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Anlisis mediante DGGE ( modelo CBS and Scientific CO, DGGE-2401-250VDC, 30w/80 mA)

Se basa en la composicin de bases de los productos amplificados. Las bandas mas altas sern
aquella cuyos productos PCR tengan menor proporcin de GC.
0 Encender la cubeta con TAE 1X y poner el termostato a 70C ( Utilizar este tampn solo para
6 carreras) para evitar bajar demasiado la temperatura al cargar las muestras. Es posible correr
muestras de ADN y ARN en la misma carrera pero no en el mismo gel.
1 Limpiar los cristales con agua y etanol al 75% y secar bien con papel para quitar cualquier
resto de acrilamida.
2 Colocar las gomas amarillas en el cristal completamente rectangular y con el pequeo
reborde que tiene la goma orientada hacia el lado en que vamos a pegar el otro cristal que
lleva una hendidura en la parte superior.
3 Poner las dos bandas transparentes con la parte redondeada hacia abajo y separadas un
milmetro de la goma amarrilla. A continuacin poner el otro cristal, ajustndolo
correctamente y sujetarlos con pinzas, dos en cada lado. Pintar el stop del gel un dedo por
debajo del peine, para dejar espacio suficiente para el stanking gel.
4 Chequear el aparato de crear el gel con aguapara comprobar que esta limpio de restos de
acrilamida y secar con un rulo de papel. Limpiar la pieza metlica donde se conecta la aguja
con la aguja. Una vez limpio todo y montado, se vuelve a aadir agua y se comprueba si el agua
sale correctamente por la aguja (tiene que salir un chorro, no gotas).
5 Previamente se habrn preparado los reactivos necesarios para los geles. (abajo se indican
los clculos para 4 geles)
Reactivos buffer 35%
10 ml 40% acrilamida= 8% final (acrilamida/bisacrilamida 40% solution Sigma A7168-100ml) se
conserva a 4C
1 ml TAE 50X pH 8.0 (autoclavado)
1ml Glicerol>99% (Sigma 65516-1L)
7 ml formamida 99%(Sigma 295876-1L, Spectrophotometric grade)
7,35 g urea, (U5128-1kg ACS reagent 99.0-100.5%)
Agua esteril hasta completar los 50 ml del tampn.
Reactivos buffer 55%
10 ml 40% acrilamida
1ml TAE 50X
1 ml glicerol
11ml formamida
11,55g urea
Agua 50 ml
Stanking gel 0%
5ml 40% acrilamida
1ml TAE 50X
1 ml glycerol
43ml agua
Loading buffer (es el mismo que el de la PCR convencional) Se aade 6 ul de loading buffer por
cada 20 ul de muestra de PCR . La cantidad de muestra a correr depende del tamao de los
amplicones. En este caso es de 233 bp y se ponen los 25 ul de muestra.
Blue Bromophenol 0.25%
Glicerol 70%
TAE 1X
Preparar APS 10% (0,1g/1ml) contribuye a una polimerizacin mas lenta. (Sigma A-3678-100g
al 98%).
Para preparar un gel son necesarios dos falcons de 15 ml uno de 55% y otro de 35%. A los
cuales hay que aadir 80ul de APS + 5ul TEMED (Sigma T-9281 25ml 99%) y mezclar
invirtiendo.(Se aaden en el mismo momento en que van a ser utilizados)
6 Cerrar parcialmente la llave entre los dos compartimentos, aadir un poco del contenido
del buffer de 55% dentro del aparato para crear el gel y comprobar que caen gota por la aguja
al abrir la palometa. Cerrar la palometa y la llave entre los compartimentos y devolver el resto
de buffer de 55% que pasa al otro carril con pipeta Pasteur a su compartimento y limpiar con
rulo de papel el otro carril.
7 Aadir todo el tampn de 55% en el compartimento de la derecha y el de 35% en el
compartimento de la izquierda. Aadir un pequeo imn en el compartimento de 55% y agitar
a nivel 3.
8 Poner la aguja entre los dos cristales y abrir la llave entre los dos compartimentos con los
buffers y la palomita para llenar los cristales y crear el gel. El agitador con el modulo de crear
los geles debe estar mas alto que los cristales a rellenar. Cuando hayan salido casi todo los
buffer inclinar ligeramente el contenedor de los buffer para que baje todo su contenido hasta
la marca hecha previamente en los cristales ( inclinar con cuidado para evitar que se formen
burbujas). Si se formara alguna burbuja en el gel eliminarla dando golpes con los dedos.
9 Una vez lleno los cristales con el gel aadir isopropanol con una jeringa con aguja para
nivelar el gel antes de aadir el stanking gel. Los reactivos para hacer los geles se deben
prepararse al mismo tiempo. Siempre es necesario que dos y dos de los cuatro geles estn
preparados al mismo tiempo.
10 Esperar 1 hora a que gelifiquen los geles, eliminar el isopropanol volcando y utilizar tiras
de papel whatman para eliminar los restos. Poner los peines y dejar un poco separados para
que quepa la aguja de la jeringa con el stanking gel al que previamente se le han aadido 10 ul
de TEMED. Esperar 30 min a que polimerize.
