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Por lo antes planteado, se incluyeron en este estudio de
enterotoxicidad dos cepas de E. coli, de las cuales E. coli 72E
Acuafn 2001, fue positiva a la prueba. Este resultado coincide
con los obtenidos por Gianella [8] quien demostr la capacidad
de E. coli de producir toxinas termoestables (ST), dando pti-
mos resultados en la prueba del ratn lactante. Sin embargo,
de las cepas de E. coli aqu ensayadas, E. coli 77E Acuafn
2001 fue negativa a la prueba; esto concuerda con el estudio
realizado por Hassan y col. [10], en el cual cepas de E. coli
aisladas de la bacterioflora de peces, resultaron negativas en
el ensayo del ratn lactante. Esto permite inferir que la variabi-
lidad de los resultados obtenidos pudiera deberse a una dife-
rencia en los serotipos de las cepas aqu probadas.
Por otra parte, algunas cepas de V. cholerae producen
una enterotoxina termoestable muy parecida a la de E. coli, en
este estudio sobre la capacidad enterotoxignica de dos cepas
de V. cholerae resultaron positivas; esto difiere de los resulta-
dos obtenidos por Hassan y col. [10], en el que las cepas de Vi-
brio spp. empleadas, identificadas solo a nivel de gnero, arro-
jaron resultados negativos, lo que puede deberse a la diferencia
de especies entre las cepas estudiadas. Es preciso tomar en
cuenta que de ambas cepas, V. cholerae 31 Lago de Valencia
2003 enterotxica, result negativa a la produccin de enzimas
elastolticas; sin embargo, la ausencia de este factor de forma
aislada no permite clasificar a una cepa como no enteropatge-
na pues debe estar asociado al resto de stos [9].
Prueba de citotoxicidad
Para el ensayo de citotoxicidad sobre clulas Vero, se
tomaron las cepas que resultaron enterotxicas en ratones
lactantes, con el fin de evaluar la presencia de citotoxinas en
las mismas.
La atmsfera artificial de CO
2
creada dio ptimos resulta-
dos, permitiendo disminuir la posibilidad de contaminacin, con-
servando la humedad, facilitando la formacin de una monocapa
que fue confluente en tan slo 48 horas de incubacin a 37C.
La observacin final de este ensayo se realiz a las 72 ho-
ras de incubacin, ya que los cambios celulares se fueron pro-
fundizando para finalmente visualizarse el desprendimiento de la
monocapa, a excepcin del control negativo, el cual no present
cambios en su morfologa celular normal. En la TABLA III se de-
tallan los cambios morfolgicos observados a las 24 y 48 horas
de incubacin, una vez inoculadas las cepas bacterianas.
De las cepas ensayadas, el 100% resultaron txicas pro-
duciendo alteraciones intra y extracelulares, entre las cuales la
presencia de vacuolas, granulaciones citoplasmticas y redon-
deamiento celular fueron las ms resaltantes (FIGS. 2 y 3).
La citotoxicidad tambin juega un rol importante en la
patogenicidad de una cepa bacteriana [8], la misma viene
dada por la capacidad de sta de sintetizar distintas toxinas
que provocan alteraciones letales en las clulas del hospede-
ro, de acuerdo al grado de susceptibilidad de la misma a la ac-
cin de dicha toxina [19]. Estas alteraciones son evidenciadas
por el dao estructural y morfolgico que sufre la clula, indu-
ciendo en muchos casos la muerte de sta.
Considerando que son varios los factores de virulencia
implicados en la enteropatogenicidad de una bacteria, en este
estudio se evalu como un factor adicional, la produccin de
citotoxinas de las cepas enterotxicas.
451
_______________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XIX, N 5, 446 - 454, 2009
TABLA III
CAMBIOS MORFOLGICOS A LAS 24-48 HORAS DE INCUBACIN/ MORPHOLOGICAL CHANGES AT 24 - 48 HOURS OF INCUBATION
Cepas Caractersticas de la monocapa
A las 24 horas de incubacin A las 48 horas de incubacin
Control negativo Monocapa normal, refringente. Clulas escasas en
suspensin.
