QUIMOTRIPSINA Y EL PROTEOSOMA EN LA REGULACION DE LA FISIOLOGIA ESPERMATICA Y SU PARTICIPACION EN LA FECUNDACION EN MAMIFEROS Programa: Fondecyt Regular La fecundacin en mamferos es un proceso complejo, que comprende la interaccin secuencial del espermatozoide con el cmulo oforo, la zona pelcida (ZP) y la membrana plasmtica del ovocito. La participacin en este proceso de proteasas con actividad tipo tripsina y quimotripsina ha sido descrita en espermatozoides de invertebrados marinos y mamferos. Especficamente, estas proteasas estaran involucradas en la unin del espermatozoide al ovocito, la reaccin acrosomal (RA) y la penetracin a travs de las cubiertas ovocitarias. En mamferos, una de las proteasas acrosomales mejor estudiadas presenta actividad tipo tripsina y ha sido denominada acrosina. La importancia de esta proteasa en la fecundacin ha sido, sin embargo, puesta en duda ya que animales transgnicos cuyos espermatozoides carecen de acrosina son tan frtiles como los controles. Recientemente, fue descrito en espermatozoides humanos y de ratn un complejo protesico multienzimtico o proteosoma, con un coeficiente de sedimentacin similar al de proteosomas purificados de otros tejidos humanos y actividad enzimtica tipo tripsina, tipo quimotripsina y peptidilglutamil peptidasa. Los proteosomas son el principal complejo proteoltico citoslico de las clulas eucariotas y corresponden hasta el 1% de las protenas citoplasmticas. Este complejo enzimtico est constituido por un cuerpo proteoltico llamado proteosoma 20S (aprox. 700 kDa), el que puede asociarse a protenas reguladoras, ATPasas y activadores, constituyendo el proteosoma 26S (aprox. 2.000 kDa). El sitio activo del proteosoma contiene una Thr, sugiriendo que podra tratarse de un nuevo tipo de proteasa. Lactacistina, un inhibidor potente y muy especfico de proteosomas, se une covalentemente a la Thr y lo inhibe de manera irreversible. La principal funcin del proteosoma es la de degradar la mayor parte de las protenas nucleares y citoslicas, despus de que stas son marcadas para su destruccin por unin covalente a molculas de ubiquitina. Adems, el sistema ubiquitina-proteosoma podra constituir un sistema regulador para varias reacciones biolgicas. Por ejemplo, el proteosoma puede activar el factor de transcripcin NF-B, a travs de la conversin del precursor p105 a la protena madura p50. Otros estudios han demostrado que varios receptores de superficie que sealan a travs de la activacin de protena tirosina quinasa, se ubiquitinan y se degradan en respuesta a la unin con el ligando o a la fosforilacin. Sin embargo, el proteosoma tambin puede degradar protenas no ubiquitinadas. Finalmente, la estructura, composicin y localizacin intracelular del proteosoma puede variar CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 1 en relacin a su funcin. As, existen diferencias en la actividad y estructura de proteosomas aislados de diferentes rganos y ocurren cambios en la distribucin intracelular de los proteosomas durante la progresin del ciclo celular. Estos cambios podran servir para controlar la velocidad de protelisis en regiones especficas dentro de la clula. La funcin biolgica de los proteosomas ha sido estudiada en espermatozoides de invertebrados marinos. En estos organismos, el proteosoma espermtico est involucrado en mltiples etapas del proceso de fecundacin, tal como la RA inducida por la gelatina del ovocito, la unin y digestin/penetracin de la membrana vitelina y la fusin con la membrana plasmtica del ovocito. La funcin biolgica de los proteosomas en los espermatozoides de mamferos, sin embargo, constituye un rea aun inexplorada. De lo anteriormente sealado y del anlisis de la literatura es claro que la informacin existente sobre la funcin biolgica de las proteasas acrosomales tipo quimotripsina y el proteosoma en los espermatozoides de mamferos es muy limitada. La proposicin de este proyecto consiste en investigar la funcin biolgica de estas actividades protesicas en espermatozoides