ESPECTROSCOPIA

Hueder Paulo M. De Oliveira

Espectroscopia Molecular
Absoro e Fluorescncia
3
Espectroscopia: idias gerais
Transio de um estado
de menor energia (E
1
),
para um estado de maior
energia (E
2
).
Espectroscopia de
absoro: mede-se a
intensidade de absoro
em funo da frequncia
ou comprimento de onda.
4
Espectroscopia: idias gerais
Espectroscopia de
emisso: a molcula
passa do estado de maior
energia (E
2
) para o
estado de menor energia
(E
1
), emitindo o excesso
na forma do ftons.
Mede-se a intensidade de
emisso
5
Espectroscopia: idias gerais
Nmero de onda
(Infravermelho, espectroscopia
de vibraes moleculares);
mede-se em cm
-1
.
c
c
E E h
v

v
v

v
= =
=
=
1
~
2 1
6
Espectroscopia: idias gerais
Transies vibracionais (infravermelho)
Transies eletrnicas (UV e visvel,
fluorescncia)
7
Espectroscopia: idias gerais
8
Mtodos Experimentais
Espectrmetros:
fonte da radiao
luz transmitida,
emitida ou
espalhada pela
amostra coletada,
analisada pelo
detector
9
Intensidade de transies
Espectroscopia de
absoro
Lei de Lambert-Beer
c (L mol
-1
cm
-1
)
| |
| |
0
0
0
10
log
I
I
T
I I
l J
I
I
A
l J
=
=
= =
c
c
10
Deduo
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
0
0
0
0
0
0
0
0
0
d d
d
d
d
d
ln
ln ln10 log
ln10
ln10xlog
log
ln10
log
log
log log
I l
I
I J I x
I
J x
I
I
J x
I
I
J l
I
x x
I
J l
I
J l
I
I
I
J l
I
I
J l
I
I I
A
I I
A J l
k
k
k
k
k
c
k
k
c
c
c
=
=
=
=
= =
=

=
=
=
= =
=
} }
11
Exemplo: c do triptofano
=280 nm; Clula 1 mm;
0,50 mmol L
-1
triptofano;
T = 0,54;
Calcular: A e c em 280
nm, e T para l = 2,0 mm
| |
) 27 , 0 2 (
1 1 2
10 29 , 0 ) mm 0 , 2 (
27 , 0 54 , 0 log
mm mol L 10 4 , 5
log
: .

= =
= =
= =
T
A
l J
T
R
- -
c
| |
| |
0
0
0
10
log
I
I
T
I I
l J
I
I
A
l J
=
=
= =
c
c
12
Intensidade das transies
Coeficiente de absoro
integrado (vs c, para
avaliar a intensidade de
uma transio)
Momento dipolar da
transio
13
Espectros UV e visvel
14
Princpio de Franck-Condon
As transies
eletrnicas acontecem
muito mais
rapidamente que os
ncleos conseguem
reagir, pois possuem
mais massa que os
eletrons.
Estrutura vibracional
de uma banda.
15
Princpio de Franck-Condon
A transio acontece
para um estado
vibracionalmente
excitado:
Ncleos parados
correspondem a um
desvio mximo do
equilbrio.
ORBITAL MOLECULAR E TRANSIES ELETRNICAS
n
2 1
E =
E = E E h
n n n
n n
H E
H


v
=
( )
A =
Aproximao de Born-
Oppenheimer
e N
| =
Probabilidade de transio proporcional a:
2
2,1

