PROGRAMA NACIONAL DE OOENAS SEXUALMENTE TRANSMlsslvEIS/ AIOS

Manual de Procedimentos
Para Testes Laboratoriais
I
Manual de Procedimentos
Para Testes Laboratoriais
I
PROGRAMA NACIONAL OE OOENAS SEXUALMENTE TRANSMISSVEIS/AIOS
"1992 - Ministrio da Sade
secretaria Nacional de Assistncia Sade
Departamento de Programas de sade
Programa Nacional de Controle de DST/AIDS
Esplanada dos Ministrios G Sobreloja
CEP: 70.0sa-900
Tel.: (061) 315-2520
Fu.: (061) 315-2519
1rJl)f8SSO no BrasiVPrinted ln Brazil
FICHA CATALOGRFICA
Mmcsteno da s.ooe. Sea.tana Nacional de Assistncia l S.de. Departamento de Programas de Sade.
Coordenao Gal de Programas Cllnic:o-Sanitrios. Coordenao do Programa Nacional de Controle
d. Doenas Sexualmente TransmlSslveisJAIOS.
Diagnstico laboratorial das doenas sexualmente transmisslveisIMinisl:rio da Sade, Secretaria Nacional
d. Assist'ncia Sade. Departamento de Programas d. Sade. Coordenao Geral de Programas Cllnico-
CoordenaAo do Programa Nacional de Controle de Doenas Sexualmente TtansmisslvelSlAIDS -
Brasnill: Coordenalo do Programa Nacional de Controle de Doenas Sexualmente TransmisslveisiAIDS,
1992.
44 p.: I.
SUMRIO
pg.
APRESENTAO
5
OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
MDULO 1- DIAGNSTICO LABORATORIAL DA SIFILlS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1. PESOUISA DO Treponema pallldum EM MATERIAL DO PACIENTE. . . 13
1.1. Exame microscpico de campo escuro ........................................ 13
12. Exame por imunolluorescncia direla ........................................ 13
2. TESTES SOROLGICOS 14
2.1. Testes preliminares, no ~ s 14
22. Testes oonf!rmalrios treponmK:os ...................................... 16
2.3. Inte<pretao dos testes sorolglCOS 19
3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................. 20
MoULO II - DIAGNSTICO LABORATORIAL DA GONORRIA .............. 21
1. COLHEITA DA AMOSTRA CLiNICA .......................................... 25
1.1. ColheIta da amostra na mulher ............................................. 25
12. Colheita da amostra no homem 26
2. EXAME BACTERIOSCPICO DIRETO 26
2.1. Preparo do esfregao ..................................................... 26
2.2. C_ao pelo Mtodo de Gram . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3. Leitura das lminas ..................................................... V
3. SEMEADURA DA AMOSTRA CLiNICA 27
3.1. MeK>S de rottura c:orr'Il.KOeflte usados ....................................... 27
32. TcnICO de semeadura 27
3.3. Inclbao das placas 27
4. IDENTIFICAO PRESUNTIVA 28
5. IDENTIFICAO DEFINITIVA 28
6. L1BERAO DOS LAUDOS 29
6.1. Bacteriosoopia 29
62. Cultura ............................................. 29
9.1. Controle de qualidade do Gram .
9.2. Controle de qualidade do meio de Thayer Martin modificado (TMM) .
9.3. Controle de qualidade dos carooldratos ........................................
9.4. Controle de qualidade da prova de oxidase ...................................
7. PESQUISA DE N. gonorrhoeae RESISTENTE A ANTIBiTICOS BETA-LACTMICOS . .. . . . . . 29
7.1. Teste iodomlrico rpido. .. . .. . . . . . .. . . . . . .. . . . . .. . . .. . . 30
7.2. Teste acidomtrico rpido 31
7.3. Tesle da Cefalospor;na cromognica ................... 32
8. ESTOCAGEM DE N. gonoohoeae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
9. CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO OE DST 33
33
33
36
36
ANEXO I - Reagentes para Colorao de Gram .................................... 36
ANEXO II - Meio de Cultura de Thayer Martin Modificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 37
ANEXO III - Teste de Citocromo-Oxidase 36
ANEXO IV - Metabolizao de Carboidratos ................................. , , 39
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 40
MDULO 11I- DIAGNSTICO LABORATORIAL DE OOENAS DE TRANSMISSO SEXUAL
ND-GONOCCICA 41
1. CANCRO MOLE ..................................................... 45
1.1. Coleta da amostra clnica para bacterioscopia .................................. 45
1.2 Coleta da amostra clnica para cultura ......................................... 45
1.3. Liberao dos laudos ..................................................... 45
2. OONOVANOSE ........................................................ 45
2.1. Diagnstico laboratorial 46
22. Liberao dos laudos ................................................... 46
3. VAGINITE POR Gardnerella vaginal is . . . . . . .. . . . . . . ... . .. 46
3.1. Diagnstico laboratonal .................................................. 46
3.2. Liberao dos laudos ..................................................... 47
4. TRICOMONiASE 47
4.1. Diagnstico laboratorial .................................................. 47
4.2. Liberao de laudos 47
5. CANDIDiASE ..................................................... 47
5.1. Diagnstico laboratafial ................................................... 48
5.2. Liberao de laudos ..................................................... 48
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
48
6. DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS DST CAUSADAS POR Chlamydia trachamalis .. 49
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 50
APRESENTAO
A incidncia das doenas sexualmente transmissveis (081) lem aumentado em proporo
verdadeiramente alarmante e se tomado um grave problema de sade pblica em todo o mundo.
necessrio, portanto, conlrollas, j que as DST nao apenas atacam a populaao adulla mas afelam,
tambm. o adolescente. o feto e o recm-nascido.
O controle dessas doenas bastante diHcil em vista de diversos fatores, dentre os quais
destacamos os de ordem social e mdica.
Ao examinar estes fatores, conclu-se que as mudanas nos padrOes de comportamento sexual
e o uso de mtodos contraceptivos tm contribudo para o aumento generalizado das DST. Em adio ao
grande nmero de casos assinlomticos ou nao diagnosticados que persistem como reservatrios,
perpetuando as infeces. Alm do gonococo e do Treponema pallldum, existem muitos outros
microorganismos que s30 transmitidos pelo ato sexual. Varias combinaOes destes microorganismos
coexistem e s30 transmitidas simultaneamente. Portanto, infecOes mltiplas existem e devem ser tratadas
adequadamente. Muitos dos microorganismos respondem bem terapia antibitica, embora recidivas
ocorram. Tendo em vista a ocorrncia de resistncia aos antibiticos, a rotina teraputica deve ser
cuidadosa.
Algumas dessas infecoes podem persistir no estado de latncia, tornandose ativas meses ou
mesmo anos aps a inle<:ao inicial a reinfec30 comum, particularmente entre certos grupos
populacionais.
O controle das doenas sexualmente transmissiveis deve envolver uma equipe mul1idisciplinar,
na qual o especialista em laboratrio responsvel pelos exames laboratoriais necessrios para a
confirma30 elou diferencia30 do diagnstico.
Este fasciculo, que contou, em sua elabora30, com o apoio tcnico dos doutores Mario E.
Camargo, Oalair Antnia Neto de Souza, Oborah Mongagnini. Geni Noceti de lima Cmara e Marta
Antunes de Oliveira, contm tcnicas e procedimentos para o diagnstico dos microorganismos envolvidos
com as doenas sexualmente transmissveis e dirigido especificamente para o pessoal que trabatha na
area de laboratrio.
Lalr Guerra de Macedo Rodrigues
Coordenadora
Programa Nacional de Controle de DST/AIDS
5
OBJETIVOS
Gerais:
Padronizar OS reagentes e tcnicas usadas no diagnstico das doenas sexualmente transmisslveis;
Criar um sistema nico de dados laboI'atoriais que permita determinar a prevalncia de algumas DST;
Enfatizar a importncia do laboratrio no oontrole das asr.
Especificos:
Executar os testes laboratoriais recomendados para apoio diagnstico das DST;
Explicar os pl'incpios dos testes utilizados para apoio diagnstico das DST;
Interpretar os resultados dos lestes laboratoriais;
Registrar e analisar os dados obtidos;
Liberar adequadamente os resultados laboratoriais;
Implantar controle de qualidade no laboratrio de osr.
7
MODULO I
DIAGNOSTICO LABoRATDRIAL DA SIFllIS
9

SiFILlS
Doena causada pelo Treponema pallidum, transmitida sexualmente, por vla placentna a, even-
tualmente, por transfuso de sangue. A leso l n i i ~ protosifiloma oucancro dt.rO, uma UI09rao indolor de
bordas endurecidas, Que aparece de 2 a 6 semanas aps o contgio e desaparece aps cerca de 2 meses.
Esquematicamente. a essa lase de sirilis primria segue-se a de sltilis secundria, com erupo cutnea
papular, leses mucosas e reao ganglionar. Em seguida a infeco entra em 'ase de latncia, chamada
precoce no pnmelro ano de doena e tardia depols desse perodo. Anos dep)IS pode se manIfestar a sllilis
terciria, com ~ pnoopalmente carcltovasculares ou de sIstema net'VOSO central.
11
1. PESQUISA DO Treponema pallidum EM MATERIAL DO PACIENTE
Na sifjlis recente o T. pallidum pode ser detectado por exame microscpico, de campo escuro ou de
imunofluorescncia, no exsudato da leso primria, em material de leses secundrias, principalmente de
mucosas, e em material de puno ganglionar. Em recm-nascidos com sfilis congnita, pode ser encontra-
do em exsudato nasal e de nasofaringe.
1.1. Exame microscpico de campo escuro
1.1.1. Coleta do material
De uma coleta adequada depende o bom xito da pesquisa. limpar cuidadosamente a superfcie da
leso com gaze umedecida em soluo fisiolgica, evitando sangramento. Coletar o exsudato lmpido que se
forma na leso, tocando-o dlretamente com uma lmina de microscopia ou transfenndo-o para esta ala bac-
teriolgica ou com capilar.