11 Quitar los peines y lavar los pocillos con agua, eliminar el exceso de gel de los pocillos
cortndolo con una paleta metlica .Eliminar las pinzas de los laterales de los cristales y quitar
la goma amarilla de la pate inferior de los cristales pero no de los lados. A continuacin
colocar los cristales en los soportes con el cristal con la mella hacia arriba y hacia dentro de
manera que queden enfrentadas las dos partes melladas cada dos geles y sujetar con pinzas a
los soportes (dos a cada lado). Comprobar que se ha llenado de tampn el espacio de los
soportes entre cada dos geles una vez sumergidos los soportes en la cubeta.
12 Conectar las gomillas trasparentes del modulo de temperatura a los soportes y dejar hasta
cargar las muestras. El tampn de la cubeta cubre dejando libres la zona de los pocillos en los
cristales. Los peines son de 16 pocillos pero hay que tener en cuenta los marcadores y que no
se deben cargar los pocillos de los extremos de los geles porque corren mal generando
sonrisas. Se deben correr como mximo 8 muestras y 3 marcadores o 10 muestras y un
marcador . No son necesarias replicas.
En este caso se van ha utilizar 3 marcadores, Lactobacillus ( cargado al principio del gel),
Bacteroides prevortella (en medio) y Bifidobacterium (al final).
Estos controles se han obtenido mediante cultivo de las bacterias, se han extrado el ADN y el
ARN y se ha realizado la PCR para la subunidad ribosmica 16S con los mismos primers
utilizados para amplificar las muestras. Luego se han comprobado en un gel que aparecen
distintas bandas correspondientes a distintas cepas.
Una vez cargados los geles poner a correr a 60V y 60C toda la noche. No conectar agitacin en
la cubeta hasta que las muestras no hayan pasado el stanking gel. En este caso no se utiliz
agitacin.
13 Una vez que los geles han corrido se van sacando los soportes de la cubeta, se liberan los
cristales. A continuacin se coge una cubeta se moja con agua y se deja un poco, se coloca
papel de parafilm mas ancho que la cubeta para luego transportar y cubrir el gel. Se aade
agua al parafilm y se levanta con cuido el cristal con la mella con la ayuda de una esptula. Se
quita el stanking gel con la esptula y se corte una esquina superior del gel para conocer la
orientacin posterior del gel. Mojar el gel con agua destilada a presin para levantarlo.
Moverlo con la mano suavemente para ver si est suelto y dejarlo resbalar sobre el papel de
parafilm. Eliminar los restos de agua volcando la cubeta y sujetando el gel con la mano. Cortar
un pedazo grande de papel de aluminio, apagar la luz y aadir el SYBR SAFE (ya diluido) hasta
cubrir el gel. Mover el gel ligeramente con la mano para que quede bien sumergido y sin
burbujas y cubrir la cubeta con papel de aluminio. Incubar 35-40 min a temperatura ambiente
y en oscuridad. Una vez transcurrido este tiempo, devolver el SYBR al bote sujetando el gel con
la mano , se puede reutilizar hasta 6 veces.
14 Encender previamente el aparato para adquirir la imagen de los geles (35 min antes) (
Typhoon 9400 variable Mode Imagen). Poner el gel en el Typhoon quitando el parafilm y
estirarlo con la ayuda de agua destilada. Quitar los restos de agua con una pipeta o con papel
poner una regla que coincida con el comienzo y fin del gel y cerrar la tapa del aparato.
Escanear el gel con el Thyphoon Scaner Control. Seleccionar su posicin en el aparato y su
fluorescencia (600, 620 o 640 V)cuanto mas V mas se incrementa la intensidad de las bandas.
Escanear durante 25 min.
15 Una vez escaneada la foto correctamente se recupera el gel y se vuelve a colocar en el
papel de parafilm con ayuda de agua destilada, se envuelve con el parafilm y se mantiene en
oscuridad en su cubeta. Para mantenerlos a 4C se envuelven adems en papel de aluminio.
16 Se arreglan las fotos escaneadas con el photoshop para quitar inespecificidades y se
analizan con el programa ImagenQuant 5.0 TL
1 Elegir 1 D gel anlisis
2 Abrir la imagen a analizar en Tif
3 Automatic
4 Select edit Mode
5 Edit single lane, se puede modificar con el ratn la direccin de las bandas por columnas si
fuera necesario.
6 Aceptar
7 Band detection (se van pinchando las bandas 1 a una para ver su anlisis)
Si no nos gusta el anlisis podemos:
Peak detection-Noise reduction: (1) analiza las bandas 1 a una)
% Max Peak (5)
Seleccionar la ventana de Measurement y obtenemos una cuadro con N band /Intensited
%(intensidad relativa entre muestras)/ Ff (posicin de unas muestras respecto a otras)
Para evitar problemas con las bandas al medirlas poner los limites lo mas pegados posibles.
8 Finalmente marcar export file- excell mode.
17 Para cortar las bandas coger el gel y ponerlo en luz UV identificar las bandas y cortarlas o
bien, imprimir una foto con las selecciones, ponerlas debajo del gel, para hacerlos coincidir y
cortar las bandas.
18 Poner las bandas cortadas en 50 ul de TE e incubar a 4c toda la noche, centrifugar y
quedarnos con el sobrenadante que tiene el ADN o el ARN. Se amplifica este ADN o ARN con
los primers 16S sin el clamp GC para hacer PCR a tiempo real cuantitativa. Se puede aadir un
patrn cualquiera como curva estndar. Finalmente, este producto se concentra y se manda a
secuenciar.