de mamferos, con particular nfasis en la especie humana. Por analoga de lo que se conoce en otras clulas eucariotas y en espermatozoides de invertebrados marinos, nuestra hiptesis de trabajo plantea que la actividad protesica tipo quimotripsina sera parte del complejo multienzimtico denominado proteosoma. El proteosoma, a su vez, estara involucrado en la regulacin de la fisiologa espermtica y en una o mas etapas claves e irreversibles del proceso de fecundacin. Especficamente, el proteosoma podra estar involucrado en la RA; la unin y penetracin a travs de la ZP; y en la fusin con la membrana plasmtica del ovocito. Sin lugar a dudas esta es una hiptesis atractiva que abre una nueva rea de investigacin en el estudio de la fisiologa espermtica y su regulacin. Por lo tanto, en este proyecto proponemos especficamente: 1) estudiar la participacin de las proteasas tipo quimotripsina y el proteosoma en los diferentes eventos que caracterizan la fisiologa espermtica y la fecundacin; 2) caracterizar bioqumicamente las proteasas tipo quimotripsina y/o el proteosoma en espermatozoides de mamferos; y 3) determinar cambios en la localizacin intracelular de la actividad tipo quimotripsina y/o el proteosoma durante la capacitacin espermtica. Antecedentes # Nombre : FUNCION DE LAS PROTEASAS TIPO QUIMOTRIPSINA Y EL PROTEOSOMA EN LA REGULACION DE LA FISIOLOGIA ESPERMATICA Y SU PARTICIPACION EN LA FECUNDACION EN MAMIFEROS # Nmero : 1011051 # Ao Concurso : 2001 # Concurso : FONDECYT-REGULAR # Consejo : CIENCIA # Duracin : 3 aos # Estado : APROBADO CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 2 # Sector de Aplicacin : La fecundacin en mamferos es un proceso complejo, que comprende la interaccin secuencial del espermatozoide con el cmulo oforo, la zona pelcida (ZP) y la membrana plasmtica del ovocito. La participacin en este proceso de proteasas con actividad tipo tripsina y quimotripsina ha sido descrita en espermatozoides de invertebrados marinos y mamferos. Especficamente, estas proteasas estaran involucradas en la unin del espermatozoide al ovocito, la reaccin acrosomal (RA) y la penetracin a travs de las cubiertas ovocitarias. En mamferos, una de las proteasas acrosomales mejor estudiadas presenta actividad tipo tripsina y ha sido denominada acrosina. La importancia de esta proteasa en la fecundacin ha sido, sin embargo, puesta en duda ya que animales transgnicos cuyos espermatozoides carecen de acrosina son tan frtiles como los controles. Recientemente, fue descrito en espermatozoides humanos y de ratn un complejo protesico multienzimtico o proteosoma, con un coeficiente de sedimentacin similar al de proteosomas purificados de otros tejidos humanos y actividad enzimtica tipo tripsina, tipo quimotripsina y peptidilglutamil peptidasa. Los proteosomas son el principal complejo proteoltico citoslico de las clulas eucariotas y corresponden hasta el 1% de las protenas citoplasmticas. Este complejo enzimtico est constituido por un cuerpo proteoltico llamado proteosoma 20S (aprox. 700 kDa), el que puede asociarse a protenas reguladoras, ATPasas y activadores, constituyendo el proteosoma 26S (aprox. 2.000 kDa). El sitio activo del proteosoma contiene una Thr, sugiriendo que podra tratarse de un nuevo tipo de proteasa. Lactacistina, un inhibidor potente y muy especfico de proteosomas, se une covalentemente a la Thr y lo inhibe de manera irreversible. La principal funcin del proteosoma es la de degradar la mayor parte de las protenas nucleares y citoslicas, despus de que stas son marcadas para su destruccin por unin covalente a molculas de ubiquitina. Adems, el sistema ubiquitina-proteosoma podra constituir un sistema regulador para varias reacciones biolgicas. Por ejemplo, el proteosoma puede activar el factor de transcripcin NF-B, a travs de la conversin del precursor p105 a la protena madura p50. Otros estudios han demostrado que varios receptores de superficie que sealan a travs de la activacin de protena tirosina quinasa, se ubiquitinan y se degradan