No hubo cambios en la morfologa celular.
Control positivo
E. coli K88+
Destruccin de monocapa. Presencia de cmulos
celulares. Clulas filamentosas aisladas. Grnulos
citoplasmticos abundantes.
No hay presencia de cmulos celulares. Clulas
filamentosas abundantes en suspensin.
E. coli 72E
Aquafn 2001
Destruccin de la monocapa. Presencia de cmulos
celulares y grnulos citoplasmticos abundantes.
Presencia de cmulos celulares. Clulas punti-
formes. Detritos celulares abundantes.
P. shigelloides 70
San Fernando 2003
Destruccin parcial de la monocapa. Clulas redon-
das aisladas. Presencia de grnulos citoplasmticos.
Acidificacin del medio. Vacuolas citoplasmticas.
Clulas redondeadas escasas. Clulas filamen-
tosas en suspensin abundantes. Presencia de
grnulos.
V. cholerae 31
Lago de Valencia 2000
Destruccin de la monocapa. Presencia de clulas
filamentosas con grnulos.
Cmulos celulares. Presencia de clulas fila-
mentosas en suspensin abundantes.
V. cholerae 149
Lago de Valencia 2000
Destruccin de la monocapa. Presencia de clulas
filamentosas aisladas con grnulos citoplasmticos.
Cmulos celulares. Presencia de clulas fila-
mentosas en suspensin abundantes
A .hydrophila 217
La Mucuy 2003
Destruccin parcial de la monocapa. Presencia de
cmulos celulares con grnulos citoplasmticos. C-
lulas redondeadas aisladas. Acidificacin del medio.
Clulas redondeadas en suspensin abundantes.
Presencia de clulas redondas y oscuras adheri-
das. Cmulos celulares. Detritos celulares.
La tcnica de inoculacin de la monocapa celular em-
pleada por Parreira y col. [20] y Zamora y col. [23] aplicada al
principio en este ensayo, no permiti determinar la concentra-
cin bacteriana del inculo, siendo el desarrollo muy abundan-
te, lo cual dificult la observacin de los cambios morfolgicos
celulares de forma gradual y provoc la muerte celular en muy
poco tiempo.
Es por ello que surgi la necesidad de realizar variacio-
nes en el modo de inoculacin de la monocapa, logrando ajus-
tar el inculo a una concentracin adecuada, lo que permiti la
produccin en forma gradual de los cambios degenerativos so-
bre las clulas, debido a la accin de las toxinas bacterianas,
as como tambin la reproductibilidad del experimento.
A pesar que la tcnica de Zamora y col. [23] aqu em-
pleada, contempla un tiempo mximo de incubacin de 96 ho-
ras para determinar la presencia de lesiones en las clulas, la
observacin final en este ensayo se realiz a las 72 horas,
tiempo en el cual los cambios morfolgicos se acentuaron a un
grado tal, que slo quedaban remanentes de la monocapa,
siendo adems la visibilidad bastante limitada, debido al abun-
dante crecimiento bacteriano en todos los casos. Parreira y
col. [20] emplearon un perodo de incubacin an menor, ob-
servando los cambios morfolgicos en las clulas Vero hasta
las 48 horas de incubacin.
La citotoxicidad de cepas de E. coli, aisladas de cerdi-
tos diarreicos, fue evaluada sobre clulas Vero por Zamora y
col. [23], demostrando la capacidad de las mismas de produ-
cir un efecto citotnico, caracterizado por el aumento de ta-
mao y engrosamiento de las clulas, las cuales se observa-
ron refrctiles y con prolongaciones filamentosas, y un efecto
citotxico en el que las clulas se redondean con notables
cambios destructivos.
Caractersticas similares fueron aqu observadas en las
clulas inoculadas con la cepa enterotoxignica E. coli 72E
Acuafn 2001, que indujo la formacin de granulaciones cito-
plasmticas y finalmente la destruccin de la monocapa celu-
lar, tratndose por ello de una cepa citotxica.
