Desarrollo de folculos capilares mediante cultivo

celular de tejidos en equivalentes drmicos

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Alejandra Rodrguez Sosa, Diego Carbonell Muoz
Universidad Autnoma de Madrid



































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ndice de contenidos


Tema general del anteproyecto p.3
Problema de investigacin p.3
Justificacin p.3
Objetivos p.4
Antecedentes del proyecto p.4
Plan de trabajo p.4-8
Anexos p.9-11
Bibliografa p.12
































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Tema general del anteproyecto
Ingeniera de tejidos; desarrollo de estructuras anejas en la sntesis de equivalentes drmicos
(cultivo de clulas in vitro mediante un andamiaje 3D fibroso para su posterior implantacin en
el cuerpo del individuo donde lleva a cabo una accin regenerativa).

Problema de investigacin
La piel es responsable de multitud de funciones significativas para la especie humana. No solo
constituye la primera barrera frente al medio externo, tambin se encarga de procesos sensitivos
y termorreguladores, nos protege de patgenos, controla la evaporacin y, en menor medida,
toma parte en el proceso respiratorio. Por estas razones si en algn momento nuestra piel
sufriera algn trauma o deterioro nos encontraramos en un serio peligro.

En esta tesitura se hallan los individuos aquejados de quemaduras graves que pueden haber
perdido, en mayor o menor magnitud, parte de su tegumento. Existe una clasificacin en grados
que la American BurnAssociationestim para valorar el dao causado sobre la piel: primer
grado (superficiales y autoregenerativas al mantener el estrato de Malpihgi) segundo grado
(destruyen la epidermis y parte de la dermis) tercer grado (que afectan la dermis y epidermis con
espesor total y requieren injertos) y cuarto grado (llegan hasta el hueso y se estima oportuna la
reseccin de rea).

Nosotros queremos abordar el problema derivado de la falta de estructuras anejas en los
trasplantes autlogos de piel cultivada in vitro, enfocado a quemados de tercer grado.

Actualmente los injertos se realizan con una piel sencilla, compuesta de dermis y epidermis pero
carente de estructuras anejas, limitada a sus funciones de barrera ms primitivas y por tanto el
objetivo general que queremos plantear es la mejora de la funcionalidad de los equivalentes
drmicos desarrollados existentes con el fin de aproximarlos lo mximo posible a la piel
original.

Aunque nuestra idea principal haya surgido para su uso en quemados, individuos aquejados de
enfermedades degenerativas cutneas (epidermilisis bullosa, ulceracin por stasis...) tambin
se beneficiaran de las ventajas de los nuevos equivalentes drmicos.

Justificacin
La falta de estructuras anejas en la piel artificial implantada en individuos que hayan padecido
una prdida importante de sta se enfrentan a problemas relacionados con el mal
funcionamiento de la capacidad de regulacin de la temperatura corporal, a la prdida de la
barrera antimicrobiana proporcionada por la combinacin de las glndulas sebceas y los
folculos pilosos y a problemas derivados de la mala eliminacin de elementos de desecho del
cuerpo.



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Objetivo General
Alcanzar el desarrollo de las estructuras anejas propias de la piel humana partiendo de los
actuales avances en prototipos de piel artificial, tomando como base el prototipo ICX-SKN,
creacin de la empresa financiadora (Intercytex) y bajo la direccin de la misma.

Objetivo Especfico
Desarrollo de folculos pilosos en equivalentes drmicos usando de base el prototipo ICX-SKN.

Antecedentes del proyecto
El folculo piloso tiene un origen mixto, formado por clulas derivadas de la epidermis y la
dermis. Durante la embriognesis, clulas epiteliales de la epidermis y clulas mesenquimales
de la dermis forman el folculo. Primero se forman las placodas foliculares gracias
principalmente a los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), a los BMP y a las molculas
seal Wnt
[12]
. La sealizacin de Sonic hedgehog (SHH) es esencial para el crecimiento interno
y morfognesis del folculo, ya que forma el agregado drmico, la futura papila
[10]
, que ser
rodeada por clulas mitticamente activas, la futura matriz germinal del pelo. Distintas seales
entre la papila y la matriz originan la diferenciacin de las seis capas concntricas formadas
cada una por un tipo de clulas distinto. El folculo maduro atraviesa fases de crecimiento
(anagnesis), regresin (catagnesis) y quiescencia (telognesis), completando as el ciclo.