1.1.2. Observao microscpica:
O material, entre-lmina e lamnula, examinado imediatamente por microscopia de campo escuro. No
caso de alguma demora para o exame, a lamnula pOOe ser grudada sobre a lmina, com parafina. A lmina
pOOe ser conservada temperatura ambienle e o exame realizado at 1 ou 2 horas depois. Verificar a exala
centralizao do condensador de campo escuro e as condies de Iluminao, o que pOOer ser feito previa
mente com um preparado contendo um raspado de gengivas em uma gola de soluo salina. Este material
habitualmente contm espiroquetas de Treponema denticols, biotlpo microdentium
Observar os preparados com obJetiva seca (40x a 6Ox) e os organismos SUSpeItos com objetiva de
Imerso. O T. pallidum um esplroqueta delicado, com ~ a 10 f.l.m de comprimento e forma de saca-ro-
lhas com espirais apertadas, Intensamente mvel. Apresenta movimentos de translao para frente e para
trs e movimentos de rotao sobre o eixo longitudinal.
1.1.3. Interpretao:
Sendo adequada a coleta, o exame microscpico de campo escuro, de material de prolosifiloma, de
grande sensibilidade, com POSItiVidade maior do que 95%. Resultados negativos no excluem sfilis e devem
ser repelidos diante de uma suspeita clnica da doena. Exames negativos podem ser causados por limpeza
da leso com gua e sabo, pela ao local ou Sistmica de drogas trep:memicidas, ou verificados em
leses de maiS longa durao. Em leses bucaiS h nsco de resultados positiVOS falsos pela presena de es
plroquetas no patogniCOS, de morfologia semelhante.
1.2. Exame por imunolluorescncia di reta
O material a examinar pOOe ser delicadamente distendido sobre lminas de microscopia. cerca de 10f.l.I
para uma rea de lcm
2
e seco ao ar. As lminas devem ser processadas no mesmo dia ou fixadas em ace-
tona por 10 minutos e conservadas em congelador at a realizao do exame, podendo ser enViadas, em ge-
Io, a laboratriOS adequadamente eqUipados para o lesle.
Para o exame, os preparados so incubados por 30 minutos com conjugado fluorescente especfiCO para
o T. pallidum, em geral um anllcorpo monoclonal marcado. MaiS Simplesmente, pode-se Incubar sobre os
13
preparados um soro sifiltico de alto ttulo, adequadamente dilufdo e prevIamente absorvido com
para FT DepoiS de lavadas, as lmInas so incubadas com conjugado antl 19G humana. oomo para o
teste FTA-ABS. DepoIs de montados com glicenna-aJcahna e lamlnula, os preparados so examinados em
mIcroscopIa de fluorescncia, como para o teste FTA-ABS. Nos testes pOSItiVOS so observados treponemas
ntensamente fluorescentes.
A tcnica de ImunollUOfescncla permite o exame do matenaJ mesmo depols de alguns dIas de colhido.
Alm dISSO, fornece resultados especficos que possibilitam a diferenciao entre o T. pallidum e trepone-
mas no patognICOS eventualmente presentes. que no so corados.
2. TESTES SOROLGICOS
2.1. Testes preliminares no treponmicos:
Estes testes detectam anttrorpos anh-lipidicos que se formam no paciente infectado em resposta a ma-
tena! lipoldlCO, libertado tanto de suas prpnas clulas lesadas como dos treponemas.
Os testes antl-liptdlCOS utIlizam um antigeno btologicamente lnespecfico, a
rol), fosfolptde presente em tecKlos animaiS e extrado do c:orao de bat, qual se associam a lecitina e o
colesterol. Representados pelo teste do VDRL e suas variantes, so maes de floculao, mas h tambm
o teste de fixao do compM3mento, hoje de utIlizao multo limitada.
A sensibilidade e a especlfk:ldade destes testes so BlUstadas seglJldo as propores dos
tes do antgeno e as caracterlshcas da. suspenso anhgrllca utilizada. bem c:cmo da tcnica de execuo do
teste, que deve ser ngorosamente seguk1a. Variaes tanto do antigeno como da tcnica, por pequenas que
paream, podem aumentar stgnificativamente as porcentagens de resultados faJ5O-pOSltivos e faJscrnegatl-
ws, que freqentemente passam despercebidos ao laboratonsta
2.1.1. Teste do VDRL em lminas
2.1.1.1. Equipamento e material necessrios:
- centrifuga, para separao dos soros;
- banho-maria, ajustado a 569C :!; 1QC;
- agitador tIpo Kline, com 180 :!; 2 rotaes por minuto, com amplItude de 2 cm;
- microscpIO com objetiva de 10 aumentos;
- lminas ou placas de vidro transparente. com reas circulares demarcadas com anis de 14mm de
dimetro intemo, ou placas com escavaes circulares, lipo Kline;
- tubos de ensaio;
- pipetas de 1mi em centsimos e de 5ml em dcimos;
- seringa tipo LU8f, de lml ou 2m1;
- agulhas calibre 18, sem bisei, fornecendo 60 :!; 2 gotas por mililitro. (Adapte a agulha a uma pipeta
ou seringa de 2ml, graduadas, e conte o nmero de gotas correspondentes a 1mi de gua ou de 50--
kJo salina).
2. 1.1.2. Reagentes:
- Antgeoo VORL de boa procedrda;
- Soluo salina lamponada (SSTJ, com pH 6,0 0,1
Composio:
Cloreto de sdio ...................... 10,Omt
Fosfato dlssdi<x) anidro 0,37g
Foslato monopotsslGO anKlro ......... O,17g
Formaldeldo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5m1
g.Ja deslllada para .... ............ 10ll0m1
Confenr o pH. ConseNW em frasoos com tampa de rosca.
14
- Soluo salina a 0,9% - Dissolver 9g de NaCI em gJa destilada para 1lXX)m1.
2.1.1.3. Soros controle
Soro reagente, soro fracamente reagente e soro no reagente, testados contra padres respectIvos de
um laboratrIO de refernCia.
2.1.1.4. Procedimento
Soros:
Aquecer em banho-maria a 56C 1C por 30 minutos. Se ulllizados depois de 4 horas desta mati-
vao, aquecer novamente a 56C por 10 minutos.
Suspenso antignica:
Pipetar OAml de SST em frasco de 30ml, com rolha de vidro, redondo, de lundo plano. Gota a gota, adi
clonar por 6 segundos, 0,5m1 de antgeno, contido na metade inferior de uma plpeta de 1mi, graduada, en-
quanto se imprime ao Irasco, delicado movimento de rotao sobre uma superfcie plana. Na ltima, gota,
esvaziar a pipeta. Continuar a rotao por mais 10segundos. AdiCionar ao frasco 4,1 mi de SST, arrolhar e agi-
tar, por movimentos verticaiS, cerca de 30 vezes em 10 segundos. No devem ser preparados volumes mert<>-
res de suspenso antignica. No caso de maior nmero de testes, podem ser preparados volumes dobrados,
mas no maiores. A suspenso antignica deve ser utilizada no mesmo dia. Entretanto, h relerncia de boa
preservao distribuindo-a em alquotas, que podem ser conservadas em congelador por at 30 dias e utili-
zadas totalmente quando degeladas.
Teste qualitativo:
Os soros e os reagentes devem estar temperatura ambiente, que para a realizao do teste dever li
car entre 23C e 29C. Colocar 50.... 1de soro inativado na rea circular da lmina (este volume deve ser rlga-
roso, a partir de pipeta automtica de 50.... 1ou de pipeta de VIdro de 0,1 mi, graduada). Adicionar 1 gota
(1/60ml) da suspenso antignica ImprimIr rotao lmina por 4 minutos (180 r.p.m., amplitude 2cm). Ler
imediatamente em microscpio com objetiva 10x e ocular 10x. Floculaes com partculas grandes ou m-
dias correspondem a soros reagentes, pequenas a soros fracamente reagentes e partculas antignicas
bem dispersas ou apenas levemente grosseiras, a soros no reagentes. Ocasionalmente, soros fortemente
reagentes apresentam resultado negativo, em conseqnCia a uma reao de prozona. Por este motivo,
sempre deve se incluir nos testes diluies de soro a 1:10 em soluo salina, que resultaro reagentes nos
casos de reao de prozona.
Testes quantitativos:
Preparar diluies dobradas do soro diretamente na lmina, por adio e transferncia a volumes su-
cessivos de 50.... 1de soluo salina, desprezando-se 50.... 1da ltima diluio. Toma-se como titulo a ltima di-
luio nitidamente reagente (no fracamente reagente).
Teste do VOAL em lquido cefaloraqueano (LCR)
As amostras de LCR a testar so previamente centrilugadas mas no inalividas.
Diluir a suspenso antignica a 1:2 com soluo salina a 10% (dissolver 10g de NaCI em gua destila-
da, completar para 1ooml). Misturar delicadamente, aguardar 5 minutos. No utilizar depois de 2 horas. O
teste feito em lminas escavadas, com cavidade de 16mm de dimetro e 1,75mm de profundidade, estan-
00 as amostras e a suspenso antignica com temperatura ambiente (23
9
C a 299C). A 50.... 1de LCR, adicio-
15
nar 1 gota de 10..,.1 (0,01ml) da suspenso antignica. Esta deve ser gotejada com agulha de calibre 22 for-
necendo 100 :t 2 gotas por mililitro. Agitar as lminas por 8 minutos de rotao (180 :t 2 r.p.m.) e ler ao mi
croscpio. As amostras reagentes podem ser tituladas em teste quantitativo realizado com diluies dobra
das do LCR em soluo salina a 0,9%.
2.2. Testes confirmatrios treponmicos
Estes testes detectam anticorpos suscitados por determinantes antignicos do T. pallidum. Inicialmen-
te foi desenvolvido o teste de Imobilizao do Treponema (TPI), oonsiderado como paci'o, mas que no
utIlizado para fins de rotina. Para exames de rotina, utiliza-se o teste de imunofluorescncia (FTAABS), oom
100000as de T. pallidum fixadas em lminas de microscopia, e o teste de mlcroemaglutinao (MHATP), com
hemcias recobertas com componentes antignicos do T. pallidum
2.2.1. Teste FTA-ABS
Sobre as lminas com treponemas, incubam-se os soros, previamente absorvidos. Para revelar os anti
corpos eventualmente fixados sobre os treponemas, as lminas, depois de lavadas, so incubadas com um
oonjugado de anticorpos anli-globulinas humanas com fluorescena Para os soros reagentes, os treponemas
se mostram fluorescentes ao exame por microscopia de fluorescncia. Para que o teste seja especfico,
necessrio afastar as rea8s de anticorpos, presentes no soro, oontra antgenos ~ d e grupo", comuns a tre-
ponemas no patognicos que ocorrem no organismo humano. Para esse fim, estes anticorpos so bloquea
00s pela adio prvia, ao soro, de um "AbsoNente" que contm os antgenos de grupo.