As mismo, Gonzlez-Rey [9] demostr el efecto citotxi-
co de P. shigelloides en varias lneas celulares, las cuales fue-
ron fuertemente afectadas por las toxinas liberadas por cepas
452
Enteropatogenicidad de bacterias cticas en Venezuela / Leal, Y. y col. ______________________________________________________
a
(R) (G)
(R) (G)
b
(F) (G)
c
FIGURA 2. A LAS 24 HORAS INCUBACIN. A. CONTROL NEGATIVO, B. CONTROL POSITIVO E. coli K-88+ PRESENCIA
DE CLULAS REDONDEADAS (R) CON GRNULOS CITOPLASMTICOS (G), C. V. cholerae 149 1 LV 2000 CLULAS
FILAMENTOSAS (F) CON GRNULOS CITOPLASMTICOS (G). (320X)/ AT 24 HORAS OF INCUBATION. A. NEGATIVE CONTROL,
B. POSITIVE CONTROL E. coli K-88+, ROUNDED CELLS PRESENT (R) WITH CYTOPLASMIC GRANULES (G), C. V. cholerae 149 1 LV 2000
FILAMENTOUS CELLS (F) WITH CYTOPLASMIC GRANULES (G). (320X).
(G)
(H) (V)
c
(R)
a b
FIGURA 3 A. A LAS 48 HORAS DE INCUBACIN. A. CONTROL NEGATIVO, B. E. coli 72E 1 ACUAFN 2002, PRESENCIA DE
CLULAS REDONDEADAS (R) CON GRNULOS CITOPLASMTICOS (G), C. P. shigelloides 48 1 ACUAFIN 2002 CLULAS
HIPERTROFIADAS (H) CON VACUOLAS (V) Y GRANULACIONES CITOPLASMTICAS (G). (320X)/ AT 48 HORAS OF
INCUBATION. A. NEGATIVE CONTROL, B. E. coli 72E 1 ACUAFN 2002, ROUNDED CELLS PRESENT (R) WITH CYTOPLASMIC GRANULES G),
C. P. shigelloides 48 1 ACUAFIN 2002 HYPERTHROFIED CELLS (H) WITH VACUOLS (V) AND CYTOPLASMIC GRANULATIONS (G). (320X).
de esta especie, provocando fuertes cambios en las monoca-
pas, desde variacin en la morfologa hasta la destruccin total
de las mismas. Este efecto fue observado en el ensayo de ci-
totoxicidad de la cepa P. shigelloides 70 San Fernando 2003,
donde la monocapa de clulas Vero experiment cambios de-
generativos importantes.
Las cepas ensayadas restantes: V. cholerae 31 Lago de
Valencia 2000, V. cholerae 149 Lago de Valencia 2000 y A.
hydrophila 217 La Mucuy 2003, mostraron un efecto citotnico,
caracterizado por el aumento de tamao, engrosamiento, re-
dondeamiento y prolongaciones citoplasmticas, as como, ci-
totxico, evidenciado por la presencia de granulaciones cito-
plasmticas y cambios degenerativos en las clulas, causando
en todos los casos la muerte de las mismas. Al igual que en
este estudio, Hassan y col. [9] demostraron la actividad citot-
xica de cepas de Aeromonas spp. y Vibrio spp. En clulas
HeLa, donde la produccin de citotoxinas fue de 61 y 100%,
respectivamente.
En el caso particular de los pozos inoculados con A.
hydrophila 217 La Mucuy 2003, se produjo la acidificacin del
medio, a lo cual no se atribuyen los cambios observados en
las clulas, ya que en el trabajo rutinario del cultivo celular,
donde se ha observado este fenmeno debido a una sobre-
poblacin de clulas, no se apreciaron cambios en la morfolo-
ga celular.
Los resultados obtenidos en la presente investigacin,
permiten presumir que, independientemente de la procedencia
geogrfica de las cepas bacterianas, el efecto citoptico de las
mismas es reproducible en distintas experiencias.
