Lakin- Thomas y Brody, 2004;
Dunlap y Loros, 2004; MERROW et al., 2003), lo que podra, en teora, se conduca el
ritmicidad inform aqu, tambin es posible que FRQ es presente en el chemostat por
debajo de nuestro nivel de deteccin o se pierde durante la extraccin de protenas.
Conclusin
Varios documentos ahora ensalzan las virtudes de cultivos chemostat para
transcriptmica (Hayes et al., 2002) y la protemica (Kolkman et al., 2005) el trabajo
porque las condiciones de cultivo pueden ser controlados y son ms fciles de reproducir.
Estos estudios tienen bacterias usadas o levadura en ciernes que son considerablemente
ms fcil a la cultura de forma continua de hongos Wlamentous que puede cambiar las
formas de crecimiento dependiendo de las condiciones de cultivo, formando grnulos o
grumos de tejido que dan lugar a un no cultura homognea. Aunque las culturas
chemostat de un nmero de hongos Wlamentous se han reportado incluyendo Penicillium
chrysogenum (Withers et al., 1995), Fusarium venenatum (Wiebe et al., 1992, 1996),
Trichoderma reesei (Pakula et al., 2005), Aspergillus niger (Mainwaring et al, 1999;.. Swift
et al, 1998, 2000), Aspergillus nidulans (Rowley y PIRT, 1972; Sims Aspergillus oryzae
(Withers et al., 1994), esto es et al., 2005) y el informe WRST de las condiciones para un
crecimiento exitoso de N. crassa en chemostat cultura. Nuestros resultados indican que
bajo estas condiciones, el reloj circadiano se ejecuta durante un perodo de por lo por lo
menos seis das en la oscuridad despus de ajustar el reloj a travs de exposicin a la
luz. En esas plantas, hongos y animales para que temporal de la expresin gnica ha sido
objeto de seguimiento, aproximadamente 10 15% del transcriptoma est regulada
circadianly (DuYeld, 2003). Por lo tanto, en el caso de Neurospora, y quizs enotros
hongos, incluso en las condiciones altamente reproducibles de chemostat cultivos
variabilidad en la expresin de genes podra proWles surgir de la cosecha de cultivos en
forma apropiada en fase.
La capacidad de crecer en la cultura Neurospora chemostat voluntad permiten a los
diversos aspectos de la biologa circadiana a estudiar. Dado que muchas mutaciones son
pleiotrpicos y no slo aVect ritmicidad circadiana, sino tambin la tasa de crecimiento, la
capacidad de desacoplar tasa de crecimiento y rendimiento celular es importante en el
tratamiento la contribucin de eVects reloj-speciWc de mutante alelos a la supervivencia,
y por el contrario votaciones de growthrelated fenmenos en la hora del reloj. Muchos
procesos metablicos por ejemplo la ingesta de nutrientes, estn bajo circadianode
control y de los productos intermedios y los productos finales de algunos procesos
tambin retroalimentacin a aVect circadiano reloj controlado de temporizacin. De hecho,
la periodicidad variable (204h) de frq, qrf y ccg-14 expresin de ARNm y el deterioro de
la periodicidad durante los das 6 y 7 de mayo reXect la prdida de realimentacin ciclos
entre el organismo y el medio debido al mantenimiento de condiciones de cultivo
constantes. La asimilacin de nitrgeno y el metabolismo (Christensen et al, 2004;.
Roenneberg y Rehman, 1996), pH celular (Eisensamer y Roenneberg, 2004) y redox
(Ivleva et al, 2005;. Y revisado en Merrow y Roenneberg, 2001), se ha informado a afectar
a los relojes circadianos. Sin embargo, aunque est claro que el metabolismo proporciona
la energa para la ritmicidad circadiana y puede tambin actan como un zeitgeber, la
medida en la que juega un papel en generacin ritmo es todava debatido. La capacidad
de controlar condiciones de tipo de crecimiento y de crecimiento en cultivos chemostat
voluntad no slo permitir a esta pregunta bsica que debe abordarse, pero lo har
mejorar la transcriptmica travs de la reduccin en la variacin de la cultura, y permitir
que los agentes farmacolgicos que se utilizarn para sondear funcin de reloj
independientemente de los cambios de tasa de crecimiento.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Aleksandr Mironov en la EM Facilidad en la Facultad de
Ciencias de la Vida de la Universidad de Manchester por su ayuda en la preparacin de
muestras EM, y el Wellcome Trust para apoyo financiero a las instalaciones de EM.
Tambin agradecemos a Seona Thompson para la asistencia tcnica, Jay Dunlap
(Escuela de Medicina de Dartmouth, New Hampshire) para el tipo de regalo de anticuerpo
FRQ, y estamos en deuda con Cristiano Heintzen para comentarios sobre el manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por el BBSRC.