La papila drmica es una poblacin permanente de fibroblastos que actan en el desarrollo de
folculos pilosos. La papila contiene factores importantes en el surgimiento de la anagnesis y
por tanto en la morfognesis capilar
[5]
.Se han realizado estudios interespecficos que revelan una
relacin clara entre la papila dentaria y el crecimiento capilar, habindose experimentado con
clulas de la papila dentaria de roedores y humanos. Se implantaron en folculos pilosos
inactivados quirrgicamente clulas de humanos adultos y ratas en estado juvenil y se demostr
que estimulan la regenracin de folculos y la formacin de novo de de fibras capilares. Esto
deja entrever una clara relacin de sealizacin molecular entre los folculos dentales y
capilares
[2]
. Otros estudios con modelos murinos revelan que clulas de la papila drmica
cultivadas al ser implantadas en piel heterotpica, estimulan la neognesis completa de folculos
pilosos
[8]
.


En avances en injertos de piel, se han realizado pruebas con productos como el ICX-SKN, un
sustituto de la piel formado por colgeno humano, clulas del fibroblasto drmicas (HDFs) y gel
de fibrina, que contribuye a la cicatrizacin de heridas
[9]
que ser nuestro punto de partida.

Plan de Trabajo
Tarea 1: Determinar la concentracin de factores de crecimiento necesaria para crear una
matriz extracelular que nos permita lograr la diferenciacin de las clulas de la capa basal en
germen del pelo (previo al folculo capilar) en el prototipo ICX-SKN.
Tiempo estimado de duracin: 8 meses + lo que se precisa tras las pruebas de ensayo y error.


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Es preciso estimar la proporcin exacta de protenas de sealizacin y factores de crecimiento
capaz de estimular la diferenciacin de las clulas de la capa basal del prototipo de piel en
germen capilar (y su posterior desarrollo en folculo capilar): FGF9; catenina; WNT10B;
LEF1; FGF/FGFR2-IIIB; TGFb2; MSX1,2; EDA/EDAR; NOGGIN; DELTA1/NOTCH1;
PDGF-A; SHH; ACTbA/FS; HGF/MET; SOX18; TGF/EGFR; ETS2; NOTCH1; BMP2,4;
WNT3; MOVO1; HOXC13; WHN

Actividad 1.1: Ensayo y error para obtener la concentracin.
Tiempo estimado de duracin: 6 meses
Resultados previstos: Concentracin correcta determinada.

Para estimar las concentraciones requeridas de FGFs para el correcto desarrollo del
folculo, nos vamos a basar en estudios morfomtricos de secciones de piel del lomo
de ratones, realizados en estudios de anlisis del ciclo capilar (ver bibliografa).
Preparar las muestras de tejido. Se selecciona un valor (arbitrario y nico) para
todas las muestras, entre 2 y 3cm
2
como medida econmica y de fcil manipulacin.
Se preparan por duplicado tantas cubetas como soluciones posibles hayamos
determinado y se introducen las muestras de tejido en cada una de ellas.
Incubar las muestras en una cmara estanca mantenindolas a temperatura corporal
constante (37).
En caso de ser negativo el resultado, volver al inicio, reestimar las concentraciones
y generar una nueva batera de soluciones con las que efectuar nuevamente las
pruebas segn el mtodo escrito.

Actividad 1.2: Ensayo y error para comprobar el tiempo de sumersin necesario del
prototipo en la matriz para la diferenciacin correcta del folculo.
Tiempo estimado de duracin: 2 meses
Resultados previstos: Tiempo necesario para la obtencin de efectos determinado.

Una vez obtenidas las soluciones, crear un grupo pequeo de muestras piloto para
comprobar cul es el tiempo necesario para que la solucin manifieste algn tipo de
efecto en las muestras
Anotar cambios en la evolucin de las muestras y realizar un seguimiento ms
detallado cuando nos encontremos cerca de la deadline para asegurar qu muestras
cumplen en mayor medida con las expectativas.
Analizar las muestras obtenidas mediante anlisis por microscopa ptica y
comprobar sus grados de desarrollo a diferentes tiempos a lo largo de todo el
experimento hasta que se observen modificaciones relevantes.
Si el resultado obtenido es positivo, proceder a la siguiente tarea.
Si no se produjeran los efectos esperados, valorar de nuevo los tiempos necesarios y
repetir el experimento con los nuevos datos estimados.