A sensibilidade do teste depende de numerosos fatores, relacionados com o equipamento de microsco-
pia fluorescente, a reatividade do antgeno, as caractersticas e diluio do conjugado fluorescente, a exe-
cuo e leitura corretas do teste, bem como de um reagente "absorvente" satisfatrio. Desse modo, o teste
FTAABS deve ser rigorosamente padronizado em cada laboratrio com o auxlio de soros controle.
2.2.1.1. Equipamento e material necessrios:
- microscpio de fluorescncia, de transiluminao ou de epiiluminao, com filtros para fluorescena e
com campo escuro;
- estufa bacteriolgica a ~
- caixa plstica com tampa, para incubao das lminas em ambiente mido;
- lminas de microscopia de 1mm de espessura, oom reas circulares de 5mm de dimetro;
- laminulas 24 x 60;
- cubas de Coplin para lavagem de lminas.
2.2.1.2. Reagentes:
- suspenso antignica de T. pallidum cepa Nichols, liofilizada;
- acetona, p.a.;
- conjugado fluorescente anti IgG humana;
- reagente absorvente;
- soluo salina tampanada oom fosfatos 0,01M, pH 7,2 (PBS);
- soluo estoque de ~ u l de Evans a 0,01 g%;
- PBS com Tween 80 a 1%;
- glicerina alcalina (9 partes de glicerina, uma parte de tampo car1Jonato-blcarbonato de sdio, O,SM,
pH 8,5).
22.1.3. Soros controle
a) soro reagente;
b) soro no reagente;
16
c) soro de reatividade mnima (1 +);
d) SOfO positivo falso. testados contra soros de um laboratriO de referncia.
2.2.1.4. Procedimento:
Preparo das lminas:
Reconstituir a suspenso liofi1izada de treponemas segundo as instrues do fabricante. Homogeneizar
delicadamente, com pequena seringa e agulha fina, para disperso completa dos treponemas. que deve ser
rootrolada por microscopia de campo escuro. Colocar uma gota da suspenso em cada rea circular da l
mina, aspirando todo o excesso, ficando uma pelcula de lquido sobre toda a rea (lminas bem limpas e
desengorduradas). Acertar a diluio final da suspenso para se obter de 30 a 40 treponemas por campo mi
croscpico (45x).
Secar as lminas ao ar por 15 minutos. imergi-Ias em acetona por 10 minutos (esta fixao opcional),
secar, embrulhar em papel e conservar a -2QQC at o uso. A reatividade de cada lote de lminas deve sef ve-
rificada atravs de testes com os soros controle.
Teste:
Retirar as lminas do congelador e aquec-Ias ligeiramente com jato de ar quente, para impedir con-
densao de gua do ar ambiente.
Diluir os soros, inalivados, a 1:5 com o reagente absorvente (0,05ml de soro + O,2ml de absorvente).
Misturar bem, transferir uma gota (30","1) de cada soro diluido para uma rea correspondente da lmina. Incluir
os soros controle reagente. de reao mnima, e no reagente, diludos segundo as instrues que os acom
panham, bem como uma rea apenas com soluo salina, para controle do conjugado. Incluir tambm o soro
controle falso-positivo, contendo apenas antiCOlPOS de grupo, no especficos. Este soro deve ser Includo di-
ludo a 1/5 em soluo salina, que deve resultar positivo, e diludo a 1/5 em "absorvente", que deve resultar
negativo. Incubar as lminas em cmara mida a 37'1C por 30 minutos. Lavar em P8S corrente por 5 segun-
oos, imergir em cubas com PBS por 5 minutos, duas vezes, escorrer e secar com jato de ar quente ou entre
folhas de papel de filtro, delicadamente, sem atrito.
Adicionar a cada rea, uma gota de conjugado diludo, segundo o ttulo. em PBS-Tween 80 com azul de
Evans a 1mg% (diluir a soluo estoque de azul de Evans a 1:10 em PBS-Tween 80). Incubar novamente por
3) minutos a 379C, lavar as lminas em P8S como acima e, em seguida, rapidamente, em gua destilada.
A diluio de uso do conjugado deve ser determinada no prprio laboratrio e para cada tipo de teste
em que for utilizado. Para esse fim, titula-se um soro reagente com diluies crescentes do conjugado (litu-
lao em 81000 00 chess-titration). OCOlTer que, para as maiores concentraes do conjugado sero 0b-
servados titulos constantes para o soro, mas que a partir de certa diluio em diante, sero progressivamente
menores. A diluio de uso do conjugado dever estar na zona de reatividade mxima, que fornece os titulos
mais altos do soro, imediatamente antenor diluio que pl"ecede a queda de ttulos.
No exemplo da figura 1, observa-se realividade mxima at a diluio de 1:200 do conjugado, reoomen-
dando-se utilizar nos testes a dilUIo de 1:100. EeVidente que nessa diluio no dever haver qualquer c0-
lorao nas reaes controle. como soro no reagente ou apenas com o diluente, observandcrse reao de
(1 +) com o soro controle de reatividade mnima.
Leitura dos testes:
Os preparados devem ser examinados sob luz branca, em campo escuro, para confirmao da presena
de treponemas, e em seguida por fluorescncia Para os soros reagentes, atribuem-se valores de (1 +) a (4+)
reao, segundo a intensidade da colorao, tendcrse como referncia as reaes de um soro rontrole for-
temente reagente (4+) e do soro controle de reabvidade mnima (1 +). Reaes duvidosas (), de trepone-
mas no limiar da viSibilidade, de colorao mUlto discreta e sem brilho, ou negativas (O), em que os trepone-
17
Tnulodo soro
1.600
800
400
200
100
25
50
100 200 400 800
DiluiO do
conjugado
Fig. 1 - Titulao do CooJugado
mas no so visualizados fluorescncia embora observados ao exame de campo escuro, correspondem a
soros no reagentes. Testes com (1 +) ou devem ser repetidos em nova amostra de soro, para confir-
mao do resultado.
Expresso dos resultados do teste FTAABS
Leitura
4+
3+
2+
1+
<1+
O
Intensidade de fluorescncia
Muito intensa
Intensa
Moderada
Equivalente ao oontrole de reatividade mnima
Colorao no limiar de visibilidade
Ausente
Resultado
Reagente
Realividade mnima
No reagente
2.22. Teste de microemaglutinao (MHATP)
Em placas plsticas de microtitulao, diluies de soros previamente tratados com reagente absorven-
te para remover reaes inespecficas, so incubadas oom suspenso de hemcias recobertas com antgenos
do T. pallidum Para os soros reagentes observa-se aglutinao das hemcias, que fonnam um tapete nas
paredes das cavidades da placa Para os soros no reagentes as hemcias no se aglutinam e depositam-se
oomo um boto no fundo das cavidades.
Dois tipos de reagentes so mais oomuns. O teste (Ames Division, Mi
les Laboratories, Inc., USA) utiliza hemcias de carneiro em suspenso liofilizada e placas com cavidades de
fundo redondo. O teste "Hemapalhdum- (Biolab Diagnstica S/A, Brasil), emprega hemcias de aves em
18
suspenso lquida e placas com cavidades cnicas. A execuo. leitura e interpretao dos testes devem
obedecer rigorosamente s instrues oos fabricantes. Contanoo com reagentes j padroniza:1os na ongem,
o teste MHATP no solicita os cuidados de padronizao que o teste FTA-ABS exige em cooa laboratrio e
assIm est menos sujeito a variaes Inter-Iaboratrios.
2.3. Interpretao dos testes sorolgicos
Os testes de cardiolipina tm elevada sensibilidade, de cerca de 70 a 80% na sfilis primria e pratica-
mente total nas sfilis secundria e latente recente. J na sfilis tardia, sintomtica ou no. a sensibilidade fi-
ca em torno de 70%. Alm das vantagens de fcil execuo e baixo custo. os testes de cardiolipina permitem
o acompanhamento da teraputica, atravs das variaes de ttulos e mesmo negativao. Entretanto, estes
testes esto sujeitos a resultados positivos falsos, as chamadas reaes biolgicas, observa-
das em vrias patologias em porcentagens que variam de 3 a 40% ou mais. Desse modo, com freqncia
seus resultados positivos precisam ser confirmados pelos testes treponmicos, cuja especificidade da or-
dem de 99%. Os testes de cardiolipina so, pois, considerados como de primeira linha na sorologia da sfilis,
enquanto que os testes treponmicos. de maior custo e complexidade. devem ser utilizados somente como
testes confirmatrios de testes lipidicos positivos. Outra eventualidade para seu uso nos casos clinicamen-
te de sfilis tardia com testes de cardiolipina negativos, fase da doena em que os testes trepon-
micos mostram sensibilidade de 98% ou mais.
Desde que os anticorpos treponmicos tendem a permanecer mais longamente do que os antIcorpos
lipdicos e quando respondem teraputica o fazem muito lentamente, no h interesse em sua titulao.
Assim, somente realizam-se testes treponmicos qualitativos.
O quadro 1 indica as interpretaes possiveis dos resultados de testes sorolgicos para a sfilis.
necessrio ter em mente que os resultados dos testes sorolgicos fornecem resultados de probabili-
dade que juntamente com os dados clinicos iro contribuir para o diagnstico. Tambm, os testes atuais no
permitem distinguir entre sfilis ativa (tratada ou no) e sfilis inativa (adequadamente tratada).
QUADRO 1
SFILIS -INTERPRETAO DE RESULTADOS SOROLGICOS
De Cardiolipina
Reagente
Reagente
No reagente
No reagente
Testes
Treponmicos
Reagente
No reagente
Reagente
No reagente
19
Concluso
Sfilis
Teste biolgico
Sfilis primria
Sfilis tardia
Sfilis tratada
Teste (prozona)
Teste falSQi>OSitivo
Ausncia de sfilis
Sifilis pr-sorolgica
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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5. LARSEN, S.A.; BeckSague, C.M. - Syphilis in MLaboralory Diagnosis of Infections Disease,
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8. CAMARGO, M.E. - Asfilis avana. Progride o diagnstioo? Rev, Ass. Med. Brasil, 34: 19-23, 1988.