Anteriormente, la determinacin de citotoxinas se reali-
zaba empleando extractos de bacterias, en las cuales era ne-
cesario el uso de equipos especializados, as como el empleo
de antibiticos que permitieran una mayor permeabilidad de la
membrana celular de la bacteria, o por el contrario se deba li-
sar la cepa con ultrasonido y luego esterilizar el extracto por fil-
tracin [20]. Sin embargo, el mtodo de capa de agar sobre l-
neas celulares, permite evaluar el mismo efecto en un perodo
de tiempo ms corto, con una menor inversin econmica y
con la ventaja de ensayar un mayor nmero de cepas, dismi-
nuyendo la posibilidad de contaminacin [23].
CONCLUSIN
La enterotoxicidad y citotoxicidad de una cepa bacteria-
na constituyen factores importantes capaces de desencadenar
en el humano patologas gastrointestinales, permitiendo esta-
blecer una posible relacin entre el consumo de la carne de
pescado y la aparicin de brotes de enfermedad, provocados
por la inadecuada manipulacin y coccin de la misma al mo-
mento de ser consumida, representando as un riesgo para la
salud pblica.
AGRADECIMIENTO
Al FONACIT por el financiamiento econmico aportado a
travs de los Proyectos de Investigacin: a) Agenda Pesca y
Acuicultura No. 20020001218 del Ministerio del Poder Popular
para la Ciencia y la Tecnologa, y b) S1-2002000525 del INIA
adscrito al Ministerio del Poder Popular para la Agricultura y
Tierras.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] LVAREZ, J.; AGURTO, C. Estudios virolgicos y bacte-
riolgicos en Acuicultura. Trabajo presentado en el ciclo de
Seminarios CENIAP, Maracay, Venezuela. 5-7pp. 2003.
[2] LVAREZ, J.; AGURTO, C. Estudio epidemiolgico de pa-
rsitos y bacterias predominantes en peces de inters co-
mercial para Venezuela. Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias. Maracay, Venezuela; 2000.
En lnea: http://www.ceniap.gov.ve/digital/ congresos/jorna-
das/web/jalvarez.htm. 16/Abril 2004.
[3] LVAREZ, J.D.; AGURTO, C.; LVAREZ, A.M.; OBRE-
GN, J. Resistencia antimicrobiana en bacterias aisla-
das de tilapias, agua y sedimento en Venezuela. Rev
Cientf. FCV-LUZ. XIV (6):491-499 pp. 2004.
[4] AUSTIN, D.; AUSTIN, D. A. Methods for the microbiologi-
cal examination of fish and shellfish, Aeromonadaceae
representatives. Ellis Horwood Lim, Chichester, England:
John Wiley and Sons. 171-187 pp. 1993.
[5] AUSTIN, D.; LEE, J. Aeromonadaceae and Vibriona-
ceae. Identification Methods in Applied and Environ-
mental Microbiology. Technical Series of the Society
for Applied Bacteriology. 171-94 pp. 1992.
[6] BRANSON, D. Mtodos de bacteriologa clnica. Manual
de test y procedimientos. Buenos Aires Argentina: Edito-
rial S.A Mdica Panamericana, 256 pp. 1974.
[7] DEAN, A.; CHING, Y.; WILLIAMS, R.; HARDEN, L. Test
for Escherichia coli enterotoxin Using Infant Mice: Appli-
cation in a Study of Diarrhea in Children in Honolulu. J
infect Dis. 125(4): 407-411. 1972.
[8] GIANELLA, R. Suckling mouse model for detection of
heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics
of the model. Infect Immun. 14(1):95-9. 1976.
[9] GONZLEZ-REY, C. Studies on Plesiomonas shigelloi-
des isolated from different environments. Swedish Uni-
versity of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden. Doc-
toral thesis. 10-27 pp. 2003.
[10] HASSAN, M.; RAHMAN, K.; TZIPORI, S. Studies on the
bacterial flora of fish which are potential pathogens for
human. Virulence factors of potential human pathogen
isolated. Bangladesh Med Res Counc Bull. 20(3):86-
98. 1994.