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Hito 1: Solucin final adecuada y tiempo necesario determinado correctamente.

Tarea 2: Realizacin de pruebas en modelos murinos y seguimiento de la cicatrizacin.
Tiempo estimado de duracin: 2 meses.

Con el fin de comprobar que el tratamiento con factores de crecimiento aplicado al prototipo de
dermis equivalente no altera las propiedades iniciales del producto, realizamos implantes en
ratones (Mus musculus) y con un seguimiento de entre veintiocho y treinta das (tiempo
estimado para la regeneracin tisular en el prototipo ICX-SKN original) para comprobar:

Que la capacidad de regeneracin de la herida en el tejido daado no ha sido
alterada por nuestra modificacin.
Que la modificacin aplicada en el prototipo de piel artificial no presenta ningn
problema y se han desarrollado correctamente los folculos pilosos.

Actividad 2.1: Obtencin de muestra histolgica de piel implantada + piel original para
su posterior observacin al microscopio.
Resultados previstos: La piel artificial presenta diferencias con la piel original en
cuanto a falta de todo tipo de estructuras anejas salvo los folculos pilosos y la
regeneracin ha sido correcta.

Las muestras tomadas se fijan, deshidratan e incluyen en parafina para su posterior
tincin con hematoxilina y eosina con el fin de observar al microscopio ptico y
determinar si la insercin de folculos ha tenido xito.

Hito 2: No se producen rechazos en los implantes y se observan folculos pilosos en la
observacin de la muestra histolgica al microscopio ptico.

Tarea 3: Realizacin de pruebas en voluntarios y seguimiento de la cicatrizacin.
Tiempo estimado de duracin: 4 meses.

Nos basamos en el mtodo llevado a cabo por Intercytex para la realizacin de sus test del ICX-
SKN sobre voluntarios a los que se les efectuaba un pequeo corte de unos 2 cm
2
en la parte del
antebrazo, provocando una herida que afectaba tanto a dermis como a epidermis a nivel
relativamente superficial y sobre la que se aplicaba un fragmento de piel sinttica. El
procedimiento a seguir en nuestro caso se fundamentara en las mismas bases. Resultados
satisfactorios esperados a partir del vigsimo octavo da.

Actividad 3.1: Implantar la piel artificial en la herida.
Resultados previstos: El implante no presenta rechazos.


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Comprobar durante los primeros das que el organismo receptor no sufre ningn
rechazo. En caso de que lo hubiera, retirar el implante y curar la herida mediante
procedimientos tradicionales estndar.

Actividad 3.2: Seguimiento exhaustivo durante la primera semana.
Resultados previstos: Se produce cicatrizacin correcta.

Realizar seguimiento exhaustivo del implante por parte de los cientficos
encargados de la prueba por lo menos durante la primera semana para comprobar si
ha habido alteraciones en la piel adyacente o en el organismo receptor.

Hito 3: Pruebas dan resultados satisfactorios, no hay rechazo, el tiempo de aceptacin es el
estimado y no se produce alteracin.

Tarea 4: Anlisis de resultados y comprobacin del efecto final. Retroalimentacin de
procesos.
Tiempo estimado de duracin: Si todo sale segn las expectativas 30 das (1 mes).

Tras la homogeneizacin del implante con la piel, seccionar una mnima parte del rea de piel
implantada junto con parte de la piel original y observar al microscopio ptico. Deberan
observarse folculos pilosos en la artificial.

Actividad 4.1: Tomar una muestra de piel e implante del modelo murino para su
anlisis al microscopio.
Resultados previstos: Diferencias habituales y existencia de folculos pilosos
desarrollados.

En el caso de presentar anomalas, sera preciso retroceder hasta la Tarea 1 y reestimar las
concentraciones adecuadas.

Hito 4: La respuesta a la exposicin de la piel a factores de crecimiento y su posterior implante
en los sujetos de pruebas ha sido satisfactoria y se han desarrollado los folculos pilosos.

