LA INMUNOHISTOQUMICA Y EL

CONTROL DE CALIDAD EN
ANATOMA PATOLGICA
Raimundo Garca del Moral Garrido
Director de la UGC Intercentros de
Anatoma Patolgica de Granada
Curso Control de la Calidad y la Acreditacin
en el Laboratorio de Anatoma Patolgica
Aplicacin de los inmunoensayos a las secciones
tisulares.
Localizacin inmunolgica de protenas en su medio
ambiente natural.
Evaluacin simultnea de la morfologa e identificacin y
localizacin de protenas dentro de las clulas y tejidos.
Procedimientos analticos diagnsticos empleados en la
identificacin segura y caracterizacin de tipos tisulares
en enfermedades neoplsicas y no neoplsicas.
La inmunohistoqumica cuantifica?: No, la intensidad
de la seal no representa la cantidad real de protena
acumulada en el tejido.
OBJETIVOS Y DEFINICIN DE LA INMUNOHISTOQUMICA
ESTUDIOS INMUNOHISTOQUMICOS DE CLASE I
Cualquier test inmunohistoqumico para cuya
interpretacin por el patlogo son esenciales los
antecedentes clnicos del paciente y los restantes
parmetros anatomopatolgicos de la lesin.
Habitualmente describen el grado de diferenciacin de
un tumor.
Aunque sus resultados no son descritos de forma
exhaustiva en el informe s son incorporados por el
patlogo en su interpretacin diagnstica del caso.
Es relativamente sencillo disponer de controles internos
y externos vlidos para el procedimiento.
ESTUDIOS INMUNOHISTOQUMICOS DE CLASE II
Cualquier prueba inmunohistoqumica no relacionada
directamente con el diagnstico histopatolgico de caso y
que proporciona informacin sobre el pronstico o la
teraputica a realizar en el paciente.
Pueden indicar tanto la evolucin clnica del paciente como
tener valor predictivo sobre la respuesta del paciente a un
tratamiento determinado.
Son ampliamente demandados y utilizados por los clnicos.
Requieren incorporar en el informe anatomopatolgico una
descripcin explcita y detallada cualitativa o cuantitativa de
los resultados obtenidos .
Su empleo necesita un extenso soporte cientfico previo.
Dependiendo de su uso algunos de estos tests pueden
tambin ser empleados como de clase I: CD117, CD20, etc.
ESTUDIOS INMUNOHISTOQUMICOS DE CLASE II: TIPOS
CLASIFICACIN DE LOS TESTS IHQ DE CLASE II SEGN EL CAP
Activos En consideracin En discusin
ER C4d Nucleofosmina 1 (NPM1) en AML
PR DOG1 FOXP1 en DLBCL
HER2 Protena MMR Centerina (GCET1) en DLBCL
Ki67 IgG/IgG4 en enfermedad IgG4
CD117 c-Myc en DLBCL
CD20
La inmunohistoqumica ha sido empleada en patologa
diagnstica desde hace 4 dcadas.
Solamente en los ltimos 10 aos han ocurrido avances
tecnolgicos que permiten:
o Hacerla reproducible
o Afinar y calibrar adecuadamente los procedimientos
o Armonizar y optimizar la difusin de los
procedimientos entre distintos laboratorios
o Estandarizar y automatizar el mtodo especfico
AVANCES TECNOLGICOS EN INMUNOHISTOQUMICA
El trmino estandarizacin es repetidamente mal usado
en inmunohistoqumica puesto que:
a.El procesamiento de los tejidos an no puede ser
automatizado y estandarizado de forma completa en la
mayora de los laboratorios.
b.Cada cncer es nico desde el punto de vista gentico y
por tanto contiene marcadores difciles de estandarizar.
c.No existen controles y valores de referencia de tipo gold
standard para muchas de las pruebas.
Por ej.: Un metro es la distancia a la que la luz viaja en el
vaco en 1/299,792,458 segundos.
a.Por todo ello en lugar de estandarizacin es ms correcto
emplear el trmino optimizacin.
ESTANDARIZACIN U OPTIMIZACIN EN IHQ
UN BUEN EJEMPLO DE PORQU ES DIFICIL
ESTANDARIZAR EN INMUNOHISTOQUMICA
OTRO EJEMPLO MS:
MELAN A
La gran complejidad de los test empleados en
inmunohistoqumica, la dificultad para estandarizarlos y
la ausencia de valores de referencia ha llevado a que:
a.Los procedimientos de control de calidad vayan muy
por detrs de los de Anlisis Clnicos.
b.La agencias de calidad pblicas y las compaas
privadas interesadas en calidad que existen en cada
pas sean pocas y tengan una influencia menor en las
necesarias mejoras.
c.An no estn definidas la sensibilidad y la
especificidad de cada determinacin en numerosos
laboratorios.
EL CONTROL DE CALIDAD EN IHQ (I)
No hay definicin precisa o acuerdo sobre que muestras
deben usarse como controles positivos y negativos.
No es sencillo ni barato conseguir muestras adecuadas
para control de calidad. Adems los hospitales no
generan recursos para ello.
