Un tamao relativamente pequeo (3-5 kb) para poder acomodarfragmentos mas grandes

* Varios sitios de restriccin diferentes para la clonacin de una amplia variedad de fragmentos
* Mltiples marcadores seleccionables para facilitar la seleccin de bacterias con molculas de
DNA recombinante
* Elevada velocidad de replicacin
* La mayora de los vectores habitualmente utilizados contiene una secuencia de DNA insertado
denominada conector mltiple, banco de sitios de restriccin o mltiples sitios de clonacin, que
es una regin de DNA consistente en un grupo de numerosos sitios de restriccin nicos en el
plsmido.



El origen de replicacin es nico en procariticos y casi todos los virus. Se propuso la existencia de
una secuencia que llamaron replicador (nosotros origen de replicacin), que va a ser reconocida por
una protena; esta protena hace tres cosas:

Reconoce especficamente la secuencia.
Abre el DNA.
Recluta las protenas que constituyen la maquinaria de replicacin.
Un origen de replicacin es el lugar del cromosoma donde se inicia la replicacin de la cadena de
ADN. Se trata, por lo tanto, de una determinada secuencia de nucletidos a partir de la cual se
desarrolla una horquilla de replicacin que dar lugar a las dos cadenas idnticas de ADN
resultantes.
En los organismos procariotas suele encontrarse un nico origen de replicacin en su ADN, mientras
que en los eucariotas se encuentran normalmente mltiples orgenes en cada cromosoma, lo que
permite una velocidad razonable de replicacin de las largas cadenas de ADN de estos organismos.
Esta multiplicidad de orgenes en una cadena conforma las denominadas burbujas de replicacin.

Gen marcador: Gen del que se conoce su funcin o emplazamiento y que se utiliza para aplicar la
seleccin asistida por marcador y otros estudios genticos.
por ejemplo un gen que le proporcione una caracterstica como resistencia a drogas, o antibiticos,
sntesis de aminocidos, entre otros) en bacterias o levaduras, para identificar las clulas que
incorporaron el gen con la nueva caracterstica (clula husped).
Un marcador gentico o marcador molecular es un segmento de ADN con una ubicacin fsica
identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o
puede ser alguna seccin del ADN sin funcin conocida. Dado que los segmentos del ADN que se
encuentran contiguos en un cromosoma tienden a heredarse juntos, los marcadores se utilizan a
menudo como formas indirectas de rastrear el patrn hereditario de un gen que todava no ha sido
identificado, pero cuya ubicacin aproximada se conoce. Los marcadores se usan para el mapeo
gentico como el primer paso para encontrar la posicin e identidad de un gen.

En el fago lambda, se puede introducir un fragmento de ADN eucaritico de 15 a 20 kb. Sinembargo
hay gens con tallas superiores a 20 kb. La familia des gens de globina estn alrededor de 70 kb y
otras familias ms grADNes pueden ocupar cientos de kb. Es para eso que se utilizan los csmidos.
SITIOS COHESIVOS: secuencias cortas terminales ubicadas en los extremos del cromosoma del
fago landa, que participan en el empaquetamiento Las secuencias cos son las nicas seales
necesarias para la encapsulacin de ADN en la cabeza de los fagos.

Fagmido
(Redirigido desde Fagemido)
Un fagmido o fagmido es un tipo de Vector de clonacin empleado en biotecnologa, compuesto
por un plsmido al que se le ha incorporado el origen de replicacin de un fago filamentoso (fagos de
cido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario), tales como el fago M13 o F1. De este modo
mantiene todas las utilidades de los plsmidos pero adems tiene la capacidad de producir ADN
monocatenario.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES: surgieron en 1987 con el objetivo de clonar fragmentos muy
grandes

