Introduccin a los

Bioprocesos
Gastn Ortiz
gas.ortiz@gmail.com
Introduccin a la Biotecnologa 2011
IIB-UNSAM
Una breve historia
Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y ms tarde las
chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
Sin embargo, pasan casi 7000 aos para descubrir el
origen microbiano de la fermentacin (1856).
Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
qumicos industriales (1900).
70 aos ms para obtener el primer organismo transgnico
(1972).
Y 5 aos ms para la obtencin de la primera protena
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
Introduccin a los Bioprocesos
Introduccin a los Bioprocesos
Que es un bioproceso?
Es todo proceso industrial que involucra la manipulacin
de organismos vivos o sus componentes celulares para
proveer bienes o servicios
Bienes: (antibiticos, hormonas, fermentos, vacunas,
cidos orgnicos, amino cidos, biocombustibles,
biomasa, etc.)
Servicios (biorremediacin, biolixiviacin, tratamiento
de efluentes)
Introduccin a los Bioprocesos
De acuerdo a su definicin tenemos: Bioprocesos
y biotransformaciones.
BIOPROCESO
Son los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS
(nutrientes) son transformados por accin biolgica (microorganismos,
clulas, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS
Molculas complejas
Antibiticos, drogas, vacunas, efluente
tratado, vitaminas, cidos orgnicos,
aminocidos, protenas, hormonas,
Molculas sencillas
Fuentes de carbono y energa, fuente de
Nitrgeno y sales
Glucosa + amonio + sales + oxgeno BIOMASA + PRODUCTOS + calor
Biocatalizador
BIOTRANSFORMACIN
Son los procesos en los que sustratos naturales o sintticos
son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimtica
Sustrato + agua Sustrato modificado
Enzimas,
clulas
inmovilizadas
Molculas complejas
Almidn
Molculas sencillas
Glucosa Fructosa
Un bioproceso se caracteriza entonces por:
Uso de un catalizador biolgico: Enzima,
microorganismos, clulas vegetales, clulas
animales, clulas insecto, hongos filamentosos,
algas, plantas y animales
Uso de un Biorreactor: La reaccin ocurre en
forma controlada
Generacin de un Producto o Servicio
Artificial
Downstream Process
Upstream Process
Introduccin a los Bioprocesos
Upstream Processing Process Downstream Processing
Eleccin del
microorganismo.
Preparacin de medio
(Formulacin).
Esterilizacin.
Preparacin del inoculo.
Eleccin del reactor.
Eleccin del sistema de
operacin: Bacth; Alimentado;
Sistema Continuo; etc.
Estequeometra y cintica.
Instrumentacin y control.
Recuperacin del
producto por medio de
operaciones unitarias
(fsicas/qumicas)
Acondicionamiento y
estabilizacin del
producto
Formulacin del producto
Aspectos b Aspectos b sicos de un proceso Biotecnol sicos de un proceso Biotecnol gico gico
El microorganismo productor
Tenemos varias posibilidades
Partir del microorganismo productor wild type
Microorganismos modificados genticamente
para tal fin.
Recurrir a sistemas de expresin heterloga
Microorganismos productores wild type
Ventajas
Generalmente suele ser el mejor productor.
(seleccionado por la naturaleza)
La manipulacin gentica es mnima o nula, esto
nos ahora tiempo y dinero.
Posibles desventajas
Puede que no cumpla con las normas GRAS
(Generally recognized as safe)
Su utilizacin pueden presentar dificultades al
momento del escalado y etapas danwstream. Ej
hongos filamentosos.
Algunos microorganismos productores wild type
Ac. orgnicos
Alcoholes
Algunos microorganismos productores wild type
Enzimas
Antibiticos
Sistemas de expresin heterloga
Son utilizados para la produccin de protenas
recombinantes
Ventajas
Sistemas preparados para una finalidad determinada
Amplia variedad de hospedadores
Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de seleccin, etc.)
Desventajas
No siempre el producto final posee las mismas
caractersticas que el deseado.