20
MDULO II
DIAGNSTICO LABORATORIAL DA G N O R R ~ I
21
GONORRIA
Doera de transmlssiCl sexual causada pela bactria Neisseria gonorrhoeae, epidmica. incidncia
elevada entre adolescentes e adultos jovens. Apesar de ser uma doena infecciosa pnmariamente do trato
lX'Og8Oital, pode 8vauir piYa ccmpIicaes tais corro sapingites. bartolinites, epKlfdimites. abcessos parill&-
trais e disseminar sob a fama de a1rites. leses OJtneas e septicemia. A N. gonorrhoeae pode ainda in-
lectar as mucosas anal, do orofaringe e da oonjuntiva
23
MDULO II
DIAGNSTICO LABORATORIAL DA GONORRIA
1. COLHEITA DA AMOSTRA CLNICA
o diagnstico laboratorial da gonorria, depende da demonstrao de diplOCOC:OS Gram-negalivos em
esfregaos CO(ados e da identificao da N. Gonorrhoeae em meios de cultura especificos.
A eficcia do diagnstico depende de como a amostra foi colhida, preservada, transportada e se-
meada
1.1. Colheita de amostra na mulher
1.1.1. Canal endocervical ( o melhor local para colheita):
a) Introduzir o espculo vaginal esterilizado, umedecido com gua; no usar lubrificantes porque estes
inibem o crescimento dos gonococos;
b) remover o muco cervical com algodo esterilizado, sustentando-o com uma pina;
c) introduzir o s w b ~ (zaragataa) esterilizado no canal endocervicaJ; girar delicadamente, aguardar 10 a
30 segundos e retirar;
d) semear a amostra em meio de cultura (tipo Thayer Martin), ou conlonTl8 o caso, acondicionar em
meio de transporte (tipo Amies);
e) repelir o procedimento com novo "swab" (zaragatoa) e fazer dois esfregaos em lminas j)feviamen-
te limpas e identificadas.
1.1.2. Canal anal
a) Introduzir o ~ s w b (zaragatoa) esterilizado no canal anal;
b) girar o s w b ~ (zaragatoa) de um lado para outro, deixando 10 a 30 segundos nessa regio;
c) fazer como na letra d do item 1.1.1;
d) repetir o procedimento caso O"swab
M
(zaragatoa) toque nas fezes.
1.1.3. Canal uretral (a cultura Indicada em casos sugestivos de urelrite elou em pacientes adultas
sem endocrvice, submetidas histerectomia).
a) comprimir a uretra, pressionando oom o dedo mdio atravs da parede vaginal, de modo a expulsar
a seaeo das glndulas para-uretrais.
Usar "swab" (zaragatoa) esterilizado para obter a amostra.
b) proceder como no item 1.1.1, letras d e e.
1.1.4. Canal vaginal (a cultura indicada para crianas quando se torna Impossvel a obteno de
amostra do endocrvice).
a) introduzir o Mswab" (zaragatoa) na vagina, girar delicadamente, deixando nessa regio durante 10 a
30 segundos, retirando em seguida;
b) proceder como no item 1.1.1, letras d e e.
25
1.1.5. Orofaringe (a cultura recomendada quando h suspeita de infeco gonoccica disseminada
e em indivduos que praticam o sexo oral).
a) aplicar o (zaragatoa) na farll'lge posterior e nas cnptas tonsllares;
b) proceder como no item 1.1.1, letra d
1.2. Colheita de amostra no homem
1.2.1. Canal uretral
a) realizar uma anti-sepsia de glande e meato uretral extemo com auxilio de gaze esterilizada umede-
cida em soluo fisiolgica esterilizada;
b) introduzir o (zaragatoa) na uretra cerca de 1 a 2cm, girando-o delicadamente, retir-lo a se-
guir;
c) preparar dois esfregaos, identificando-os cOfretamente;
d) colher amostra para cultura, conforme O item 1.1.1, letra d, caso haja suspeita clnica de resistncia
a antibiticos.
Obs.: Havendo dificuldades de se recuperar a N. gonorrhoeae das amostras citadas, utilizar uma ou mais
das seguintes alternativas para cultura e bacterioscopia:
- sedimento do primeiro jato da primeira urina da manh;
- secreo uretra! obtida introduzindo "swab" 1-2cm na uretra, girando-o de um lado para outro.
2. EXAME BACTERIOSCPICO DIRETO
o exame bacteriosc6pico direto feito da amostra clnica recm-colhida do paciente. um exame pre-
suntivo, mas que pode ter valor de diagnstico em uretrites gonoccicas, sobretudo a masculina; ern todas as
demais manifestaes da gonorria faz-se necessrio o exame compf"Obatfio da cultura.
2.1. Preparo do Esfregao
A lmina de vidro para microscopia deve estar limpa, desengc>fdll'ada sem arranhes e previamente
identificada:
realizar o esfregao da secreo, cuidando-se para obedecer as margens da lmina (figura 5);
fazer um esfregao homogneo no denso, girando o "swab" (zaragatoa) delicadamente sobre a su-
perficie central da lmina (figura 5);
deixar secar temperatura ambiente;
passar a lmina trs vezes sobre a chama do bico de 8unsen, para lix-lo, no permitindo que a l-
mina aquea excessivamente.
Figura 5
Preparo do Eslregao

____/l/.-IL..----'-:argL da
=====!II Lm,,"
26
22 CoIOfao pelo mtodo de Gram (Anexo I: Prepa'"o dos Reagentes):
cobnr o esfregao com aistal por 1 mil"lJto;
lavar em gua corrente;
colocar a soluo de lugol por 1 miruto;
lavar em gua corrente;
descorar com lcool- acetona 1:1;
lavar em gua corrente;
cobnr o esfregao com soluo de fuccjna 1: 1Odurante 30 segundos;
lavar rapidamente em gua corrente. Deixar secar temperatlJa ambiente.
2.3. leitura das lminas:
examinar o esfregao ps colOl'ao de Gram, utilizando a objetiva de Imerso(alm8nto de 100 x) do
mittoscpio;
observar vrios campos mlCfoscplros, para se ter uma \I1so global da amostra;
anotar em livro de regIStro apropriado as estruturas morfolintonaJS observadas (micmorganismos e
clulas), quantlllC8tldo-as;
liberar os laudos, conforme onentao assinalada no item 6, deste Manual.
3. SEMEADURA DA AMOSTRA CLNICA
3.1. Meios de cultura comumente usados:
Thayer-MartlO mOOificado (Anexo 02);
Martin-LewIs.
As placas de Petri (80 x 15mm), contendo meio de cultura, devem ser guardadas 4
9
C (refrigerador)
sempre protegidas em saco plstICO. Elas devem ser colocadas com a tampa da placa voltada para baixo e
devem ser usadas antes da data de expirao.
Antes da Incubao das amostras, as placas devem estar temperaI... arrb4enle (22-259(;).
32. Tcnica de Semeadura:
girar o (zaragatoa) na superfCie do meio em forma de Z (figura 01);
usar uma ala bacteriolgica de platina, espalhar o material semeado na placa. fazendo estrias pr6xt-
mas umas das outras (fig.xa 2).
3.3. Incubao das Placas:
colocar as placas, com as tampas para baixo, em cmera mida de mlCt'Oaerofilia (5 a 10% de CO.t)
ou em -jarra da vela-. Utilizando a -jarra da vela- fechar a lata hennetlCllT'ler'lte, contendo no seu in-
terIOr uma vela acesa e uma chumao de algodo embeb+do em gua (figura 3).
27

,o'::' '.:;:. ..'
Incubar as placas na estufa a 35-369C, durante 24 a 48 horas.
4. IDENTIFICAO PRESUNTlVA
Examinar o aspecto morfolgico das colnias;
No isolamento recente, as colnias de gonococos geralmente so brilhantes. mueides, acinzenta-
dos, de tamanho varivel;
Realizar o teste de cilocrol'Tl(H)xidase (anexo 03);
"pescar" uma colnia, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram;
o resultado presuntivo, informar que a bactria isolada pertence ao gnero Neisseria. se o teste de
oxidase for positivo e a bacterioscopia revelar presena de cocos Gramnegalivos na CU1t1l'8.
5. IDENTIFICAO DEFINITIVA
Dividir uma placa de Thayer Martin em quatro quadrantes. Repicar em cada quadrante, uma colnia
da Neisseria isolada para o resultado presuntivo (figura 04);
incubar por 24 a 48 horas. a temperatura de 35 a 3G9C;
fazer esfregao do material de cada quadrante e corar pelo mtoclo de Gram;
na leitura da bacterioscopia ps colorao de Gram, verificar se a cultlJ'a est pISa, pela presena
exclusiva de cocos Gram-negativos;
realizar o teste de metabohzao de carboldratos (anexo 04);
28
Figura 4
Repicagem na placa dividida em quadrantes
Oresultado definitivo informar que a bactria isolada. no meio de Thayer Martin, a Neisseria go-
normoeae. porque metabalizou apenas o carboidrato glicose.
6. LIBERAO DOS LAUDOS
6.1. Bacterioscopia
6.1.1. Resultado negativo
Informar o seguinte: "No foram encontraoos diplcx:ocos Gram-negativos ao exame bacterioscpico ps
colorao de Gram.
6.1.2. Resultado positivo
No resultado positivo importante informar a quantidade de diplococos Gram-negativos e o nmero de
lelK:Citos polimorfonucleares por campo. Assim: MPresena de numerosos (ou vrios, ou alguns, ou raros) di
p10c:0c0s Gramnegalivos intracelulares (eJou extracelulares). Polimorfonucleares acima de 30 por campo (ou:
entre 20-25 pie; entre 15 a 20 pie; entre 10 a 15 plc; entre 5 a 10 pie e abaixo de 05 por campo)".
Poder-se- liberar um laudo mais detalhado relatando a visualizao de outras formas microbianas, c0-
mo: cocos Gram-posilivos, Bacilos Gramnegativos, Bacilos Gram-positivos, estruturas leveduriformes, etc.
6.2. Cultura
6.2.1. Resultado negativo
Dizer que no houve crescimento de Neisseria gonorrhoeae em meio de T. Martin aps 48 horas de
obse<vao.
622. Resultado positivo
Carimbar o laudo, assim: Crescimento de Neisseria gonorrhoeae.
7. PESQUISA DE N. Gonorrhoeae RESISTENTE A ANTIBiTICOS BETA-lACTMICOS
Vrios testes laboratoriais para deteco de N. gonorrhoeae resistente penicilina e seus anlogos,
tm sido empregados em exames de rotina Os testes acidomtrico, iodomtrico e da cefalosporina cro-
mognica so especficos para a deteco da enzima Beta-Iaetamase. O teste da difuso em gar, utililizan
do-se discos de antibiticos em coocentra8S padronizadas (Mtodos de KirbyBauer) pode revelar r&
29
sistncia bacteriana a antibiticos, o que correlaciona-se com a presena da Betalactamase no microorga-
nismo testado (Haemophylus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus), entretanto,
este teste dever ser confirmado atravs de um dos trs mtodos para a pesquisa da enzima Beta-lactama-
se.