En el contexto de la gentica bacteriana la conjugacin es un proceso de transferencia gentica
(intercambio de material gentico entre bacterias) que requiere contacto directo entre una bacteria
y otra. En este proceso hay una bacteria donadora y otra receptora. En el ejemplo clsico y mejor
conocido de este proceso (en Escherichia coli), la estirpe donadora posee un elemento gentico
llamado F, que puede existir en forma de plsmido (elemento circular con capacidad de replicacin
autnoma) o en forma integrada en el cromosoma (en este caso se replica como parte del propio
cromosoma).
.
La receptora no debe poseer el elemento F (por eso se denomina F-). El elemento o factor F es el que
codifica las funciones necesarias para la conjugacin y, de hecho, es l mismo el que se transfiere, a
travs de un puente de conjugacin, hacia la bacteria receptora. Cuando la bacteria donadora tiene
F en forma de plsmido se llama F+. En este caso slo se transfiere el plsmido hacia la receptora (la
cual acaba pasando a ser F+, lgicamente). La transferencia ocurre a partir de un punto concreto de
F, llamado origen de transferencia; ah ocurre un corte endonucleoltico en una sola cadena y
comienza la transferencia de esa cadena hasta que el plsmido pasa entero y se convierte en doble
cadena (con ayuda de la polimerasa de ADN).

Se define la transfeccin como la infeccin de una clula hospedadora mediante ADN obtenido de
un virus. El ADN del virus as introducido, al expresar su programa gentico en la clula, termina
desencadenando la produccin de nuevas partculas de virus dentro, que al igual que en la infeccin
clsica por virus completos, conduce a la muerte y lisis de la clula, con la liberacin de la progenie
de nuevos viriones. Las caractersticas de unin de ADN y entrada dependern del sistema de clulas
competentes que se est empleando, mientras que el resultado de la transfeccin depende (al igual
que en los ciclos lticos naturales de los virus) del programa del virus en cuestin.

4.4 TRANSFORMACIN ARTIFICIAL

Muchas especies bacterianas carecen de sistemas naturales de transformacin. En los ltimos
aos se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir clulas competentes en algunas
de ellas (como Escherichia coli, Salmonella typhimurium y algunas especies de Pseudomonas), lo
cual ha hecho avanzar los estudios genticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por
ejemplo, la transformacin artificial de E. coli con ADN plasmdico es una de los mtodos bsicos de
la Ingeniera Gentica.

La obtencin de clulas competentes en E. coli consiste en ir concentrando un cultivo
recogido en fase logartmica, mediante lavados sucesivos en una solucin fra (4C) de Cl2Ca, tras lo
cual la mezcla de clulas y ADN se someten a unos 2 min. a 42C (choque por calor). Este
tratamiento altera las envueltas (sobre todo la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al
ADN. Los plsmidos entran a la clula como molculas de cadena doble intactas, mientras que los
ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplsmicas (RecBCD).
Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algn o algunos antibiticos
conferidos por los plsmidos artificiales usados en Ingeniera Gentica.

En otras bacterias (p. ej., en ciertas Gram-positivas) el mtodo consiste en obtener
protoplastos en medio hipertnico, y posterior tratamiento de stos mezclados con el ADN con un
agente como el polietilnglicol, que fomenta la fusin de protoplastos y el englobamiento de ADN
exgeno.

Ms recientemente se ha introducido la tcnica de la electroporacin: las clulas se someten
a cortos pulsos de corriente elctrica de alto voltaje, lo cual altera las envueltas y permite la
captacin de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-negativas.