Es por eso que debemos poner nfasis en elegir el mejor
sistema de expresin para nuestro fin
A tener en cuenta para la eleccin del sistema de expresin
Productividad (es difcil determinar a priori pero se un buen tip es
comenzar con una bsqueda de bibliografa)
Complejidad estructural
Modificaciones postraduccionales
Bioactividad de la protena de inters
Manipulacin del sistema de expresin
Bioseguridad del sistema de expresin
Sistemas de expresin heterloga
Sistemas de expresin heterloga
Sistemas de expresin heterloga:
Escherichia coli
Ventajas
Alta tasa de crecimiento
Amplio conocimiento de su gentica y fisiologa
Fcil manipulacin gentica: gran variedad de vectores y cepas disponibles,
alta eficiencia de transformacin, etc)
Fcil de cultivar
Bajo costo de cultivo
Alta acumulacin de protenas recombinantes (30% del total celular).
Lisis y recuperacin relativamente sencilla
Desventajas
No es GRAS
Contaminacin con endotoxinas
Protenas intracelular con formacin de cuerpos de inclusin
No posee modificaciones postranducionales
Sistemas de expresin heterloga:
Escherichia coli
Desventajas
No todos los genes se expresan eficientemente debido a:
Caractersticas de la secuencia nucleotdica del gen endgeno.
Estabilidad y eficiencia traduccin del RNAm
Diferencias de uso de determinados codones de
Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formacin de
puentes S-S.
Toxicidad de la protena recombinante
No es GRAS
Contaminacin con endotoxinas
Protenas intracelular con formacin de cuerpos de inclusin
Generalmente se requiere un refolding de la protena
No posee modificaciones post-traduccionales
Ventajas
Unicelular eucariota, fcil crecimiento y manipulacin
Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilacin, acetilacin, fosforilacin, eliminacin del Met-
1, procesamiento proteoltico de precursores)
Fcilmente escalable
Bajo o nulo nivel de endotoxinas
Protenas extracelulares e intracelulares
Desventajas
Baja eficiencia de transformacin
Hiperglicosilacin (S. cerevisiae principalmente)
Sistemas de expresin heterloga:
Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris)
Crecimiento microbiano
En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen
hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:
Estequiomtrico:
Nos permite conocer la concentracin final de microorganismos a
obtener a partir de datos de la composicin del medio de cultivo,
saber si hay formacin de algn producto, etc.
Cintico:
Nos dice con qu velocidad se lleva a cabo el proceso.
Crecimiento microbiano (Estequiometra)
Rendimientos
Para poder conocer la Estequiometra del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:
Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energa consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)
Por que el signo
negativo ?
S FCE + N FN + B O2 X Biomasa + P Producto + WH2O + C CO2
Dada la ecuacin de crecimiento microbiano
Como seria el rendimiento para el nitrgeno ?
Crecimiento microbiano (Estequiometra)
El carbono mol (C-mol)
Si deseamos efectuar clculos estequiomtricos debemos conocer el
rendimiento en moles.
La pregunta es qu peso de clulas (o biomasa) corresponde a "un mol"?.
Experimentalmente se vio que la composicin elemental promedio de un
microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85
De la cual podemos definir una "frmula mnima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que
est representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales)
Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que
contiene un tomo gramo de Carbono.
Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta
representado por CH20 y pesar 30 g
En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado
es:
Donde X tiene unidades de (cmol/g) de X
Donde S tiene unidades de (cmol/g) de S
Cn Hf Oq Nm C Hf/n Oq/n Nm/n 12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n
Crecimiento microbiano (Estequiometra)
Ecuacin de crecimiento y balances de materia
Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos estn referidos
a 1 C-mol de fuente de Carbono y energa, resulta
Como seria el balance de materia para el Nitrogeno?