Transies permitidas p/ simetria e spin Fortes

Transies proibidas p/ simetria ou spin Muito Fracas
2
v v
/
' ''
( )
Fator de Franck-
Condon
Distncia internuclear
Fundamental
S
1
v 0
v 1
v 2
v 3
v
1
0
v
1
1
v
1
2
v
1
3
Transies Eletrnicas do estado fundamental para o excitado
rea sombreadas mostram
a probabilidade de onde o
eltron estaria se estiver
na mesma faixa vibracional
Transies mais favorecidas
ocorrem da reas mais
sombreadas do estado
fundamental para reas
mais sombreadas do
estado excitado.
Probabilidade
Alta
Alta
Media
Baixa
E
Distncia internuclear
Fundamental
S
1
v 0
v 1
v 2
v 3
v
1
0
v
1
1
v
1
2
v
1
3
Probabilidade
Comprimento de onda, nm
O valor do comprimento de onda de absoro e a absortividade molar so
determinadas pelo grau de conjugao das ligaes t
Mximos de absoro : Importncia da Cojugao
Aumento do nmero de duplas ligaes desloca a absoro para
menores energias
Wavelength nm
N=5
5 ligaes t, 10 eletrons
N=4
4 ligaes t, 8 eletrons
N=3
3 ligaes t, 6 eletrons
Como grau de conjugao aumenta
(isto , o nmero de eltrons envolvidos nos orbitais t delocalizados)
a energia de absoro diminui (> )
A absoro mais intensa (>c, aumenta probabilidade de absoro)
Benzeno < Naftaleno < Antraceno < naftaceno < pentaceno
Abs. Max 262nm 275 nm 375 nm 475 nm 580 nm
Log c 3.84 3.75 3.90 4.05 4.20
275 nm 375 nm 475nm
Incremento do nmero de anis aromticos desloca o mximo
de absoro para valores maiores
21
Quebra de
Regra:
Simetria Acoplamento
Vibrnico
Spin Acoplamento Spin-Orbita
22
Absoro Eletrnica de Molculas
Grupos cromforos
290 nm: CO
(transio n-t-; ca. 4eV)
Transies d-d(complexos);
Ex.: Cu
2+
500 700 nm
(azurina)
Transies c/transferncia de
carga (ML ou vice versa)
Ligaes duplas C=C
(transio t-t*; ca. 7eV, UV);
Conjugadas vis; Ex.:
caroteno
23
Espectroscopia eletrnica
As posies e as intensidades so sensveis s
interaes intermoleculares
24
Decaimento por emisso e sem
emisso
Por emisso
Fluorescncia
Fosforescncia
Sem emisso
Dissociao
Espectroscopia de Fluorescncia
26
Decaimento por emisso e sem
emisso
Transies verticais
(princpio de Franck-
Condon)
27
Processos que causam a
fluorescncia
Diagrama de Jablonski
Propriedades Espectrais
Deslocamento espectral (Stokes)
Espectro de emisso independe do
comprimento de onda de excitao (Regra de
Kasha)
Imagem especular
Deslocamento de Stokes
Diferena entre os mximos dos espectros de
emisso e absoro.
Influenciado por:
Polaridade da molcula
Rigidez
Polaridade do solvente
Espectros de Excitao e
Emisso

emi
>
exc
E
emi
< E
exc
Deslocamento
de Stokes
EX 3
EX 2
EX 1 EM 1
EM 2
EM 3
Espectro de
Excitaco
Espectro de
Emisso
Comprimento de onda
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Espectros de Excitao e Emisso
Espectro de Absoro vs espectros de excitao e emisso
34
Fluorescncia e o relaxamento do
solvente
O da emisso
(fluorescncia)
maior que o de
absoro
Relaxamento do
solvente
Transferncia de
energia de excitao
ao solvente
35
Processos que causam a
fosforescncia
Diagrama de Jablonski
Desde um estado excitado triplete
(fluor.: estado excitado singlete)
Estado fundamental: singlete (eletrons
emparelhados)
Estado excitado depois de absorver
fotons: singlete
Processo de crusamento intersistemas
(S T)
Por acoplamento entre momento
angular orbital e o momento angular de
spin
Facilitado na presena de tomos
pesados, com uma carga nuclear maior
A transio T
1
S
0
proibida
emisso muito lenta
A fosforescncia mais intensa em
amostras slidas, onde a transferncia
de energia menos eficaz
Rendimento quntico de fluorescncia - |
f
Ou eficincia quntica para fluorescncia ou fosforescncia dada pela
razo entre o nmero total de molculas que fluorescem (ou
fosforescem) e o nmero total de molculas excitadas.
Todos os processos de desativao contribuem para a determinao do
rendimento quntico:
f ISC IC
f
f
k
k k k
| =
+ +
Tipos de transio eletrnica envolvidas na fluorescncia
Raramente se observa fluorescncia para absores no UV para < 250
nm
= 200 nm = 600 kJ/mol - a maioria das molculas possui pelo menos
algumas ligaes que se rompem para energias desta magnitude pr-
dissociao ou dissociao podem ocorrem.
Conseqncias :
Fluorescncia envolvendo transies do tipo o*o raramente
observada.
Fluorescncia comumente observada para transies de menor energia
do tipo t* t e t* n.
As transies t t* (absores) so mais intensas (de maior
probabilidade) do que as n t* emisses fluorescentes envolvendo
orbitais t,t* so as que apresentammaior eficincia quntica.
Determinao de Rendimento
Quntico
Determinado a partir de um padro de
fluorescncia pela expresso.
|
F
= |
F
[(Abs
padro
A
If
amostra
)/(Abs
amostra
A
If
padro
)]
Padro Solvente Regio, nm |
F

Sulfato de Quinina 0,1 M H
2
SO
4
400-600 0,5460,023
9,10-
Difenilantraceno
Ciclohexano 400-500 1,0000,050
2-Aminopiridina 0,1 N H
2
SO
4
315-480 0,6000,050
Triptofano H
2
O pH 7,20 300-380 0,1300,010
Rodamina 101 Etanol 600-650 1,0000,020
Violeta de Cresila Metanol 600-650 0,5400,030
Antraceno Etanol 360-480 0,2700,030
Naftaleno Ciclohexano 300-400 0,2300,020
Benzeno Ciclohexano 270-300 0,0500,020