La transfeccin consiste en la introduccin de material gentico externo en clulas
eucariotas mediante plsmidos, vectores vricos (en este caso tambin se habla de
transduccin) u otras herramientas para la transferencia. El trmino transfeccin para
mtodos no viralesse usa en referencia a clulas de mamfero, mientras que el trmino
transformacin se prefiere para describir las transferencias no virales de material
gentico en bacterias y clulas eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La transfeccin de clulas animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o
"agujeros" transitorios en la membrana plasmtica de las clulas mediante
electroporacin, para permitir el paso del material gentico (como construcciones de
DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso protenas
(como anticuerpos, por ejemplo). Adems de la electroporacin, se pueden utilizar otras
tcnicas para efectuar la transfeccin, como por ejemplo liposomas producidos
mediante la mezcla de lpidos catinicos con el material gentico, que se fusionarn con
la membrana plasmtica celular y depositarn su carga adentro.
El significado original de "transfeccin" era "infeccin por transformacin", es decir,
introduccin de DNA o RNA desde un virus procaritico bacterifago en las clulas,
resultando en una infeccin. Al tener el trmino transformacin otro sentido en biologa
celularanimal (un cambio gentico que permite la propagacin durante largos periodos
de clulas en cultivo, o la adquisicin de propiedades tpicas de las clulas cancergenas),
el trmino transfeccin adquiri, para clulas animales, su actual signifiado de cambio
en las propiedades celulares por la introduccin de material gentico.

Tcnicas de transfeccin

Las tcnicas de transfeccin son la imagen de las tcnicas de transformacin en
procariotas, se basan en la insercin de material exgeno en el genoma de ese
organismo.
Podemos considerar dos grandes grupos de tcnicas de transfeccin, los llamados
mtodos fsicos (se basan en el uso de sistemas mecnicos, no biolgicos, para lograr la
insercin de material gentico en las clulas) y los mtodos qumicos.
Las diferencias entre mtodos qumicos y fsicos se encuentran a nivel metodolgico, no
a nivel de resultados, ya que el conjunto de mtodos fsicos no se basa en ningn sistema
biolgico, sino que pretende una insercin a la fuerza, de ese material gentico.
Tambin hay que decir que este conjunto de tcnicas slo es funcional in vitro, ya que es
necesaria la exposicin de las clulas a medios extremos

Mecanismos de transferencia artificial:

Las tcnicas de transfeccin actuales se pueden clasificar en:

MTODOS FSICOS.

Basados en la introduccin mecnica de las molculas en el interior de la clula.

MICROINYECCIN DIRECTA.

Es una tcnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el mtodo que se emplea en la
introduccin del DNA recombinante en las clulas embrionarias en el proceso de
obtencin de animales transgnicos. Las microagujas miden alrededor de 10
micrmetros. Pueden contener cerca de 15 microlitros de ADN.

ELECTROPORACIN.

'biolistic particle delivery'. Introduccin del DNA adherido a micropartculas que se
disparan sobre las clulas.
Una vez introducida la molcula de DNA recombinante en el interior de las clulas
producir su efecto permitiendo, por ejemplo :
Seleccionar clulas que hayan incorporado el DNA. Este sera el caso del
aislamiento de clones celulares que presentaran expresin de un determinado
producto. Es posible por la incorporacin en el propio vector de marcadores de
seleccin, tpicamente la resistencia de G418 (neomicina), ...
A las pocas horas o das detectar la presencia de la protena codificada por el
plsmido.

MTODOS QUMICOS.

Basados en la formacin de complejos que las clulas sean capaces de adquirir e
incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endoctica (fosfato clcico, DEAE
dextrano) o a las membranas (lipofeccin).

MTODO DEL FOSFATO CLCICO.

Basado en la obtencin de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una
solucin salina de fosfatos. Uno de los mtodos ms baratos (y fiables) es la
transfeccin mediante fosfato de calcio, originalmente descubierta por F. L. Graham
y A. J. van der Eb en 1973.1 2 Una solucin salina tamponada con HEPES y que
contiene iones fosfato se combina con una solucin de cloruro de calcio que
contiene el DNA a transfectar. Cuando ambas se combinan, se forma un precipitado
fino formado por el calcio cargado positivamente y el fosfato cargado
negativamente, que el DNA en su superficie. Esta suspensin se aade a las clulas
que se quieren transfectar (normalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante
un proceso no comprendido completamente , las clulas toman parte del
precipitado, y junto con l, el DNA.