Tarea plantear los
balances para el resto
de los componentes
Hidrogeno y Oxigeno
De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. frmula mnima
de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2
Y Yx x/s /s es f (FCE, FN) y de c es f (FCE, FN) y de c mo son estos son metabolizados mo son estos son metabolizados
De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fue De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fuentes ntes
Crecimiento microbiano (Cintica)
Velocidades volumtricas y especificas
Los rendimientos pueden expresarse como
cocientes de velocidades
Y x/s = rx/rs = /qs
Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto
nos llevara a pensar que el
microorganismo consume FCE a
la misma velocidad en ambos
tiempos. Esto es engaoso por
que al final del cultivo hay mas
clulas
A diferencia de las velocidades
volumtricas, las velocidades
especifica nos dan idea de lo que
ocurre en el cultivo
Donde = rx/X
Crecimiento microbiano (Cintica)
Ecuacin de Monod dependencia de con el Sustrato limitante
Monod estudio la dependencia del con el sustrato limitante y encontr
que la incorporacin de un sustrato limitante a la clula sigue una
cintica del tipo de Michaelis-Menten
Supuestos de Monod
El proceso difusin del sustrato limitante
es rpido comparado con la cintica de
crecimiento
El sustrato es metabolizado por una
nica E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
El proceso sigue la cintica de
Michaelis-Menten
El sustrato limitante es aquel que controlara la velocidad de crecimiento
del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE
Crecimiento microbiano (Cintica)
De que factores depende el ?
La composicin del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al
El sustrato limitante
S >> Ks = m
S<< Ks = f (S)
Crecimiento microbiano (Cintica)
De que factores depende el ?
pH
10 g/l FCE
Crecimiento microbiano (Cintica)
Mantenimiento celular
Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como
Pero esta ecuacin solo nos dice que el consumo de sustrato
solo es posible cuando hay crecimiento.
Pregunta: puede ocurrir consumo de sustrato sin que se
produzca crecimiento (generacin de biomasa)?
Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su
homeostasis.
A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo
conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt)
Y x/s = rx/rs = /qs
rs = rs + ms.X
qs = ( / / / / Yx/s) + ms.X
1/Yx/s = (1 11 1 / / / / Yx/s) + ms/
Divido por .X
Ecuacin de Pirt
Otra forma de la ecuacin de Pirt
Yx/s es el rendimiento mximo terico el que tendra si no hay
mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el real el que mido
Crecimiento microbiano (Cintica)
Mantenimiento celular
Qu factores afectan el mantenimiento?
Resp. Todos los factores que afectan al y al Yx/s
Temperatura,
pH
Composicin del medio de cultivo particularmente
naturaleza del sustrato limitante (recordar la
dependencia de con S Monod )
Presin osmtica
Ayuda (qs - ( / Yx/s)) / X = ms
Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Pelcula
Como llega el oxigeno al
microorganismo?
1debe este disolverse en el lquido
(Burbujas). Ley de Henry
(PO2 = H.C*)
2debe transferirse desde la burbuja al
microorganismo. Ley de Fick
(JO2 = -DO2 .(dC/dX))
El modelo que combina estos dos
principios es el modelo de la pelcula,
este nos dice
Que existe una pelcula estanca de
lquido alrededor de la burbuja en donde
la transferencia de materia sigue la ley
de Fick
La fuerza impulsora de esta
transferencia es la diferencia de
Concentraciones entre el seno del liquido
y la Burbuja
Transferencia de Oxigeno Kla
Henry
C* = PO2 / H
Fick
JO2 = -DO2 . (dC/dL)
Henry
C* = PO2 / H
Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.
Agitacin: si aumenta la agitacin aumenta el Kla por que:
Disminuye el espesor de la pelcula (pendiente mas pronunciada)
Disminuye el tamao de la burbuja el rea volumtrica (A)
aumenta.
Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el
Kla por que:
Aumenta el espesor de la pelcula
Temperatura: el Kla aumenta con la raz cuadrada de la
temperatura, dado que el coeficiente de difusin aumenta con la
temperatura.
Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensin
superficial forman burbujas mas chicas aumenta el rea
volumtrica de transferencia
Antiespumantes: estos aumentan la tensin superficial,
burbujas mas grandes, disminuye el Kla
Consumo de Oxigeno
Bueno sabemos que:
El suministro de oxigeno esta dado por Ro2
La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la
ecuacin de Monod.
Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor
del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno
disuelto.
Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno,
es decir no se limite en oxigeno.
El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la
velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max.
Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con
la siguiente igualdad.
Kla = ro2 max / (C* - Cc)
Transferencia de Oxigeno
100-1000 0.2 - 0.6 Levaduras
Hongos filamentosos
Bacterias
Cl. Vegetales
Cl. Animales
Tipo Celular
100-1000 0.6-1.4
20-30 0.007-0.03
1-25 0.01-0.04
Kla apropiado
max
100-1000 segn la
agitacin
Reactor tipo tanque agitado
50-150 Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su
capacidad y agitacin
10 Tubo de ensayo sin agitacin
Kla Equipo
Bioreactores
Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el
proceso se denomina biorreactor o fermentador,
El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el
desarrollo de los microorganismos
Para eso un biorreactor debe poseer:
Sistema de Mezclado: Sistema de Mezclado:
Debe mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin.
Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.
Sistema de Sistema de Termostatizaci Termostatizaci n n: :
Debe mantener constante y homognea la temperatura.
Sistema de Oxigenaci Sistema de Oxigenaci n: n:
Debe suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
Sistema de Esterilidad: Sistema de Esterilidad:
El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores
de mas de 100 l o vidrio menor volumen).
Fcil de limpiar y de esterilizar (por calor hmedo preferentemente)
Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire)
Sistema de Control y Automatizaci Sistema de Control y Automatizaci n: n:
Debe garantizar las condiciones estables de pH, O2, agitacin y temperatura como
mnimo, tambin puede controlarse el volumen por medio de la alimentacin, nivel
de espuma, etc.
Biorreactores de uso mas frecuentes
Tanque agitado
Ventajas
Alta flexibilidad de operacin
(controlada por agitacin y flujo
de gas).
Desventajas
Mecnicamente complejos
(agitador, eje, sellos, etc.).
En muchas ocasiones provocan
alta cizalladura.
Transferencia de O2 limitada
por el diseo de las paletas
Difciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminacin en
operaciones extendidas
Biorreactores de uso mas frecuentes
Air Lift
Caractersticas
Estructura sencilla.
Agitacin por inyeccin de aire.
Separacin fsica de las corrientes
ascendentes y descendentes.
Adecuado rendimiento de
transferencia de materia y calor.
Bajo shear.
Usos:
Cultivo de clulas animales, vegetales,
procesos con catalizadores inmovilizados,
produccin de protenas unicelulares a
partir de metanol y tratamiento de aguas
residuales.
Biorreactores de uso mas frecuentes
Columna de burbujeo
Caractersticas
Estructura sencilla.
Agitacin por inyeccin de aire.
Bajo shear.
Adecuado rendimiento de transferencia de
materia y calor.
Bajo costo.
Usos:
Produccin de levaduras de panificacin,
cerveza, vinagre, tratamiento de aguas
residuales.
Biorreactores
Distribucin ms uniforme de la turbulencia En medios no-Newtoniano se crean
canales de gas a travs de zona
impelente
Fciles de limpiar, posibilitan operacin
asptica extendida
Difciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminacin en
operaciones extendidas
Limitada flexibilidad. Requieren de un
diseo ms cuidadoso
Flexibilidad de operacin (controlada
por velocidad impelente y flujo de
gas)
Posibilidad de admitir altas cargas de gas
(especialmente los airlift)
Carga de gas limitada
por inundacin del impelente
Muy baja cizalladura, adecuados para
cultivos frgiles
En muchas ocasiones provocan alta
cizalladura
Mecnicamente simples y robustos Mecnicamente complejos (agitador,
eje, sellos, etc.)
Agitaci Agitaci n n neum neum tica tica (Airlift, y (Airlift, y
Columnas Columnas de de burbujeo burbujeo) )
Agitaci Agitaci n n mec mec nica nica ( (Tanques Tanques
agitados agitados) )
Sistemas de operacin o de cultivo
Llamamos as al modo de operar el biorreactor, este puede
ser de forma continua o discontinua.