40
Cintica de decaimento dos
estados excitados
Absoro: 10
-16
10
-15
s
Fluorescncia: 10
-12
10
-6
s
Reaes a partir do estado excitado singlete: 10
-15
10
-12
s
Viso
Fotossntese
Fosforescncia: 10
-6
10
-1
s
Reaes a partir do estado excitado triplete
*] [ * : interna Converso
*] [ * * : mas intersiste Crusamento
*] [ * : cia Fluorescn
* : Absoro
IC IC
ISC ISC
f f
abs abs
S k v S S
S k v T S
S k v h S S
I v S h S
f
i
=
=
= +
= +
v
v
41
Cintica de decaimento dos
estados excitados
Taxa (?) e rendimento quntico de fluorescncia
abs
f ISC IC
f ISC IC
0 0
Velocidade de formao de *:
Velocidade de decaimento de *: [ *] [ *] [ *]
( )[ *]
[ *] [ *] exp( / )
onde [ *] e a concentrao de S* no tempo t
Tempo de vida de fluoresc
t
t
S I
S k S k S k S
k k k S
S S t
S
t
=
=
= + +
=
0
f ISC IC
f
f
f ISC IC
1
ncia :
k k k
k
k k k
t
|
=
+ +
=
+ +
O tempo de vida de fluorescncia o
tempo necessrio para a intensidade
decair para 63,2% do valor inicial.
42
Deduo
) (
*] )[ (
*] [ cia fluorescn de Taxa
*] )[ (
0 *] )[ (
d
*] [ d
io estacionr estado do aprox. - Pequeno *] [
IC ISC f
f
f
IC ISC f
f
abs
f
IC ISC f abs
IC ISC f abs
k k k
k
S k k k
S k
I
S k k k I
S k k k I
t
S
S
+ +
=
+ +
= =
+ + =
= + + =
|
|
Tempo de Vida de
Fluorescncia
Velocidade de despopulao do primeiro estado
singlete excitado para o estado fundamental
t = 10
-4
/ c
mx
t ~ 10
-9
s para molculas com alta absoro
44
Exemplo
O tempo de vida de fluorescncia pode ser
medido.
Exemplo: triptofano em H
2
O; |
f
= 0,20;
t
0
= 2,6 ns;
Ento k
f
= 7,710
7
s
-1
f
f
f IC ISC f
f
IC ISC f
0
1 1
k k k k k
k
k k k
|
t =
|
|
.
|

\
|
+ +
=
+ +
=
45
Supresso (quenching) de
fluorescncia
Remoo de energia
sem emisso
Equao de Stern-
Volmer
| | Q k
Q 0
f
0 , f
1 t
|
|
+ =
46
Derivao
Equao de Stern-Volmer
| | ( )| |
| |
| |
| |
| |
| | Q 1
Q
Q
0 [Q] quando
Q
1
suppressor de presena na
Q
0 * Q
d
*] [ d
[Q][S*] supresso de taxa * Supresso
IC ISC f
Q
IC ISC f
Q IC ISC f
f
Q IC ISC f
IC ISC f
f
f
f,0
IC ISC f
f
f,0
Q IC ISC f
Q IC ISC f
f
f
Q IC ISC f abs
Q
k k k
k
k k k
k k k k
k
k k k k
k k k
k
k k k
k
k k k k
k k k k
k
S k k k k I
t
S
k Q S Q S
+ +
+ =
+ +
+ + +
=
|
|
.
|