453
_______________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XIX, N 5, 446 - 454, 2009
[11] HOSTACKA, A. Toxic factors of Aeromonas hydrophila
and Plesiomonas shigelloides. Zentralbl Bakteriol Mik-
robiol Hyg [A]. 252(4): 525 -34. 1982.
[12] HUAPAYA, B.; HUGUET., J.; SUREZ, V.; TORRES, Y.;
MONTOYA, Y.; SALAZAR, E.; SAKURAY, S.; TEJADA,
C.; GAMBIRAZIO, C.; GMEZ, J. Primer aislamiento de
Escherichia coli 0157:H7 Enterohemorrgica en el Per.
Rev. Md. Exp. 18:1-2. 2001.
[13] HANDFIELD, M.; SIMARD, P.; LETARTE, R. Differential
media for quantitative recovery of waterborne Aeromo-
nas hydrophila. Applied and Environm Microbiol
62(9):3544-3547. 1996.
[14] JOKLIK, W.; WILLET, H.; AMOS, D.; WILFERT, C.;
ZINSSER, N. Bacterias aerobias Gram negativas. Mi-
crobiologa. 20ma Ed, Buenos Aires: Panamericana.
1234-1236 pp.1998.
[15] KONEMAN, E.; ALLEN, S.; WILLIAM, J.; SHECKEN-
BERGER, P.; WINN, W. Color Atlas and Textbook of Di-
agnostic Microbiology. 5ta Ed, Philadelphia, Pennsylva-
nia: Lipincott. 678-680 pp. 1997.
[16] LEAL, Y.; REYES, M. Efecto citotxico y enterotxico de
bacterias de importancia para la salud ctica y pblica
aisladas de peces y del entorno acutico. Universidad de
Carabobo, Maracay, Venezuela, Trabajo de Investiga-
cin. 43-65 pp. 2004.
[17] MASSAD, G.; OLIVER, J.D. New selective and differen-
tial medium for Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus.
Appl Environ Microbiol. 53(9):2262-2264. 1987.
[18] MURRAY, P.; ROSENTHAL, K.; KOBAYASKI, G.;
PFFALLER, M. Escherichia coli. Microbiologa Mdi-
ca.4ta Ed. Madrid, Espaa: Elsevier. 2012-2016. 2003.
[19] THE PANAMERICAN HEALTH ORGANITATION
(PAHO). El sndrome urmico hemoltico (SUH) y la Es-
cherichia coli enterohemorrgica (ECEH). Washington
D.C E.U.A; 2002. En lnea: http:// www.paho.org/Spa-
nish/HCP/HCT/EER/paraguay-red-junio-2001-5.suh.pdf.
3 de diciembre 2003.
[20] PARREIRA, V.; WEIS, C.; YANO, T. An agar-overlay
method for detection of toxins produced by Escherichia
coli. FEMS Microbiol Lett 120: 303 -306. 1994.
[21] REINA, M. Tcnicas de cultivo celular. 2003. Universi-
dad de Barcelona, Espaa: En lnea: http://www.ub.es/
biocel/wbc/tecnicas/tecnicas-d-cultivo-celular.htm. 24 de
julio 2003.
[22] VON GRAEVENITZ, A.; BUSHER, C. Evaluation of differ-
ential and selective media for isolation of Aeromonas and
Plesiomonas spp. J. Clin. Microbiol. 17(1):16-21p. 1983.
[23] ZAMORA, J.; REINDHARDT, G.; POLETTE, M.; MA-
CIAS, P. Deteccin rpida en el diagnstico de Escheri-
chia coli toxignica productora de LT y VT. Archivo de
Medicina Veterinaria 2000. 32(1): 83-87. En lnea: http://
www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=so31-7
32x2000000100010&610&ing=es&nm=ison0301-732x.
23 de febrero 2003.
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Enteropatogenicidad de bacterias cticas en Venezuela / Leal, Y. y col. ______________________________________________________