Suponemos mezclado Suponemos mezclado
perfecto perfecto
Velocidad de
acumulacin
Velocidad de
ingreso
Velocidad de
salida
Velocidad de
formacin
Velocidad de
consumo
Balance de materia Balance de materia
Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres
tipos de cultivos. tipos de cultivos.
Si F1 Si F1 = = F2 Tenemos un F2 Tenemos un Cult Cult. Continuo. . Continuo.
Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Cult Cult. Alimentado. . Alimentado.
Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Batch Batch. .
Opera en continuo Opera en continuo
Opera en discontinuo Opera en discontinuo
Acumulaci Acumulaci n de volumen n de volumen
Cultivo en batch
Es el cultivo mas simple
Se realiza a volumen constante
La composicin inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo
Ecuacin de diseo de un batch
F1 = F2 =0
Entonces el balance de materia nos queda
Como V= cte
Batch Batch
= 0 = cte Por lo que
En un Batch tenemos que
Descripcin matemtica del Batch en fase
exponencial
Para que nos sirve todo esto?
Para calcular el tiempo que nos
demandara el proceso.
Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno?
los microorganismos continan creciendo?
el tiempo del proceso se ver afectado?
Descripcin matemtica del Batch limitado en
Oxigeno
Resp. 1: S, continan creciendo.
En estas condiciones el
microorganismo continua creciendo
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno
Resp. 2: S , el tiempo del
proceso ser mayor Por
qu?
Caractersticas de un cultivo batch
La duracin del cultivo batch depende
esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.
Una vez inoculado el medio, la concentracin de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.
Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.
El crecimiento puede cesar tambin por la
acumulacin de algn producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)
Cultivo continuo
Cult Cult. continuo . continuo Batch Batch
Se inicia
con un
batch
Cult Cult. continuo . continuo
Ecuacin de diseo de un cultivo continuo
F1 = F2 = F En un C. Continuo tenemos que
= 0 = cte Por lo que V= cte
El balance de materia nos queda
Despejando V Donde D = F / V y es la
velocidad de dilucin.
En el estado estacionario
Balances de materia en continuo
Biomasa
Sustrato: Para el sustrato tenemos
El sustrato limitante es quien controla la velocidad de
crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la
ecuacin de Monod en trminos de la velocidad de
dilucin D
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenemos la
dependencia de X con D
Balances de materia en continuo
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado
estacionario, tenemos la dependencia de X con D.
Nos dice que cual ser la concentracin de biomasa en el estado
estacionario
Situacin real
cuando tengo
mantenimiento
Dc
Dilucin critica
cuando el D es
igual al max
Velocidad
ptima de
operacin 80%
del max
Cultivo continuo
Aplicaciones del cultivo continuo
Permite obtener los parmetros de crecimiento max, ms,
Ks, Yx/s, entre otros.
Permite realizar estudios fisiolgicos.
Podemos discriminar los efectos de la velocidad de
crecimiento , de la composicin del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiologa celular del
microorganismo.
Permite realizar estudios de ingeniera metablica.
Inconvenientes del cultivo continuo
Inestabilidad gentica de la cepa en cultivos extendidos
(perdida de plsmidos)
Riesgos de contaminacin en cultivos extendidos.
Cultivo Batch Alimentado
El objetivo de este cultivo es
Al igual que el continuo es evitar la acumulacin de
productos txicos o inhibitorios
Controlar la velocidad de crecimiento de forma constante
(alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor
(alimentado lineal)
Incrementar la obtencin de productos como intermediarios
del metabolismo primario y protenas recombinantes
Maximizar la produccin de biomasa o de protenas
unicelulares.
En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentacin esto permite mantener
controlada la concentracin Ci
dentro del reactor.
Productos
Productos de bajo peso molecular
:
: alcoholes,
c. orgnicos, aa, nucletidos, antibiticos, etc.
Tipo I: Productos finales del catabolismo anaerbico
Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario
Tipo III: Productos del metabolismo secundario

Productos de alto peso molecular:
Productos de alto peso molecular:
polisacridos, protenas, antgenos, enzimas etc.