Plan de divulgacin
Canales de difusin a emplear
Conferencias
En hospitales y empresas de biomedicina y
biotecnologa principalmente.
Pginas web
Aadiremos nuestra investigacin a la pgina
web de la empresa.
Folletos informativos En universidades, centros de investigacin
Publicaciones En revistas de inters cientfico.




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Presupuesto
El proyecto sera sufragado por la empresa privada Intercytex, que a cambio se vera
beneficiada econmicamente por medio del uso exclusivo del producto generado.

Costes directos (coste en euros)
Personal
Personal sanitario especializado 20,00/h
Personal veterinario especializado 20,00/h
Inventariable
Microscopio ptico 149,99
Estufa hermtica de T regulable 490,00
Fungible
Prototipo ICX-SKN proporcionado por la empresa
Factores de transcripcin (material
biolgico)
24000,00
Modelos murinos (x5) 10
Anestesia local (soluciones
inyectables de lidocana, va
subcutnea LidocaineViscous
20mg/mL
(genericequivalenttoXylocaine)
18USD 13,30
Jeringas 10,00
Agujas intradrmicas (x10) 40,00
CO
2
(eutanasia) 10,00
Cubetas, bistur, portaobjetos 100,00
Servicios Publicaciones en revistas temticas 2000,00
Otros
Pago de voluntarios en concepto de
manipulacin y traslado
150,00/persona

Costes indirectos (coste en euros)
Laboratorio Mantenimiento (24 meses) 2700,00

Costes totales: 26.730 (personal) + 640 (inventariable) + 24183.3 (fungible) + 2000
(publicaciones) + 1500 (otros) + 2700 (laboratorio) = 57753.3

Legislacin
Justificamos el uso de animales segn lo estipulado en el Real Decreto 53/2013 de 1 de
febrero por el que se establecen las normas bsicas aplicables para la proteccin de los
animales utilizados en experimentacin y otros fines cientficos, incluyendo la docencia.
Disposicin 1337.
Participacin de voluntarios humanos mediante consentimiento informado segn el Convenio
de Oviedo (4 abril 1997), Convenio relativo a los derechos humanos y a la biomedicina, en
concreto el Captulo II (Consentimiento), Artculo 5 referente al consentimiento informado
de los voluntarios.
Empleo de clulas propias del paciente para realizar el cultivo con la base de piel artificial
ajustado a lo que se enuncia en el Convenio de Oviedo (4 abril 997), Convenio relativo a los
derechos humanos y a la biomedicina, Captulo II (Consentimiento), Artculo 5 referente
al consentimiento informado del paciente y asimismo al Artculo 6, en el caso de que el
paciente no pudiera o estuviera incapacitado de dar su consentimiento.

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Anexos


Diagrama de flujo




Cronograma





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Fecha: / /

Consentimiento informado

Yo, de ___ aos de edad, con domicilio en

y DNI n .

En calidad de colaborador y por voluntad propia, en cumplimiento de las siguientes leyes:

Ley 41/2002, 14 de noviembre, bsica reguladora de la autonoma del paciente y de
derechos y obligaciones en materia de informacin y documentacin clnica (B.O.E. n
274, 15 de diciembre de 2002).
Ley Orgnica 15/1999, 13 de diciembre de proteccin de datos de carcter personal
(B.O.O n298, 14 diciembre de 1999).
Ley 14/2007, 3 de julio, de investigacin biomdica (B.O.E. n 159, 4 de julio de 2007).
Real Decreto 53/2013, 1 de febrero por el que se establecen los requisitos bsicos de
autorizacin y funcionamiento de los biobancos con fines de investigacin biomdica y
del tratamiento de muestras biolgicas de origen humano, y se regula el funcionamiento
y organizacin del Registro Nacional de Biobancos para investigacin biomdica
(B.O.E. n290, 2 de diciembre de 2011, pag. 128434-128454).


Habiendo sido informado/a sobre los riesgos y beneficios que supone la presente investigacin,
declaro mi conformidad y doy mi consentimiento para que se me apliquen los mtodos descritos
en el anexo adjunto y que se me han explicado con claridad, siempre y cuando la finalidad de su
accin se viese inalterada y dejando constancia de que soy libre en cualquier momento del
experimento de renunciar y abandonar el mismo tanto por motivos de incumplimiento de las
condiciones aqu presentadas como por motivos propios que no necesitar justificar bajo ningn
concepto.