Esta pesquisa dever ser feita a partir de cultura pura e jamais diretamente das secrees.
labofatrio dever possuir cepas controles. positivas e negativas, que devero ser testadas juntamen-
te com as cepas dos pacientes em estudo.
7.1 Teste lodomtrico rpido
Penicilina Sdica ou Penicilina G Potssica
Adicione Penicilina sdica ou Penicilina Gpotssica em p a um tampo fosfato recente para obter s0-
luo com concentrao final de 6.000 UVml. Pequenas pores desta soluo podem ser distribudas em
pequenos tubos e guardadas na temperatura de "209C. No utilizar oongeladores "frost-free". Pequenas
pores podem ser descongeladas e usadas pelo perodo de uma semana
Tampo de Fosfato pH 6.0
SOluo A: KH,PO .

Agua destilada
Soluo B: Na
2
HP0
4

gua destilada
0,9079
100ml
O,946g
100ml
Misture 87,7ml da Soluo A e 12,3ml da Soluo B. Esta soluo estvel por vrias semanas tem-
peratura ambiente.
Soluo de Penicilina
Penicilina (p) ..............................
Tampo fosfato .
O,5g
83,OmI
Concentrao de 6.000u/ml. Esterilize a soluo de penicilina atravs do filtro O,22-u ou 0,45u.
Soluo do amido
Amido ........................................
gua destilada esterilizada ...........................
1,09
1oo.0m1
Misture o amido com gua destilada e ooloque em banho maria at o amido se dissolver. Guarde no re-
frigerado< !lO< at 02 dias.
SoluAo de lodo
lodo ...........................................
Iodeto de potssio ..............................
gua destilada esterilizada .
2,039
532
9
1oo.0m1
Dissolva os. ingredientes em gua destilada. Annazene em garrafas escuras. Prepare soluo nova se
oouver prec1pllaAo.
30
Teste
1. Dispense 0,1 mi da soluo de penicilina em um tubo pequeno ou
2. Remova as cok;rllas puras do microorganlsmo e faa uma suspenso na soluo de penicilina MIs-
ture por 30 segundos e deixe a mIstura permanecer IX!"" 1 hora em temperatura ambiente a fim de
que a Beta-Iactamase quebre o anel Beta-lactmlCO. O H. influenzae e a N. gonorrhoeae nor-
malmente no requerem 1 hora de incubao, mas os estafllococos requerem.
3. Achctone 3 gotas da soluo de amido, suspenso e misture bem.
4. AdICione 1 gota do iodo oom pipeta PasteLr. A soluo ri se tomar escura devido a reao do iodo
oom o armdo. Caso o lOdo seja adicionado prematuramente a reao enzimtica pode parar gerando
resultado falso-negatlVO.
5. AgIte a mistura IX!"" 1 minuto. A desco6orao rpida Indica pnxkJo de B-lactamase. Se a soluo
permanecer escura. o teste negativo.
6. Faa o teste usand:> o positIVO e negativo.
Vantagens:
resultado rpido;
reagentes disponveIS e baratos;
fcil de fazer.
culh...-a OliglnaJ pode ser usada caso haja oolnlas Isoladas de N. gonorrtloeae;
fcil de ler.
Desvantagens:
mUitas lases;
reagentes instveis;
no pode testar secreo uretral, vaginal e cervical diretamente.
7.2. Teste acidomtrico rpido
1. Prepare soluo de vermelho de fenol a 0,5%. Dissolva 1.0g de vermelho de fenol em 3Om1 de
NaOH1Nq.s.p. para 200ml rom gua destilada
2. Adicione 2.0ml da soluo vermelho de fenol em 16.6ml de gua destilada esterilizada.
3. Coloque esta soluo em um frasco contendo 20 milhes de unidades de penicilina G potssica
necessrio tamponar; muitas preparaes contm tampo citrato, o que adequado para o teste.
4. Adicione NaOH gota aps gota at que pH seja 8.5. A soluo se tomar vermelha escura.
5. Dividir a soluo em aliquotas pequenas, congele a -2Q9C.
Teste
1. Coloque O,SrnI para 0,1ml do substrato de penicilina em um tubo pequeno. Remova vrias colnias
oom a aJa e faa uma soluo turva no substrato.
2. se a cultura produzir Beta-Iactamase a soluo se tomar amarela A mudana da cor ooorrer em 1
mmuto.
3. Faa o teste usando lMT1 controle positivo e um controle negativo.
Vantagens:
resultado rpido e possvel no mesmo dia se a culhxa estIVer pronta;
reagente disponvel e barato;
fcil de fazer;
somente uma lase;
31
reagente menos estvel do que o teste iodomtrico;
placas original podem SElf usadas caso haja colnias isoladas.
Desvantagens:
requer ajustamento correto do pH;
o ponto final algumas vezes difcil de definir.
7.3. Teste da Cefalosporina Cromognica
1. Dissolva 10mg da cefalosporina 87/312 em lml de dimetrylsulfoxido (DMSO). Oiluir com PBS (pH
7.0) a uma concentrao de 5OOgIml. A soluo estvel na temperatura de 4 - 109C durante vrias
semanas.
Prepare o PBS (pH 7.0) da seguinte maneira:
SOluo A: ~ P O ~ .
Agua destilada
Soluo B: Na,HPO. . .....
gua destilada
0,9079
looml
0.946g
looml
Misture 392ml da soluo A(fosfato monopotssico) com 6O,8ml da soluo B(fosfato dissdioo).
Teste
1. Coloque 0,05011 do substrato de cefalosporina em um tubo pequeno ou lITla microplaca.
2. Usando a ala bacteriolgica remova colnias do microorganismo a ser testado. Faa uma sus
penso densa na soluo de cefalosporina
3. Misture por 1 minuto. ObselVe se h mudana de cor aps 10 minutos, e aps 1 hora
4. O teste lX>Sitivo indicado pela mudana de COI" do substrato de amarelo para vennelho. Cepas de
N. gonorrhoeae e H. influenzae produtores de Betalaetamase, normalmente produziro mudana
de COI" em menos de 10 minutos.
5. Faa o teste com controles positivos e negativos.
Vantagens:
pode ser usado no trabalho de campo, simples, fcil de fazer;
reagentes so estveis;
resultados disponveis no mesmo dia da roltura;
o teste pode ser feito nas placas de agar.
Desvantagens
dificuldade para encontrar a cefalosporina cromognica.
8. ESTOCAGEM DE NElSSERIA GONORRHOEAE
Repicar a cultura pura obtida no meio de Thayer Martin Modificado (TMM) em placa de agar chocola
le;
Incubar por 24 horas, a 35 - 3G9C;
Fazer esfregao e Gram para confinnar a pureza da cultura;
32
a} Cultura padro:
semear a cultura padro no agar chocolate; incubar a 35 - 369C durante 16 - 20 horas em CO
2
;
preparar uma suspenso do crescimento bacteriano em 0,5mt de caldo trypticase e mistlJ'a- bem; adi-
cionar 0,2ml desta suspenso em 4,5ml do mesmo caldo. MIsturar bem para formar uma suspenso
homognea;
ajustar o aparelho para uma opacidade que cai entre 45% % 5% (transmisso de luz) em 530nm, ou
a equivalente ao n
9
2 da escala padro de McFarland;
preparar as diluies de cada cultura (45% 5%) da suspenso lestada
Preparar uma suspenso densa em quatro partes de caldo TSB e uma parte de glicerina, misture
bem. Distribua alquotas de 0,5 a 1mi em tubos apropriados para estocagem;
Congelar a -7Q9C;
Repica- as amostras estocadas aps 6 meses, em gar chocolate. No use o meio de TMM para rEr
cuperar amostras congeladas, mas gar chocolate enriquecido e sem inibicb"es.
9. CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO DE DST
9.1. Controle de qualidade do Mtodo de Gram
Microorganismos necessrios:
Neisseria gonorrhoeae;
Staphycoccus epidermidis.
Procedimento:
1. colocar uma gota de soluo fisiolgica na lmina;
2. retirar uma colnia suspeita de N. gonorrhoeae e fazer o esfregao;
3. repetir os itens 1 e 2, usando a colma suspeita de S. epidermidis;
4. corar os esfregaos pelo Gram;
5. observar no microscpio a morfologia e colorao:
N. gonorrhoeae = cocos Gram - negativos;
S. epidermidis =cocos Gram - positivos.
6. caso a colorao no seja especifica, verifique os reagentes e reavalie a tcnica de elaborao do
esfregao elou da colorao.
92. Conlrole de qualidade do meio de Thayer Martin Modificado (TMM)
Microorganismos necessrios:
Cepas-padro de Neisseria gonorrhoeae dependentes de CO
2
;
Neisseria meningitidis;
Proteus sp;
Escherichia o ~
Staphylococcus epidermidis;
Neisseria sicca;
Cndida albicans.
33
Meios de cultura utilizados:
Agar chocolate;
Thayer Martin Modificado;
Caldo TryptlCilS8 de Soja (TSB)
Procedimento:
determinar a DiluIo tlma do lnculo (001) para cada mtCfOOl'ganlsmo a ser lestado (o inculo de-
ver 50 a 100 cotnlas no gar chocolate, usando ala bacteool6goca de 3mm).
Exemplo:
TUBO
TSB SUSPENSO DA CULTURA DILUiO DO INOCUlUM
N'
1 4,5ml 0,5ml da suspenso a (45% :t 5%) 1:10
(1l),')
2 4,Sml 0,5ml do tubo 1 1:100 (10')
3 4,5m1 0,5ml do tubo 2 1:1000 (10')
4 4,5m1 O,5m1 do tubo 3 1:10.000
(10")
5 4,5ml O,5m1 do tubo 4 1:100.000 (10')
6 4,5m1 O,5m1 do tubo 5 1:1000.000 (10")
a) loocular as placas de gN chocolate usando uma ala de 3rnm pMa cada diluIo;
b) examinar as ptacas aps 16 - 20 horas. A diluIo de 1<t
3
00 1<t' satisfatria para grande parte
dos mK:roorganlsmos;
c) loocular a ptaca conlr06e do ooyo lote de T. Martin Moclificado com uma ala bactenolgca de 3mm;
d) repeti" o pnx:edll1l8flto em ptacas de agar chocolate com as mesmas diluIeS para verihcar a viabt
hdade do metO;
e) Incubar em atmosfera de C0
2
, a 35-369C por 24 - 48 horas;
f) examinar as culturas, comparar o aescllnento, a inibIo do crescimento, a reao de oxlctase na
placa controle e nas outras placas, registrando lodos OS dados em fichas apropriadas;
g) se necessrio revisar os achados e determinar se o novo meio reune os cnlnos de aceitao.