Productos Tipo I
Productos Tipo I
(productos finales del
(productos finales del
catabolismo anaer
catabolismo anaer

bico)
bico)
En este grupo tenemos: etanol, acido lctico, actico, butrico,
butanol y otros compuestos asociados a procesos anaerbicos.
Su formacin es consecuencia directa de la degradacin FCE
acoplada a la produccin de ATP por fosforilacin al nivel del
sustrato.(proceso anaerbico)
Siguen una cintica qp = +
Donde es directamente proporcional al ms y con
1/Yx/s.
Por lo que para este tipo de productos busco:
Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura
o tonicidad del medio.
Que m se lo mas pequeo posible, lo logro por ejemplo limitando
en Nitrgeno al cultivo.
En definitiva busco un Yx/s bajo de forma tal que todo el sustrato
sea destinado a la formacin de productos
Productos Tipo II (Intermediarios del
metabolismo primario)
En este grupo tenemos: aminocidos, nucletidos, vitaminas y
cidos orgnicos provenientes del ciclo de krebs.
En este caso los procesos de obtencin son aerobios.
A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia
directa entre la FCE y la obtencin del producto.
Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario,
los microorganismos mas utilizados son los modificados
genticamente y estos se combinan con un buen sistema de
cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo).
Ejemplo: produccin de lisina por Corynebacteriuin
glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasa
auxotrofo para metionina y treonina
Productos Tipo II (Ej. produccin de lisina)
La estrategia para obtener
lisina consiste en:
Realizar el cultivo en
condiciones tales que la
concentracin de treonina
libre sea mnima. Cmo se
logra esto?
Limitando el cultivo en
treonina (batch alimentado
exponencial o cultivo
continuo)
Esto nos demuestra lo
importante que resulta la
eleccin del sistema de
cultivo adecuado para
nuestra cepa.
Auxotrofo
Retroinhibicin
concertada
En este grupo tenemos: antibiticos, las toxinas, los alcaloides y las
giberelinas.
Frecuentemente los precursores especficos para la biosntesis de estos
productos son obtenidos por modificacin de metabolitos primarios.
Estos precursores suelen ser limitantes de la biosntesis.
Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de
regulacin de la sntesis de los precursores.
Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente
que el ms sea lo menor posible.
Por otra parte las fuentes de nitrgeno fcilmente metabolizadas como sulfato
de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja.
Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a
bajos.
A altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas
(represin catablica)
Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su
acumulacin inhibe su sntesis)
Pregunta: que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos?
El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el y mantener
a raya el feed back negativo del producto
Productos Tipo III (Metabolitos secundarios)
Resumen productos Tipo: I, II y III
Batch alimentado
Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
productos).
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae
Bajo
Aerobio Biomasa
Batch alimentado
Cultivo continuo
Bajo
Bajo
(la formacin de
producto consume
energa)
Aerobio III
Batch alimentado
Cultivo continuo
Bajo
Alto o Bajo
(depende del
producto)
Aerobio II
Batch limitado en
nitrgeno
Batch alimentado
Cultivo continuo
Bajo Alto Anaerobio I
Sistema de cultivo
?
ms? Tipo cultivo Producto
Productos de alto peso molecular
En este grupo tenemos: polisacridos, protenas,
antgenos, enzimas, etc.
Es importante entender la cintica de formacin le estos
productos, para ello definimos:
La concentracin intrnseca de nuestro producto i (enzima,
antgeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)
Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.protenas, UE, etc y X son los g.biomasa.
Por otra parte la velocidad neta de formacin de nuestro producto ser igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.
La variacin de la concentracin intrnseca en el tiempo es:
Tenemos dos factores que afectan a Ri
La velocidad neta de produccin
La velocidad con la que se diluye (.Ri)
Productos de alto peso molecular
Para maximizar su produccin
Entonces
Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde
la velocidad de produccin debe ser igual a la de
dilucin
Cmo lo logro?
