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8. CUESTIONARIO

1. EXPLIQUE QUE OTROS MÉTODOS EXISTEN PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS

Los métodos mas comúnmente empleados son:

- Kjeldahl,

- Kjeldahl/Bethelot,

- Biuret,

- Lowry,

- absorbancia a 280 nm,

- fijación de colorantes,

- turbidimétrico.

Método de Kjeldahl

FUNDAMENTO

- Involucra la conversión del nitrógeno presente a sulfato de amonio por OXIDACIÓN HÚMEDA con ácido sulfúrico.

- Posteriormente el sulfato de amonio se descompone por ALCALINIZACIÓN con hidróxido de sodio y DESTILACIÓN del amoníaco liberado captándolo en una solución ácida.

- Finalmente se realiza una VALORACIÓN del amoníaco.

- Esta determinación incluye todo el nitrógeno reducido presente (-NH2 y =NH), de modo que los compuestos amoniacales, urea y aminoácidos libres son también valorados.

Método de absorbancia a 280 nm

- El método se basa en la medición de absorbancia a 280 nm.

- Las proteínas poseen una banda de absorción en el UV entre190 y 290 nm debida fundamentalmente a la presencia de aminoácidos aromátcos (tirosina, triptofano y fenilalanina).

- Es un método simple, rápido y no destructivo.

- Es un método directo para la determinación de proteínas que puede aplicarse en algunos sistemas alimenticios.

- Es necesaria la calibración con una proteína estándar.

- La solución debe ser clara e incolora, la turbidez puede afectar los resultados.

- El contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente entre las distintas proteínas.

- Los ácidos nucleicos interfieren, no así el amonio.

Método de Biuret

- Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina, formando un quelato color violeta de configuración desconocida.

- La intensidad de color del complejo a 550 nm es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la muestra.

- Es rápido, simple y no detecta nitrógeno de fuentes no proteicas o no peptídicas.

- Es necesaria l a calibración con una proteína estándar.

- Altas concentraciones de carbohidratos, lípidos pueden causar opalescencia en la solución final.

- Las sales de amonio también interfieren en la reacción.

- Se ha encontrado poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.

Método de Lowry

- Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisteína e histidina.

- La absorbancia del complejo se lee a 750 nm (mayor sensibilidad) o a 500 nm.

- Tiene mayor sensibilidad que el método del Biuret.

- La respuesta del color varía de acuerdo al tipo de proteína.

- La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteína.

- Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reacción.

- Es menos afectado por la turbidez de la muestra.

- Es afectado por la presencia de azúcares reductores al igual que el método de Biuret.

Métodos de adhesión de colorante

- Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reacción.

- Es menos afectado por la turbidez de la muestra.

- Es afectado por la presencia de azúcares reductores al igual que el método de Biuret.

- Pueden adherirse colorantes ANIÓNICOS o CATIÓNICOS (BRADFORD).

- Sus fundamentos son diferentes.

- El COLORANTE ANIÓNICO se une a los grupos catiónicos de los residuos básicos de las proteínas (histidina, arginina, lisina) y forman un complejo insoluble.

- El colorante en exceso permanece soluble y se relaciona inversamente con la concentración de proteínas.

- El método con el colorante NARANJA 12 está descripto en la AOAC para leche fluida, helados, leche en polvo descremada (λ=480 nm).

- Algunos compuestos no proteicos como almidón o metales pueden unirse al colorante.

Métodos de Bradford

- El Se basa en la unión del colorante Coomassie Blue G-250 a las proteínas.

- Las proteínas (aminoácidos básicos y aromáticos) se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.

- Este método es sensible, simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación.

- Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

- No interfieren los carbohidratos.