Outros microorganismos
Para os demais microorganlsmos (Proteus sp, E. coli, S. epidermidis, N. sicca. C. albicans), basta
utlhzar a diluio 10.
3
00 10' (escala,,9 2 de McFarland); faa oomo est indicado nas lelras C, d, e, da cul
tura padro. Estes miaoorganlsmos devero ter aescimenlo inibido no meio de TMM.
92.1. Preparo da Escala Padro de McFarland
1. Coloque 10 tlb:ls em lJTl8 estante, marqu&OS de 1 alO.
2, AdIClOllO a segUinte quanUdado da soluo cloreto de bno (1%):
Tubo n
2
1
Tubo n
9
2
Tlbo n
9
3
Tubo n
9
4
Tubo n
9
5
TuIxl n
9
6
Tubo n
9
7
Tubo n
9
8
Tubo n' 9
Tubo n
9
10
34
O,lml
0,2rrj
O,3m1
0,4ml
O,5m1
O,6m!
O,7m!
O,6m1
O,Bml
l,OmI
3. Adicione em cada tubo quantidade suficiente de soluao de cido sulfrico (1%) at completar 10ml
de soluo.
4. Feche bem os tubos e com parafina
5. Quando o pr8CIpllado de "" branca (sulfato de bno) se forma" em cada tubo, a densidade deles
ser dJferente.
6. A densidade de cada tubo corresponde aproxImadamente ao S8Qlunte rnero de bactrias por mil:
N01
NO 2
NO 3
NO 4
NO 5
NO 6
NO 7
N' 8
NO 9
N9 10
JOO.lXXl
6OO.lXXl
9OO.lXXl
1200.lXXl
1.500.lXXl
1.800.lXXl
2.100.lXXl
2.400.lXXl
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.700.000
.. .. . .. .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . .. . .. .. 3.lXXl.OOO
Notas:
Quando a curva acnna for usada para comparar OU ajustar suspenso bacteriana em caldo, prepare s0-
luo de cido sulfunco a (1%) no mesmo caldo.
Os tubos devem ser do mesmo lamartD.
TESTE PARA CRESCIMENTO
ai Cultura padro
MEIO AMBIENTE NOVO MEIO
ORGANISMO CEPA NO 001 CO,
DEPEN
1. N. gorooIloeae
2. N. gorooIloeae
3. N. gorooIloeae
4. N. gorooIloeae
5.N.gonontloeae
6.N.gooorrhoeae
7. N. gonorrhoeae
8. N. menlngltidis
VIABlUDADE
AC 24hs 48hs 24hs 48hs
OXIlASE
TESTE PARA INIBiO DE SAPRFITAS
b) Outros microorganismos
MICROORGANISMO
CEPA
1. Proteus spp
2. E. coli
3. S. epidermidis
4. N. sicca
5. C. albicans
00
VIABlUDADE
AC
MEIO CONTROUE NOVO CONTROlE
Responsvel pelo lesle:
Data I I
35
9.3 Controle de qualidade dos Carboidratos
Mlcroorganlsmos necessrios:
Neisseria gonoohoeae;
Neisseria meningitidis;
Neisseria laetmica;
Neisseria sicca.
Procedimentos:
pl'"eparar 4 baterias contendo os seguintes acares: glicose, lactose, Ievulose (frutose), maltose e
sacarose;
semear em cada bateria uma das neissarias acima;
incubar a 3 5 3 ~ C pCN' 24 horas, sem tenso de CO
2
;
anotar a utilizao de acar em cada bateria resultado dever ser o seguinte:
- N. gonorrhoeae
- N. meningitidis
- N. lactmica
N. sicca
= glicose +
= glicose e maltose +
=glicose, maltose e lactose ou (ONPG) +
=glicose, levulose, maltose e sacrose +.
9.4. Controle de qualidade da prova de oxidase
MicrOCX'ganismos utilizados:
Neisseria sp;
Staphylococcus sp.
Aspecto do reagente:
Sem sinais visves de oxidao.
Procedimentos:
pingar uma gota do reagente de oxidase em duas tiras de papel de filtro;
em uma das tiras passar uma colnia de neisseria sp e, na outra, uma colnia de Staphylococcus
sp, com auxlio de uma ala de platina (no utilizar ala de niquel cromo ou similar);
o teste ser considerado satisfatrio se aparecer cor rosada na tira contendo Neisseria sp e ne-
nhuma alterao de cor na tira contendo Staphylococcus sp.
ANEXO I
REAGENTES PARA COLORAO DE GRAM
1. Soluo de CristalVioleta modificada por Hucker,
Soluo A:
Cristal Violeta 2,0g
lcool etlico PA 2Om1
36
Soluo B:
Oxalato de amnia O,Sg
gua deslllada BOmI
Aps 24 horas, misturar a soluo A com a soluo B. Estocar em garrafas de vidro de ror mbar.
2. Soluo de Lugol (soluo estoque).
lodo P.A......................................
Iodeto de potssio .
gua destilada .
1,09
2,09
200ml
Colocar O iodo e o Iodeto dentro de umgraal, adiCionar o lodo e triturar IX>'" 10-30 segundos. Adicionar
1mi de gua destilada, triturar, acrescentar mais 5ml de gua destilada, triturar, adicionar lOmI de gua destt-
lada e triturar. Colocar a soluo de todoIiodeto de potSSIO numa proveta e completar Ovolume para 200m!.
Guardar em frascos l"{lbar.
Para uso, dilUir a soluo estoque em 1:15 de gua destilada.
3. lcool - Acetona:
lcool etilico PA 250m!
Acetona P.A. ........................................ 250ml
Misturar e estocar em frasco de vidro.
ANEXO II
MEIO OE CULTURA DE THAYER MARTIN MODIFICADO (TMM)
Preparao (1 litro)
1. Preparar a soluo de hemoglobina a 2% da seguinte maneira; suspender 1Og de hemoglobina desidra-
tada em 500ml de gua destilada, misturar bem por 10 minutos. Filtrar a soluo de hemoglobina
atravs de gaze;
2. Pesar 36g do meio base para gonococo (GC) e 10g de gar pUrifiCado, misturar, suspender em 500m1 de
gua destilada. Levar ao banho-maria fervente para clarificao do agar;
3. Autoclavar a soluo de hemoglobina e o meio GC agar, em frascos separados, a 121
9
C, por 15 minu-
tos;
4. Esfriar o material a uma temperatura de 5S9C, mantendo-o em banho-maria regulado;
5. parte, reconstituir a soluo de antibiticos VCNT (Vancomicina, colistina, nistatina e lrimetropina) em
gua destilada esterilizada e deixar repousar durante 20 minutos;
6. ReconstitUir o suplemento VX com o liquido reldratante; agitar bem para se obter soluo homognea;
7. Assepticamente, adicionar 10ml dos antibiticos, 10ml do suplemento VX, 5ml de soluo de glicose a
2,5% esterilizada (por vapor fluente ou filtrao), ao meio base GC agar, misturando suavemente;
8. Acrescentar a soluo de hemoglobina no meio GC agar, delicadamente para se evitar formao de b0-
lhas. Homogeneizar. Medir o pH, que deve ser de 7,2 0,2;
9. Distribuir 15 a 20ml do meio TMM em placas de Petri;
10. Deixar as placas em temperatura ambiente por uma noite. Retirar uma amostragem de cada lote e incu-
bar em estufa a 23-2f1C e 35-JG9C por at uma semana;
11. Acondicionar as placas em sacos plsticos e estoc-Ias em refrigerador por at 3 semanas;
12. Preencher a Ficha de Controle de Qualidade do Meio de TMM e anotar os dados sobre o leste esterili-
dade e aparncia do meio. (ver abaixo).
37
Thayer Martin Modificado
NO do lote:
Dala do preparo
FICHA DE CONTROLE DE QUALIDADE
Data do teste
Data 00 resultado
INGREDIENTES
MARCA
GC-Base
gar
Hemoglobina
Suplemento VX
NO DO LOTE MARCA
VCN
DEXTROSE
NO DO LOTE
TESTE DE ESTERILIDADE
INCUBAO POR UMA SEMANA
pH a 56'C
23 - 27"C
C AC
(-): InadeqUada
35 - :J69C
C AC

HOMOGENEIDADE"
UMIDADE"
OUTROS
(ESPECIFICAR)
" (+): adequada
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( )

( ) ACEITVEL
( ) No ACEITVEL
DATA DE EXPEDIO
c = Crescimento; AC = Ausncia de crescimento
Nome da pessoa que realizou o teste
ANEXO III
TESTE DA ENZIMA CITOCROMO-OXIDASE
Os citOCfomos so hernoprotelnas que contm feITO e aluam corno o ltimo estgio da cadeia
ria aerbia, transferindo hidrognio (ellrons) ao oxignio, com loonao de gua. As Neisserias e as mui-
tas espcies de Pseudomonas so oxidase - positivas.
Aprova de citocromo-oxidase utiliza certos reatlvos que prodJzem cor e que aluam como receptores de
eltrons, substituindo o oXignIO. A parafenllechamma lrcolor no estado reduzido. mas em presena de CI-
i:X:rOrl"O-OXidase. oOXignio atmosfrico se oxida e oogina cor rosada
Reagente:
soluo de hldroclorelo de dlmetll-parafenodiamlna a I%. Esta soluo deve ser preparada mensal-
mente e conseMlda a 49(; (refl'igefa::klr) em frasco mbar.
Procedimentos: (tcnica indlreta)
pingar uma gota do reagente de atoct'OlTl()-()xidase em l.JTla tira de papel de filtro;
retirar uma colnia e espalhar na lira do papel de filtro;
a reao ,machala oom o Sllrglmento de colorao rosa no local onde se espalhou a col-
nia.
Obs.: utilizar ala de platina no teste.
38
Controles:
positivo: Pseudomonas aerurginosa
negativo: Escherichia coli.
ANEXO IV
METABOLlZAO OOS CARBOIORATOS
A N. gononfloeae uma bactria aerbia que realiza a gliclise atravs da via aerbia ou via metab-
lica de Entner-Douderoff, oxidando a glicose em 6 - fosfogluconato e 2 - ceto - 3 - desoxi - 6 - fosfogluco-
nato, at a formao de cido pirvico. uma reao produtora de energia (ATP) que requer oxignio mole-
cular como receptor final de hidrognlo (eltrons). Entre os carboidratos testados para identificao definitiva
das neisserias. a glicose nico metabalizado pela N. gononfloeae.