Experimentando a varios
D en un continuo
Enzima inducible en
K. Latis
18,3 0,25
8,25 0,1
Ri (UE/mg.biomasa) D (h-1)
K. lactis limitado en lactosa
Downstream Processing
Intracelular Intracelular Intracelular Intracelular
1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI 1. SEPARACI N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR
6 ACABADO 6 ACABADO 6 ACABADO 6 ACABADO
5. PURIFICACI 5. PURIFICACI 5. PURIFICACI 5. PURIFICACI N DE ALTA RESOLUCI N DE ALTA RESOLUCI N DE ALTA RESOLUCI N DE ALTA RESOLUCI N NN N
3. REMOCI 3. REMOCI 3. REMOCI 3. REMOCI N DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES N DE RESTOS CELULARES
Y DESECHOS Y DESECHOS Y DESECHOS Y DESECHOS
2. DISRUPCI 2. DISRUPCI 2. DISRUPCI 2. DISRUPCI N CELULAR N CELULAR N CELULAR N CELULAR
Extracelular Extracelular Extracelular Extracelular
4. CONCENTRACI 4. CONCENTRACI 4. CONCENTRACI 4. CONCENTRACI N NN N
remoci remoci remoci remoci n del n del n del n del
componente m componente m componente m componente m s s s s
abundante abundante abundante abundante
Es muy importante la elecci Es muy importante la elecci Es muy importante la elecci Es muy importante la elecci n del n del n del n del
PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayor eliminar la mayor eliminar la mayor eliminar la mayor a de los a de los a de los a de los
contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos contaminantes. Los pasos
subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor eliminar los contaminantes de menor
importancia importancia importancia importancia
Downstream Processing
1. Remocin celular: centrifugacin y filtracin.
2. Disrupcin celular y separacin de restos celulares:
Homogenizadores: La tcnica ms recomendada para alta escala son los
homogeinizadores (Gaulin homogenizer).
Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.
La concentracin celular no afecta la eficiencia
Es necesario refrigerar (4-5C)
Los modelos ms grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
Molinos de perlas
Las clulas se rompen mediante la abracin generada por pequeas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm )
concentracin de clulas afecta la eficiencia, la concentracin ptima 30-60% peso
hmedo
Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h
Ruptura qumica o enzimtica
Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
3. Separacin de restos celulares
centrifugacin (no adecuada)
Ultrafiltracin (300,000 500,000 o mayor)
Microfiltracin (0.1 m.)
Particin en dos fases acuosas
CDR (cell Debris Remover: Whatman)
4. Concentracin
Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.
Tcnica preferida : Ultrafiltracin
particin lquido-lquido. Extraccin con solventes
Precipitacin (sulfato de NH4)
Evaporacin o destilacin
Downstream Processing
5. Purificacin de alta resolucin
Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)
Cromatografa de intercambio inico de alta
resolucin
Cromatografa de afinidad
Cromatografa metal quelante (IMAC)
6. Acabado
Esterilizacin y estabilizacin del producto
Deshidratacin, liofilizado, estabilizacin (sales)
Downstream Processing
Utilizando de las reglas de oro de la purificacin
REGLA 1 Elegir procesos de separacin basados en diferentes
propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas
REGLA 2 Separar las impurezas ms abundantes primero
Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso.
Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial
REGLA 3 Seleccionar un procesos que permita aprovechar al
mximo las diferencia entre las propiedades fisicoqumicas del
producto y los contaminantes.
Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales
impurezas
REGLA 4 Realizar las separaciones ms caras y difciles al
final
KEEP IT SIMPLE!
C CC C mo elegimos las operaciones y la secuencias ? mo elegimos las operaciones y la secuencias ? mo elegimos las operaciones y la secuencias ? mo elegimos las operaciones y la secuencias ?
Downstream Processing
Bibliografa
Microbiologa Industrial. Rodolfo Ertola,
Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone.
Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5,
Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation]
- M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)
Bioprocess Engineering Principles. Pauline M.
Doran
Cat. de Biotecnologa - Bioprocesos II UNQUI
Cat. de Ingeniera bioqumica UNLP