Firma del voluntario Firma del responsable de investigacin




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Anexo al Consentimiento Informado

Objetivo de la prueba

Realizar un pequeo implante del prototipo de piel artificial ICX-SKN modificado para que se
produzca un desarrollo normal de folculos pilosos (vello) en el voluntario y comprobar que las
capacidades regenerativas del prototipo no se ven afectadas por la manipulacin efectuada.

(Aviso: Pruebas anteriormente realizadas con resultados satisfactorios en modelos murinos
(ratones)).

Mtodos y procedimiento
Un profesional mdico seccionar una pequea parte de la piel del brazo del voluntario
(no ms de 2 cm
2
).
Mediante ciruga se implantar un fragmento de equivalente drmico ICX-SKN
modificado en la zona seccionada.
Durante la primera semana, se proceder a la inspeccin y vigilancia de la zona
seccionada, para asegurar la no existencia de rechazo frente al implante.
Se realizar, tras esta primera semana de vigilancia, una nueva visita para comprobar la
reaccin de la piel artificial a finales de la segunda semana.
La visita final tendr lugar el da 28 tras la operacin, donde se determinar si el efecto
regenerativo del prototipo ha tenido lugar correctamente.

Riesgos
Pueden existir rechazos al injerto. En este caso, se procedera a la retirada del implante y a la
cura de la herida producida mediante procedimientos mdicos.
Puede ser que la regeneracin prevista no tenga lugar en algunos voluntarios. En este caso se
dejara el implante pero se efectuara una compensacin econmica de 50 al afectado.
Puede producirse infeccin del rea seccionada tras la ciruga. En este caso se verificara si el
voluntario ha seguido las instrucciones del mdico que haya operado. Si las ha seguido
correctamente y el problema es derivado del implante, se efectuara una compensacin
econmica asimismo de 50.


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Bibliografa
[1]Cells or signals: which moves to drive skin pattern formation? (Denis Headon)
Commentary from the Editorial Board. 19-Oct-2013

[2]Cultured human and rat tooth papilla cells induce hair follicle regeneration and fiber
growth. (Reynolds AJ, Jahoda CA) Differentiation. 2004 Dec; 72(9-10):566-75.

[3]Cytokines and growth factors influence hair growth in vitro. Possible implications for
the pathogenesis and treatment of alopecia areata. (Rolf Hoffman et al) Archives of
Dermatological Research. 1996 Mar; Volume 288, Issue 3, pp 153-156

[4]Dendritic epidermal T cells regulate skin homeostasis through local production of
insulin-like growth factor 1. (Leslie L. Sharp et al) Nature Immunology. 2004 Dec; Volume 6,
pp 73-79

[5]Dermal-epidermal interactions (Oliver RF, Jahoda CA 1988) ClinDermatol. 1988 Oct-Dec;
6(4):74-82.


[6]Differentiation of human T cells towards distinct memory phenotypes. (Matthias
Eberl et al) Cellular Immunology. 2002 Jul-Aug; Volume 218, issues 1-2; pp 1-6

[7]Fgf9 from dermal gd T cells induces hair follicle neogenesis after wounding. (Denise
Gay et al) Nature Medicine. 2013 Jun; Volume 19, pp 916-923

[8]Hair matrix germinative epidermal cells confer follicle-inducing capabilities on dermal
sheath and high passage papilla cells. (Reynolds AJ, Jahoda CA).Development 122, 3085-
3094 (1996)

[9]Integration and persistence of an investigational human living skin equivalent (ICX-
SKN) in human surgical wounds. (Boyd M et al) Regen Med. 2007 Jul; 2(4):363-70.

[10]Sonic hedgehog signaling is essential for hair development. (St-Jacques B et al)Curr
Biol. 1998 Sep 24; 8(19):1058-68.

[11]Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding.
(Mayumi Ito et al) Nature Medicine. 2007 May; Volume 17, pp 316-320

[12]WNT Signaling in the Control of Hair Growth and Structure (Sarah E. Millar et al)
Developmental BiologyVolume 207, Issue 1, 1 March 1999, Pages 133149