1. Preparo dos carboidratos
Em cinco bales numerados adicionar lOOml de gua destilada em 4,3g do meio base desi-
dratado CTA (Cystine trypticase Agar). Misturar e aquecer, at a dissoluo do agar (darifi-
cao), em banho-maria;
Adicionar em cada balo um tipo especfico de carboidrato a 1%: glicose, lactose, levulose.
maltose e sacarose;
Distribuir em tubos de rosca de 12 x 12Omm;
Esterilizar por filtrao ou vapor fluente (l()()9C, durante 30 minutos, em autoclave com a
vlvula aberta).
2. Inoculao dos carboidratos
1. Preparar uma bateria contendo os cinco tipos de acares (glicose, lactose, lewlo58, ~
tose e sacarose), identificando o exame;
2. Inocular uma colnia de Neisseria suspeita, certificando se proveniente de cultura pura;
3. A inoculao deve ser feita em profundidade, no mnimo lcm abaixo da superfcie do meio,
com auxlio de uma ala bacteriolgica;
4. Incubar temperatura de 35-J69C, por 24 e 48 horas. dispensvel a tenso de CC:;
5. Na metabolizao de carboidratos, haver produo de cidos que sero percebidos pela vi-
ralJem no indicador de vermelho para amarelo;
6. A prova ser considerada positiva para Neisseria gonorrhoeae se apenas a glicose for
metabolizada.
39
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. FRANCH1NI, M.: Procedimentos Laooratoriais no Controle das Doenas Sexualmente
Transmissveis (OSl). Braslia, Instituto de Sade do Distrito Federal, 1983, 1'9. 89.
2. JACOBS, N.F., KRAUS, S.J.: Gonococcal and nongonococcal urelhfitis in men: Clinical anel
laboratory Oiferentiation Ann Intem. Med., 82:7, 1975.
3. KONEMAN, e.v. et cels. Diagnstico Microbiolgico. Panamericana, Buenos Aires, Argentina, l'
00., 1983, p. 266267. 386-393.
4. PHILLlPS, /.: Beta Lactamase producing penicilin resistan: gonococcus. LanceI2:637, 1976.
5. SIMMOUS, P.D.: Evaluation of lhe carlr and first voided urine 5OOimen! in lhe diagnosis Df
urethritis. sexo Transm. Dis. 5:39. 1978.
6. U.S. Department of Health and Human Services. Public Hea"h Service. Centers for Disease
Control- Criteria aOO Techniques for the diagnoses of Gonormea 1983. 4 p.
7. U.S. Department Df Health aOO Human Services. Pubfic Health Service. Centers for Disease
Controf. Procedures for use by the /aboratory in the isofation and identification Neisseria
gonorrhoeaea. 1983, 38 p.
40
MDULO 111
DIAGNSTICO LABORATORIAL OE DOENAS DE
TRANSMISSO SEXUAL NO-GONOC6cICA
41
DIAGNSTICO LABORATORIAL DE DOENAS DE
TRANSMISSO SEXUAL NCl-GONOCCICA
Corriqueiramente, um servio laboratorial voltado para o diagnOstico de Doenas Sexualmente Trans-
missveis (05T) atende, essencialmente. os casos de gonorria e sfilis. No entanto, dentro de um contexto
de sade pblica, no se pode desprezar 00 passar para plano secundrio o diagnstico das demais OSlo
Estas Doenas Sexualmente Transmissiveis seriam aquelas responsveis por uretrites, vaginites, wl
\O-vaginites, cervicites, leses e ulceraes na genitria.
verdade que algumas destas doenas exigem tcnicas de diagnstico laboratorial sofisticadas e one-
rosas, tal como ocorre no linfoganuloma venreo. Vale a pena ressaltar, porm, que muitas delas, seno a
maioria, utilizam-se de recursos simples, senslveis e confiveis. o que ocorre, por exemplo, no uso de bac-
terioscopia fresco para sugerir uma candidiase ou trichomoniase. A to usual colorao segundo Gram, p0-
der nos orientar no diagnstico tanto de um cancro mote quanto numa vaginite por Gardnerella vaginalis.
O importante que busquemos implantar novas tcnicas de diagnstico ou aperfeioar as existentes,
lB'a que se possa, eletivamente, oontribuir para o oontrole das Doenas Sexualmente Transmisslveis, em
nosso Pafs.
43
1. CANCRO MOLE
o canao rroIe uma doena de transmisso sexual, cup agente etlolglco, o Haemophylus ducreyi
produz uma ulcerao dolorosa, sumamente contagIOSa, geralmente localizada na genltlia externa.
1.1. Colela da amostra clnica para bacterioscopia:
limpar a lcefa com soluo fisiolgica esterilizada;
colher matenal da regIo ulcerada com auxlIO de um swab- (zwagatoa).
realizar esfregaos (2 a 3), utilizando lminas limpas e secas;
secar temperatlM'a ambtente;
oorar pelo Mtodo de Gram.
1.2. Colela da amostra cllnica para cultura:
Utilizar amostra clnica colhida como paTa bactenoscopt8. semear em agar chocolate enriquecido com
os falOfBS V(NAO) e X (hermna) ou Agar de LevinthaJ e incubar por 24 a 48 horas a 359<:, em atmosfera de 5
a 10% de C0
2
(cmara de miaoaerofiha). A identificao da bactna se faz pela prova de requerimento de
falores (X OU V) e pela hemlise em agar sangue. A bactria pode crescer bem na gua de rondensao do
meIO de cultura
1.3. Liberao dos laudos:
1.3.1. Bacterioscopia:
A colorao pelo Gram poder revelar pl'esena da bactria nas leses ulceratlvas, quando se obserVar
diminutos bacilos Gram-negativos pieomorficos agrupados com freqncia no interiOf dos leuccitos polimcr-
fonucleares. Extracetulannente, o Heamophylus poder formar cadeias ou paliadas.
1.3.2. Cultura
o H. ducreyi utiliza o fatar Xe gook das cepas produzem hem6lise em gar sangue de ovin:>o
2. OONOVANOSE
uma Infeco usualmente transmltKia pelo oontato sexual. causada peta bactria Calymmatobacte-
rium granulomatis. uma doena de evoluo crmca e de buxa oontaglOSKiade; caracteriza-5e pela pre-
sena de ndlJlos StJx:utneos, ganuk>matosos, ulcerados, lndoklres 8 autCHncx:ulveIS; as les6es gerall'T'l8r'l-"
te so encontradas na genltJia. regto perianal e regIo IngUinal.
provvel que a donovanose possa ser transmhda na ausnaa de oontato sexual.
45
2.1. Diagnstico Laboratorial
2.1.1 Bipsia das leses:
Para exames hlstopatolgloos.
2.1.2. Esfregao das leses:
Corados pelo Glemsa ou Wright.
2.1.3. Cultura das leses ou do aspirado dos linfonodos:
o bacilo C. granulomatis de difcil cultivo. porm pod&se utilizar o metO de cultura descnto por
Dient e Brownell base de gemas de ovos frescos.
2.2. Liberao dos laudos
o corrum do diagnstico laboratorial da donovanose dado pelo resultado dos exames bacterioscpi-
ces (cortes histolgICOS e esfregaos corados), considerados posItIVOS QUando se visualiza cfulas mooonu-
deares endoteliais (macrfagos) contendo agrupamentos do bacilo, chamados corpsculos de Oonovan.
3_ VAGINITE POR Gardnerella vaginalis
A G. vaginalis um bacilo Gram-flegativo ou Gram-lbil, pleomr1ICO que normalmente pode sef en-
contrado na vagina da mulher adulta, mas que poder ser agente etIOlgICO de vaglnlles ou vaglllOseS. Ge-
f31mente, a G. vaginalis encontra-se associada a bactnas anaE!fblas. (Baeteroides. Mobiluncus ou cocos
anae<btos).
3.1. Diagnstico laboratorial
3.1.1. Teste do hidrxido de polssio:
Em uma lmina de vidro, pIngar uma ou duas gotas de secreo vaginal;
acrescentar uma ou duas gotas de KOH a 10%, misturar com ala bacteriolgica ou palito de madel'
ra;
sentir o odor peixe, que despreendido pela presena de aminas volteis metabollzadas pelas
bactnas anaerblas. Este cheiro caracterstico d como POSItiVO o teste para Gardnerella
3.12. Teste do pH:
A secreo vaginal mostrar uma acidez em tomo de 4,5.
3.1.3. Bacterioscopia do esfregao de secreo vaginal:
Cora' o esfregao pelo Mtodo de Gram;
Observar a presena de clulas-guia ou clulas-ehave (clue cells): clulas epitehals robertas por
diminutos bacilos Gram-negativos (ou Gram-lbeis);
Observar a ausncia ou reduo dos lactobacilos.
3.1.4. Cultura de secreo vaginal:
Utiliza-se l'lleK) de cultura seletivo para G. vaginalis como o descnto por Greeowood e colaboradores,
constltuOO de lXJl8 base (aga' ColurrtMa) acresoda de peptona rnefO 3 a 1% de sargue humano a
46
5%, alm de uma soluo de citrato-fosfato-gtioose. A G. vaginalis produz hem6lise Beta
Para Identificar a bactria. utiliza-se provas bioqumicas complementares como o teste da oxidase, ca-
talase, mobilidade, nitrato e metabolizao de carboidratos, entre outros.
3.2. Liberao dos laudos
Em laboratrios de sade pblica, o oomum utilizar o resultado da bacterioscopia (j)(esena de olu-
las-<:have com reduo ou ausncia de lactobacilos), associado ao resultado positivo do teste de KOH e me--
dio do pH em tomo de 4.5, para estabelecer o diagnstico presuntivo deste tipo de vaginite. A identificao
definitiva da G. vaginalis dada pelo crescimento em meio seletivo e pelas provas t)joquimicas comple--
mentares.
4. TAICOMONASE
Doera causada pelo protozorio Trichomonas vaginalis na regio ul'OiJ8nital feminina e masculina
uma vulvovaginite muito comum em mulheres adultas.
4.1. Diagnstico laboratorial
4.1.1. Teste do pH vaginal:
Geralmente o pH vaginal estar acima de 5,0. Para fazer o teste, basta oolher uma gota de secreo
vaginal e coloc-Ia numa tira de papel universal de medio de pH.