en respuesta a la unin con el ligando o a la fosforilacin. Sin embargo, el proteosoma tambin puede degradar protenas no ubiquitinadas. Finalmente, la estructura, composicin y localizacin intracelular del proteosoma puede variar en relacin a su funcin. As, existen diferencias en la actividad y estructura de proteosomas aislados de diferentes rganos y ocurren cambios en la distribucin intracelular de los proteosomas durante la progresin del ciclo celular. Estos cambios podran servir para controlar la velocidad de protelisis en regiones especficas dentro de la clula. La funcin biolgica de los proteosomas ha sido estudiada en espermatozoides de invertebrados marinos. En estos organismos, el proteosoma espermtico est involucrado en mltiples etapas del proceso de fecundacin, tal como la RA inducida por la gelatina del ovocito, la unin y digestin/penetracin de la membrana vitelina y la fusin con la membrana plasmtica del ovocito. La funcin biolgica de los proteosomas en los espermatozoides de mamferos, sin embargo, constituye un rea aun inexplorada. De lo anteriormente sealado y del anlisis de la literatura es claro que la informacin existente sobre la funcin biolgica de las proteasas acrosomales tipo quimotripsina y el proteosoma en los espermatozoides de mamferos es muy limitada. La proposicin de este proyecto consiste en investigar la funcin biolgica de estas actividades protesicas en espermatozoides de mamferos, con particular nfasis en la especie humana. Por analoga de lo que se conoce en otras clulas eucariotas y en espermatozoides de invertebrados marinos, nuestra hiptesis de trabajo plantea que la actividad protesica tipo quimotripsina sera parte del complejo multienzimtico denominado proteosoma. El proteosoma, a su vez, estara involucrado en la regulacin de la fisiologa espermtica y en una o mas etapas claves e irreversibles del proceso de fecundacin. Especficamente, el proteosoma podra estar involucrado en la RA; la unin y penetracin a travs de la ZP; y en la fusin con la membrana plasmtica del ovocito. Sin lugar a dudas esta es una hiptesis atractiva que abre una nueva rea de investigacin en el estudio de la fisiologa espermtica y su regulacin. CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 3 Por lo tanto, en este proyecto proponemos especficamente: 1) estudiar la participacin de las proteasas tipo quimotripsina y el proteosoma en los diferentes eventos que caracterizan la fisiologa espermtica y la fecundacin; 2) caracterizar bioqumicamente las proteasas tipo quimotripsina y/o el proteosoma en espermatozoides de mamferos; y 3) determinar cambios en la localizacin intracelular de la actividad tipo quimotripsina y/o el proteosoma durante la capacitacin espermtica. Resultados ARTICULOS # PARTICIPATION OF SPERM PROTEASOME IN HUMAN FERTILIZATION, HUMAN REPRODUCTION, VOL.18 (5):1010-1017, 2003. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # ROLE OF THE SPERM PROTEASOME DURING IN VITRO FERTILIZACION IN THE MOUSE, FERTILITY AND STERILITY, VOL.80 (3) 2003. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. EVENTOS # DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD PROTEOSOMAL EN ESPERMATOZOIDES DE PACIENTES CON ANOMALIAS GENETICAS, En: CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 4 14 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCION Y DESARROLLO. LA SERENA, CHILE. 20030816-20030816. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # CHEMES, H E # DIAZ LOIS, EMILCE SILVINA # PIZARRO MOYA, EDUARDO # RAWE, V Y. # EXTRACELLULAR LOCALIZATION OF THE PROTEASOME IN HUMAN SPERM, En: 28 ANNUAL MEETING AMERICAN SOCIETY OF ANDROLOGY. ARIZONA, ESTADOS UNIDOS DE AMERICA. 20030329-20030401. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # JARA, MARCOS # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # FUNCION DEL PROTEOSOMA EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS, En: 13 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCION Y DESARROLLO. LA SERENA, CHILE. 20020815-20020817. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO # SILVA, C. CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 5 # FUNCION DEL PROTEOSOMA ESPERMATICO DURANTE LA FECUNDACION IN VITRO (FIV) EN RATON, En: 14 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCION Y DESARROLLO. LA SERENA, CHILE. 20030816-20030816. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. # IDENTIFICACION DEL PROTEASOMA EN LA MEMBRANA PLASMATICA DEL ESPERMATOZOIDE HUMANO, En: 14 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCION Y DESARROLLO. LA SERENA, CHILE. 20030816-20030816. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # LOCALIZACION EXTRACELULAR DEL PROTEASOMA EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS, En: 2 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD DE ANDROLOGIA Y GAMETOLOGIA DE CHILE. CHILE. 20003010-20030110. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # JARA, MARCOS # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 6 # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # PARTICIPACION DEL PROTEOSOMA ESPERMATICO EN EL PROCESO DE FECUNDACION EN HUMANOS, En: 1 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD DE ANDROLOGIA Y GAMETOLOGIA DE CHILE. TEMUCO, CHILE. 20020103-20020104. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # PRESENCIA DE PROTEOSOMAS EN ESPERMATOZOIDES DE MAMIFEROS, En: 13 REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCION Y DESARROLLO. LA SERENA, CHILE. 20020815-20020817. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # MOYA-MENDEZ, E # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # ROLE OF THE SPERM PROTEASOME DURING IN VITRO FERTILIZACION IN THE MOUSE, En: 59 ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR REPRODUCTIVE MEDICINE. 20031011-20031015. FERTILITY AND STERILITY, VOL.80 (3) 203. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 7 # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. # SPERM PROTEASOMES ARE INVOLVED IN HUMAN FERTILIZATION, En: 27 ANNUAL MEETING AMERICAN SOCIETY OF ANDROLOGY. SEATTLE, ESTADOS UNIDOS DE AMERICA. 20020424-20020427. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. INFORME FINAL # FUNCION DE LAS PROTEASAS TIPO QUIMOTRIPSINA Y EL PROTEOSOMA EN LA REGULACION DE LA FISIOLOGIA ESPERMATICA Y SU PARTICIPACION EN LA FECUNDACION EN MAMIFEROS, 2004. 16 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. MANUSCRITOS # COMPARISON OF TWO TECHNIQUES TO EVALUATE THE ACROSOMAL STATUS OF ZONA PELLUCIDA BOUND SPERM IN HUMANS, 15 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 8 # DECREASED PROTEASOME ENZYMATIC ACTIVITY IN SPERM FROM PATIENTS WITH GENETIC ABNORMALITIES OF THE HEAD-TAIL JUNCTION AND ACEPHALIC SPERMATOZOA, # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # CHEMES, H E # DIAZ LOIS, EMILCE SILVINA # PIZARRO MOYA, EDUARDO # RAWE, V Y. # EXTRACELLULAR LOCALIZATION OF PROTEASOMES IN HUMAN SPERM, # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # JARA, MARCOS # KONG, MILENE # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # FUNCION DEL PROTESOMA ESPERMATICO DURANTE LA FECUNDACION Y DESARROLLO PREIMPLANTACIONAL EN EL RATON, 15 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 9 # LOCALIZATION OF PROTEASOMES IN HUMAN SPERM, 13 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # JARA, MARCOS # KONG, MILENE # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # PROTEASOMAL ACTIVITY IN MAMMALIAN SPERMATOZA, 6 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # PROTEASOMAL ACTIVITY IN MAMMALIAN SPERMATOZOA, 21 p. # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO # PIZARRO MOYA, EDUARDO. # ROLE OF THE SPERM PROTEASONE IN THE IN VITRO FERTILIZATION IN MOUSE, CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 10 # Autores Asociados al Proyecto # MORALES RETAMAL, PATRICIO JOSE. Autores No Asociados al Proyecto # KONG, MILENE # PASTEN RAMOS, MARIA CONSUELO. TESIS CONICYT: Repositorio Institucional: Ficha de Iniciativa de CIT (Ciencia, Tecnologa e Innovacin) 11