Está en la página 1de 40

TECNOLOGIA DEL DNA

RECOMBINANTE
Rocio Inga Pea, MSc.
Departamento de Ciencias Celulares y Moleculares
Facultad de Ciencias y Filosofa - UPCH
Gen GFP
Gusano
Aequorea_victoria
The cover of Science for February 11, 1994
(1994, Vol. 263, Number 5148 ) showing GFP in
C. elegans neurons.
Chalfie M PNAS 2009;106:10073-10080
2009 by National Academy of Sciences
Protena verde
fluorescente (GFP)
Moen, I. et al. BMC Cancer. 2012, 12:21
De qu modo son creados los animales o
plantas transgnicas?
De qu manera se inserta un nuevo gen dentro
de un organismo?
De qu modo se puede asegurar que el nuevo
gen se expresar del modo correcto?
Se puede mejorar genticamente la actividad o
velocidad cataltica de una enzima?

Electroforesis (separacin de DNA, RNA, protenas)
Digestin por enzimas de restriccin
Clonamiento de genes -uso de vectores DNA Recombinante
Hibridacin de cidos nucleicos
Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)
Secuenciamiento de DNA
TECNICAS BASICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
Generacin de una nueva molcula de DNA por la
combinacin artificial de dos molculas de DNA de
diferentes orgenes


Clonamiento:
aislamiento e insercin de un fragmento de DNA
particular dentro de un vector (por ej.: Plsmido)
permite obtener una gran cantidad de copias de ese
fragmento en particular, para poder analizarlo,
secuenciarlo o modificarlo.
Secuencias palndromes
Eje de simetra
Palndrome: una secuencia que
es leda de 5a 3 de igual modo
en cadenas complementarias)
Las enzimas de restriccin son enzimas dimricas
que reconocen secuencias palndromes (la
interaccin DNA-protena es especfica, basta una
base cambiada para que no sea reconocida)
Enzimas de restriccin de tipo II
Son endonucleasas que reconocen y cortan
secuencias de DNA especficas de tipo
palndrome.
Extremos cohesivos o
pegajosos
Dependiendo de cmo se
da el corte, se generan
extremos cohesivos o
pegajosos(skicky ends),
o extremos romos (blunt
ends)
extremos romos
(blunt ends)
DNA
recombinante
Fragmentos de DNAs con extremos cohesivos de
secuencia complementaria pueden interactuar entre s y
luego ser unidos covalentemente por la DNA ligasa
CLONAMIENTO DE UN
FRAGMENTO DE DNA GENMICO
EN UN DNA PLASMIDICO
Si ambos DNAs se cortan con la misma
enzima de restriccin, los extremos
generados sern compatibles
plsmido recombinante
Extremos cohesivos
Elementos de un vector de
clonamiento:
a) ORI (Origen de replicacin)
b) Polylinker o MCS (multiple
cloning site)- lugar donde se
insertar el fragmento de DNA
c) Marcador de seleccin (por ej.:
gen de resistencia a un
antibitico)
Clonamiento con dos enzimas de restriccin
Fragmentos
diferentes
Plasmidos
recombinantes
diferentes
Resultan 4
colonias
(contienen
diferentes
plsmidos)
clonas
(idnticas)
dentro de
cada colonia
http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/pages/bcs-
main.asp?v=category&s=00010&n=09000&i=09010.05&o=|00510|00610|00520|005
30|00540|00560|00570|00590|00600|00700|00710|00010|00020|00030|00040|00050|0
1000|02000|03000|04000|05000|06000|07000|08000|09000|10000|11000|12000|1300
0|14000|15000|16000|17000|18000|19000|20000|21000|22000|23000|99000|&ns=865
Clonamiento Lodish (copiar y pegar el link)
Animacin de clonamiento
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/nonmajorsbiology
/dnalibrary.html
Clonamiento de fragmentos de DNA (creacin de una librera genmica):
OTRAS ANIMACIONES
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/dynamicillustr
ations/paternitytesting.html
Test de Paternidad:
Electroforesis y Enzimas de Restriccion:

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.html
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html
VECTORES DE
CLONAMIENTO
Plsmidos : 10 kb -20 kb
Csmidos : hasta 45 kb
YACs (Yeast Artificial Chromosomes) : hasta 1000kb
(cromosomas artificiales de Levadura)
Plsmido Ti / Agrobacterium tumefaciens: para plantas
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) : hasta 300 kb
Bacterifago Lambda : hasta 25 kb
TIPOS DE VECTORES DE CLONAMIENTO : segn
su capacidad de clonamiento (el tamao mximo del
fragmento a insertar)
YACS
(Cromosomas
artificiales de
levadura)
Biblioteca Genmica
vs.
Biblioteca de Expresin
- Conjunto de vectores que contienen fragmentos de
DNA genmico de un organismo (incluyendo
secuencias repetitivas, secuencias intergnicas, genes
completos, pseudogenes, transposones, etc)
BIBLIOTECA GENOMICA
Conjunto de vectores que
contienen los cDNAs de un tipo
celular o tejido especifico
cDNA = DNA
copia/complementaria producida
por transcripcin reversa a
partir de mRNA)
Anlisis de secuencias
codificantes (genes)
Anlisis de mutaciones (por
mutagnesis dirigida)

BIBLIOTECA DE EXPRESION
mRNA maduro

cDNA

insertado en
un vector de
expresin
Clonamiento de un fragmento de cDNA:
1. Purificacin de RNA mensajero
2. Transcripcin reversa a cDNA (DNA copia)
3. Clonamiento a un vector de expresin
4. Transformacin bacteriana
Vector de Expresin
APLICACIONES DE LA
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
Aislamiento y anlisis de genes especficos
(generacin de informacin investigacin bsica)
Mayor informacin desarrollo de mejores sistemas
de diagnstico y diseo de drogas o terapias.
Produccin de protenas recombinantes en bacterias o
en sistemas eucariotes (protenas humanas, animales
o de otras especies bacterianas, para uso clnico, de
investigacin bsica o investigacin aplicada)
Ingeniera gentica de protenas (modificacin de las
propiedades de protenas, o de la actividad cataltica
de enzimas)
Plantas y animles transgnicos
Terapia gnica
Algunas aplicaciones:
INFO
ADICIONAL
Algunas enzimas de restriccin son sensibles a la metilacin
(no podrn cortar el DNA si la secuencia de reconocimiento
est metilada). Por cada enzima de restriccin hay tambin
una enzima methylasa para esa secuencia especfica.
Illustrated in Figure 2 is an Aequorea victoria GFP mutation map showing many of the common mutations
superimposed on a topological layout of the peptide structure. The beta-sheets are numbered and depicted as thin, green
cylinders with an arrow pointing towards the C-terminus, whereas alpha-helices are depicted by blue barrels. Mutations
are color-coded to represent the variants to which they apply: BFPs (blue), CFPs (cyan), GFPs (green), YFPs (yellow),
and Sapphire (violet). Folding, shared, and monomerizing mutations are indicated with gray ellipses. Note that almost 75
percent of the mutations are located in the central helix and beta-sheet strands 7, 8, and 10. In general, wavelength-
specific mutations occur near the central helix containing the chromophore, while folding mutations occur throughout
the sequence.
Mapa de restriccin del Vector plasmdico pGEM-T
(tiene 2 promotores, por lo tanto se puede transcribir ambas
hebras, dependiendo de la RNA polimerasa que se utilice)

1. Nelson, D.L. & Cox, M.M. Lehninger Principles
of Biochemistry. (Captulo 9 -5ta edicin)

2. Lodish et al. Molecular Cell Biology.
(Captulo 5 6ta edicin)

3. Stryer L. et al.- Biochemistry.
(Captulo 5 -7. edicin: Exploring genes and
genomes)

Lectura Sugerida