4.1.2. Exame direto a fresco:
Duas a trs gotas de secreo vaginal ou uretral horrogeneizada em 0,1 a 0,2ml de soluo fisiolgica.
Colocar uma gota da mistura numa lmina, oobrir com lamnula e observar ao microscpio em objetiva de
10x e 4Ox.
4.1.3. Exame citolgico (Papanioorau)
Realizado da secreo vaginal.
4.1.4. Cultura de secreo vaginal, uretral ou prosttica
Em servio pblico no se justifica muito o cultivo de T. vaginal is, uma vez que onera e atrasa os re-
sultados laboratoriais. Um dos meios de cultivo indicado o de Lash ou o de Feinberg, base de hiolizado
de caselna enriquecido com soro.
4.2. Liberao dos laudos
Secreo vaginal ou uretral com pH acima de 5,0, associada presena de trichomonas mveis no
exame direto fresco eloo presena de trichomonas coradas pelo Papanicolau, estabelece o diagnstico la-
bJratorial da trichomonlase.
5. CANDIDASE
Vulvovaginite muito oomum, sobretudo em mulheres grvidas, causada por uma levedura: Cndida ai-
bicans. A candidase pode QCOfTer por transmisso sexual, por contaminao a partir do sistema gastrointes-
tinal onde habitualmente encontrada a levedura.
47
5.1. Diagnstico laboratorial
5.1 1 Esfregao da secreo vaginal.
Que dever ser corado pelo Mtodo de Gram ou pelo Mtodo de G.emsa.
5.1.2. Bacterioscopia direta fresco:.
DIlUIr uma gola da secreo vaginal em uma gota de soluo fiSIOlgICa ou KQH a lMo. Cobrir com
laminula e observar ao mlCf'OSCPlO 00 aLmento de 4Ox.
5.1.3. Cultura e identificao da espcie:
Q meio mais sImples para crescimento de leveduras o Sabouraud. A identificao pode ser feita pela
loonao do tubo germinativo e provas complementares, como a de fennenlao e assimilao de carboidra-
tos e a produo de clamidosporos em gar farinha de milho (Iub).
5.2. liberao dos laudos
A presena de leveduras, fortemente coradas pelo Gram (Gram-positivos) 00 esfregao vaginal, ou a
observao de estruturas leveduriformes no exame microscpico fresco, bastante sugestivo de
candidase
Na impossibilidade do labortono posSUIr recursos para realIZao de provas complementares maiS apu-
radas, que IdentIficaro a C. albicans e grande vanedade de leveduras, recomenda-se a seguinte prova para
observao do tubo gemllnatlvo:
retirar uma poro de l.rTla colma Isolada de levedura, utilIZando ala bactenolglCa;
suspender em 0,5011 de soro humano ou de coelho, em tubo de ensaKl. Homogeneizar;
Incubar o tubo a 379C por 3 horas, no mximo;
retirar uma gota da suspenso levedura - soro e coloc-Ia sobre uma lmina limpa Cobnr com Iami
nula;
observar ao microscpIO (aumento de 4Ox) a presena de tubo germinativo caracterstico de C. albi-
canSo
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. FILHO, Jos Trindade Donovanose ln' Doenas Sexualmente Transmissveis, 2
1
ed Editora
Cuhura Mdica, RIO de Janeiro, 1987, p 85-90,
2 FINEGOLD, M S & BARONI, E.t Geros calymmatobaclerlJm ln: lJiagnostic MlCroOOlogy, Seventh
edltion, Bay1ey aOO Scott's, Unitoo States of Amarica. 1982, p. 565-566,
3 Genital aOO sexually transmitted palhogens, p. 295-296
4 KONEMAN, EW ,ALLEN, S D , DOWELL; UR &SOMMERS, H M Haemophylus ln Diagnstico
Microbiolgico, Panamericana, Buenos Aires, Argenllna, 1
1
00. 1983. P 250-251
5 Identificaan de las Jevaduras, p 455.
4B
6. DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS DST CAUSADAS POR Chl.mydi.lr.cham.li.
As clamdias, atualmente. CllSSlficadas como bactrias, sao parasitas obfigalnos de ctulas eucaritl
6
cas(5). Nilo possuIndo certos composlOS envolvIdos na produo de energIa, dependem do aparato energll-
00 da clula hospedeira para o desenvolvimento do seu ctclo biolgICO.
Podemos identificar duas formas distintas nesse Ciclo: o corpsculo elementar (CE) e o corpsculo reti-
cular (CR). O CE, com 0,3.,. de dlametro, a forma infectante e que resiste ao meio extracelular. Ao penetrar
na clula, ele se diferencia em CA (11L de dimetro), que a forma replicativa e metabolicamente ativa Ao
se dividir o CR d origem a outros corpsculos reticulares que posteriormente se diferenciaro em corpscu-
los elementares. O CA a forma estritamente intracelular e nao infectante. As incluses inlracitoplasmticas
correspondem aos conjuntos de partculas do ciclo biolgico da clamdia(7).
Diferentes sorotipos de Chlamydia trachomalis esto relacionados com o linlogranuloma venreo e
outras afeces genilCHJnnnas e oculares, sendo os agentes mais importantes na ellologia das uretrites no
plOCCicas no homem(6). Na mulher, esto relacionados pnncipalmente s cervicites(3), endometriles,
doena Inflamatria plvica e suas complicaes. Na gravidez, as infeces por c1amdia podem c0mprome-
ter a Integridade do concepto, causando conjuntivite de Incluso, pneumonia e outras Infeces do trato res-
plratno( 1).
Isolamento e Cultura
Pelas suas exigncias energhcas, as c1amdlas no podem ser Q.Jlllvadas em meios artlfici8ls, sendo
Impresclndivel a UllllZao de SiStemas VIVOS, tais como linhagens continuas de clulas.
A tcmca de isolamento e Q.lItura o teste mais sensivel e especfico pata o dlagnstl(X) das Infeces
por Chlamydia exigIndo uma infra-estrutura laboratorial para o cultivo de clulas. por is-
so que os laboratrios de virologla tm, em geral, melhores condies de realizar esta tcnica do que os la-
boratnos de bacteriologia.
Desde a colheita do matenal clinico com de aluminio com ponta de algOOo, at a inoculao
em monocamadas de clulas McCoy tralados com 5-lado 2jeoxluridlna, CUidados devem ser tomados para
que o matenal colhido e passado para o meio de transporte (meio mnimo de Eagle modificado, com soro fe-
tal bovino 5-10%, gentamicina 2O,...glml, vancomicina 10....glml e fungizona 2,5,...gJml) seja acondicionado em
gelo e que no ultrapassem 12 horas entre a colheita e a Inoculao. Para armazenar as amostras, na im-
possibilidade de inocul-Ias Imediatamente, necessriO mant&las rongeladas a -7rfJC.
DepoIS de Inoculadas com o matenal clnico, as mooocamadas so centnfugadas por 1 hora a 2.000+g,
a temperatura ambiente.
a Incubao a 379C por 48 horas. as monocamadas so fixadas pelo metanol por 10 minutos e
podem ser coradas pelo Glemsa, iodo ou por corantes lmunofluorescentes (conJugados), para a pesqUisa das
ncIUSEIS que C01'espondem a ooI6n!as Intracltoplasmhcas de C. trachomatls.
Os preparados corados pelo GtemS3, quando examInados em moaoscpto de campo escuo perrmlem
identificar as incluses como estruturas alaranjadas ou amarelas brilhantes num fundo azulado.
Pela colorao com o iodo (lugof), as incluses contendo gllcognKJ se coram de castanho esaxo, c0n-
tra um fundo amarelo. sendo examinadas em miaoscplO comum de campo claro.
Na tcnica de llnunolluorescncia indireta os preparados so incubados em cmara mlda com um soro
<I"ltH:lamidla, por 30 minutos a 379C, depois lavados com PBS, Incubados (30 mln/379C) com um conjugado
antl-Imunoglobulinas espcie-especfico, diludo em azul de Evans; aps serem lavados novamente com o
PBS, os preparados so montados com glicenna tamponada (pH 9,6) e examinados em microscpio de fluo-
rescncia. As incluses aparecero como massas justanucleares fluorescentes, amarelo-esverdeadas, contra
um fundo escuro ou avennelhado.
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Sorologia
Os testes sorolgicos paTa o diagnstico das infeces por clamidia tm valor limitado. Os anticorpos
sricos persistem por longos perodos e a deteco de antiCOfPOS numa nica amostra de soro de um pacien-
te pode indicar apenas exposio prvia ao microorganismo. Soros pareados so difceis de se obter, porque
as infeces podem ser, freqentemente, assintomticas ou ter um longo perodo de incubao. Populaes
de alto risco tm altos ndices de cicatriz sorolgica e nas cHnicas de DST so detectados antiCOfPOS em cer-
ca de 25% dos homens e 6(}70% das mulheres, dos quais no havia sido isolada a clamdia(2).
O teste sorolgico mais utilizado a imunofluorescncia indireta Este teste tem maior valor para estu-
dos soroepidemiolgicos.
Exames diretos do material clfnico
O exame direto de raspados de conjuntiva para a identificao das incluses de clamfdia um mtodo
to sensvel quanto o isolamento, para o diagnstico das infeces oculares no recm-nascido.
O exame direto do material genital para o diagnstico das infeces por clamdia tem valor limitado(2).
Para o exame direlo preparada uma lmina do material clnico que pode ser corada e examinada mi-
aoscopicamente paTa a pesquisa das incluses. As coloraes mais amplamente usadas so a de Giemsa e
a imunofluorescncia Entretanto, estas tcnicas variam em sensibilidade e aplicabilidade, devendo ser utili-
zadas com extremo cuidado.
O exame citopatolgico de esfregaos acto e endocervicais corados pelo mtodo de Papanicolau tem
sido utilizado para o diagnstico das cervicites por C. trachomatis. A tcnica pouco sensvel, devendo ser
usada apenas como um mtodo de diagnstico presuntivo para confirmao por outras tcnicas mais sens-
veis, tais como a imunofluorescncia direts, usando antioorpos monoclonais, a tcnica de imunoperoxida-
se(4) ou o isolamento em cultura celular.
BIBLIOGRFICAS
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A reecUao deste manual contou com a colaboralo da Organlzalo PanAmerlcana de Sade,
Organlzalo Mundial de Saude, atravs do Projeto e do CNPq.
proibido o uso para tlns comerciais
Brasilia 1992