\
| + + +

|
|
.
|

\
|
+ +
=
+ +
= =
+ + +
=
+ + +
=
= + + + =
+ +
|
|
|
t
|
47
Supresso (quenching) de
fluorescncia
Intensidade e tempo de
vida so proporcionais ao
rendimento quntico
obedecem a mesma
equao
| | Q k
I
I
Q 0
f
0 , f
0
f
0 , f
1 t
|
|
t
t
+ = = =
48
Exemplo: constante de supresso
Triptofano; O
2
dissolvido
[O
2
]/(10
-2
mol L
-1
) 0 2,3 5,5 8,0 10,8
t/(10
-9
s) 2,6 1,5 0,92 0,71 0,57
49
Exemplo: constante de supresso
Triptofano;
O
2
dissolvido
k
Q
= 1,310
10
L mol
-1
s
-1
| | Q k
Q
0
1 1
+ =
t t
50
T14
Mecanismos de supresso de
estados excitados
De-excitao por colises: S Q S Q
Transferncia eletronica : S Q S Q S Q
Transferncia ressonante de energia : S Q S Q*
*
* ou
*
+ +
+ +
+ + +
+ +
Por colises: eficaz com Q uma espcie
pesada, como tomo I
Ex.: triptofano pode ser suprimido quando est na
superfcie da protena
51
Transferncia eletrnica
Taxa de transferncia: Teoria de Marcus
1. Diminui com a distncia entre S* e Q
2. A
r
G < 0 : o potencial de reduo de S* deve
ser mais baixo que o do Q
3. A energia de reorganizao de S*, Q e
solvente deve ser prxima ao A
r
G
Pode ser estudado usando a
espectroscopia com resoluo temporal
52
Transferncia ressonante de
energia
S* + Q S + Q*
Teoria de Frster
S* e Q devem estar
prximos (ca. nm)
Fotons emitidos por S*
podem ser absorvidos
por Q
6 6
0
6
0
T
f,0
f
T
: rgido sistema
1
R R
R
+
=
=
c
|
|
c
53
Valores de R
0
54
Transferncia ressonante de
energia
Medio de
distncias em
sistemas biolgicos
Calcula-se a distncia
(entre 1 nm e 9 nm)
sabendo o R
0
6 6
0
6
0
T
f,0
f
T
: rgido sistema
1
R R
R
+
=
=
c
|
|
c
55
Exemplo: usar a tcnica FRET
Um aminocido na
superfcie de
rodopsina for
marcado com 1.5-I
AEDANS
Rendimento quntico
foi reduzido de 0,75
para 0,68 (supresso
por retinal)
c
T
= 0,093 (R
0
=5,4 nm)
R=7,9 nm
56
Viso
Xantofila:
transio tt*;
corrige aberrao
cromtica
11-cis-retinal, ligado a
rodopsina: pigmento
visual
Fotoisomerisao:
transio tt*; 200
ps; |=2/3;
em 0,25-0,50 ms
rodopsina fica ativada
57
Viso
Xantofila:
transio tt*; corrige
aberrao cromtica
11-cis-retinal, ligado ao
rodopsina: pigmento
visual
Fotoisomerisao:
transio tt*; 200 ps;
| = 2/3;
em 0,25-0,50 ms
fica a rodopsina ativada
58
Fotossntese
Complexos de pigmentos com protenas
A luz excita a molcula a um estado singlete
0,1 5 ps transferncia por Frster
Passados 100-200 ps, +90% da energia
chega ao centro da reao
Excita-se o dmero de clorofila a
Transfere-se a energia a feofitina a (3 ps)
Transferncia mais rpida que a emisso
(clorofila a: 5 ns)
59
Terapia fotodinmica
O medicamento
sensibiliza o oxignio
singlete
produtos reagentes

*
h
+
+ +

+
2
1
2
1
2
3 3
3
O : Oxidao
O P O P : bilizao Fotossensi
P P : mas intersiste Crusamento
* P P : Absoro v
Exerccios
1) A fluorescncia de uma soluo de um pigmento vegetal iluminada por radiao de 330 nm foi
estudada na presena de um agente de extino, com os seguintes resultados:
[Q]/(mmol.L
-1
) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
I
f
/I
abs
0,31 0,18 0,13 0,10 0,081
Em uma segunda srie de experimentos, a radiao incidente foi extinta e foi observado o tempo de
vida do decaimento de fluorescncia:
[Q]/(mmol.L
-1
) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
t/ns 76 45 32 25 20
Determine a constante de velocidade de extino e a meia-vida da fluorescncia.
R: constante de velocidade de extino = 9,2.10
9
Lmol
-1
s
-1
e meia-vida = 1,9.10
-7
s
2) Diferencie o processo de fluorescncia do processo de fosforescncia mostrando equaes,
diagramas, etc.
3) Discuta o efeito do tamanho da cadeia e estrutura molecular nos espectros de absoro e emisso.
60
61
0,0
2,0x10
-3
4,0x10
-3
6,0x10
-3
0,0
2,0x10
7
4,0x10
7
6,0x10
7
1
/
t
,

s
-
1
[Q], mol/L
Equation y = a + b*x
Adj. R-Square 0,99938
Value Standard Error
C Intercept 3,88743E6 378936,16269
C Slope 9,1462E9 1,14254E8
Referncias
Bibliografia
Atkins, P. W. e Paula, J. de, Fsico-Qumica, 8. ed.,Vol. 2, Rio de
Janeiro, LTC, 2008
Mac Quarrie, D. A. e Simon, J. D., Physical Chemistry A Molecular
Approach, University Science Books, 1997
Leitura recomendada:
1) Principles of Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz, Plenum
Press, 1986.
2) Levine, I. N.; Molecular Spectroscopy; John Wiley and Sons,
1975, New York
62