MTODO DEL DEAE DEXTRANO.

Basado en la obtencin de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polmeros
de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy
negativamente cargadas molculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en
las clulas mediante choque osmtico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE
dextrano se limita a las transfecciones transientes.

Mtodo DNA desnudo. El DNA desnudo (tcnica en fase altamente experiemtal) es
incapaz de entrar en una clula y an consiguiendo entrar en ellas es rpidamente
degradado. La lnea de investigacin busca incorporar esas secuencias de DNA a un
transportador, que le encierra y le lleva hasta la clula Diana en dnde a travs de
interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura
polar tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmtica. Adems el DNA
codificante para 1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud
aproximada de una clula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de
compactatcin.


Mtodo Pptidos fusiognicos Los pptidos fusiognicos surgen en una linea
de trabajo que nos permita paliar aquellas caractersticas del DNA desnudo que nos
impiden la entrada.
Estos pptidos fusiognicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan
DNA con protenas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una
condensacin considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de
partculas de 50-150 nanometros, pero slo un cierto grado de condensacin permite
que 1 transportador incluya 1 molcula de DNA. Asimismo la reduccin de tamao del
DNA hasta unos 20 nanometros facilitara el paso a la clula y hasta el ncleo,
incrementando su proteccin contra las nucleases citoplasmticas. En el proceso de
penetracin celular, los transportadores sintticos (si su carga neta es +) interactuan
con Aminoazucares de la Membrana plasmticacon (carga -) para producir la
incorporacin a la clula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema ms
a superar.
Tambin se ha visto que los puntos en dnde se da una mayor transferencia son los
pulmones y el hgado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en
grandes complejos y que interactuan con protenas de la sangre, con lo que no
abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros
naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hgado, en dnde interactuan.
Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en
primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo
punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las
clulas diana.
Una solucin propuesta a este ltimo problema es unirlos a ligandos especficos, tales
como azcares, aminoacidos, hormonas,.... Una vez en el tejido adecuado, el proceso
de absorcin se da por endocitosis formandose un endosoma (en este punto el
transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirn ataques
lisosomales que digerirn el conjunto). Para conseguir una salida se acopla al vector un
pptido fusiogena (p.ej. una molcula DOPE, que permite la salida del endosoma por
desestabilitzacin de les Mbs).
Des del citoplasma, ahora se tiene que dar la entrada al ncleo, este proceso queda
detenido por la envoltura nuclear, con la que el vector slo puede entrar al ncleo en
divisin, cuando se desorganiza la envoltura nuclear. La envoltura slo deja pasar por
difusin molculas inferiores a los 9 nanmetros, aunque mediante los transportadores
de reconocimiento de la Seal de localizacin nuclear, podrian entrar molculas de
entre 9-25 nm (los transportadores sintticos actuales miden ms de 25 nm). Lo que
nos implica otra nueva dificultad.


MTODO DE LIPOFECCIN.

Se basa en la foamcin de complejos entre lpidos catinicos y DNA. El complejo
tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Una de
las posibles vas es la incorporacin de liposomas a la membrana y la entrada flip-
flap. Existen un gran nmero de lpidos que se emplean en lipofeccin, aunque
existe una estructura consenso de un lpido catinico sinttico, a partir de la cual se
han diseado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las
condiciones especficas de transfeccin para obtener buenas eficiencias, que suelen
ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las clulas de la placa. Las
desventajas del mtodo es, aparte del elevado precio de los lpidos, el hecho de que
no todos los lpidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar
el ensayo para cada tipo celular. Los parmetros a optimizar son la relacin entre
lpido y DNA (relacin de cargas), la cantidad de DNA empleado, el tiempo que se
exponen las clulas al complejo y la presencia o ausencia de suero. Tienes una
buena revisin en la pgina de la Universidad Vanderbilt dedicada a los lpidos
catinicos.