Los calibradores estandarizados para las pruebas apenas
existen.
La filosofa de calidad entre los facultativos, tcnicos,
directivos de los hospitales, clnicos usuarios, etc. brilla
por su ausencia.
No obstante es posible comenzar a hacer cosas: Grficos
de Levy-Jenning empleando la patologa digital.
EL CONTROL DE CALIDAD EN IHQ (II)
EL CONTROL DE CALIDAD EN IHQ (II)
Dentro de unos lmites la centralizacin de los mecanismos de
supervisin (controles, evaluacin de la tecnologa de cada
laboratorio, indicacin de mejoras tecnolgicas, etc.) es til
aunque la mejora continua surge del compromiso de los
profesionales con su propia Unidad y este es el motor de la
formacin continuada del profesional. Esto no invalida que la
suscripcin a un sistema de calidad externo sea recomendable.
La alternativa de centralizar totalmente los procedimientos
complejos desmotiva a los profesionales y todo para que al final
los ndices estadsticos kappa de correlacin entre expertos
tampoco sean vlidos en numerosos casos.
Por qu no centralizar directamente los diagnsticos?
La solucin es automatizar y protocolizar para lo cual la
patologa digital y la telepatologa son la clave.
EL CONTROL DE CALIDAD EN IHQ (III)
LOS ERRORES MS COMUNES EN INMUNOHISTOQUMICA
PREANALTICO
POSTANALTIC
O
ANALTICO
Fijacin: tipo, tiempo, volumen
Descalcificacin
Inclusin
Congelacin
Tejido:
Tipo
Dimensin
Diseccin lser
Desdiferenciacin
Corte:
Grosor
Almacenamiento
Desecacin
R. ultravioleta
Pretratamiento
Inmunoteidor
manual
Anticuerpo primario:
Clon
Dilucin
Tampn
Tiempo incubacin
Temperatura
Desarrollo tcnico
Lmite de deteccin
Visualizacin
Sensibilidad
Especificidad
Localizacin
Interpretacin
Controles +/-
Modificado de Nielsen S: Most common laboratory pitfalls in immunohistochemistry. Nordiqc Seminar,
Krakow, 2010.
Cuantificacin
Informe
Control del proceso
LOS KITS DEL BULLI
LOS ERRORES MS COMUNES EN INMUNOHISTOQUMICA
PREANALTICO
POSTANALTIC
O
ANALTICO
Fijacin: tiempo, tipo, volumen
Descalcificacin
Inclusin
Tejido:
Tipo
Dimensin
DiseQCin lser
Desdiferenciacin
Corte:
Grosor
Almacenamiento
Desecacin
R. ultravioleta
Pretratamiento
Inmunoteidor
manual
Anticuerpo primario:
Clon
Dilucin
Tampn
Tiempo incubacin
Temperatura
Desarrollo tcnico
Lmite de deteQCin
Visualizacin
Sensibilidad
Especificidad
Localizacin
Interpretacin
Controles +/-
Modificado de Nieelsen S: Most common laboratory pitfalls in immunohistochemistry. Nordiqc Seminar,
Krakow, 2010.
Cuantificacin
Informe
Control del proceso
COMBINANDO LAS VARIABLES EXPUESTAS, EN
INMUNOHISTOQUMICA PUEDE HABER MS DE
CUATRO MILLONES DE PROTOCOLOS DISTINTOS
Y EL 99% ERRNEOS O AL MENOS SOMETIDOS
A POSIBLES MEJORAS!
REQUISITOS BSICOS PARA LA CALIDAD EN IHQ
FIJACIN Y PROCESAMIENTO APROPIADOS DEL TEJIDO
EFICIENTE RECUPERACIN ANTIGNICA
ADECUADA ELECCIN DEL ANTICUERPO PRIMARIO Y
EL CLON EN SU CASO
SISTEMA DE DETECCIN ESPECFICO, SEGURO Y
POTENTE
CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS APROPIADOS
QC PREANALTICO EN IHQ: PROBLEMAS DE FIJACIN
Enorme variabilidad en el proceso de fijacin:
a. Sistema de obtencin de la muestra (exfoliacin, aspiracin,
puncin con aguja, endoscopio, punch, rasurado, bistur, etc.).
b. Estado de la biopsia (necrtico, isqumico o parcialmente
autoltico dependiendo del tratamiento realizado tras la
obtencin, artefactado por desecacin, mala fijacin, etc.).
c. Tipo de fijador (formol, etanol, acetona, B5, Bouin, etc.).
d. Pretratamientos empleados (decalcificacin, congelacin, etc.).
e. Tiempo de estancia en la formalina (depende del que toma la
muestra, del que la trasporta, de quien la registra, la talla, de
cuando se coloca para la inclusin, de si es fin de semana y se
pasa horas esperando el comienzo del proceso, etc.).
QC PREANALTICO EN IHQ: ESTNDARES PROPUESTOS
PARA LA FIJACIN DEL TEJIDO (I)
a. Optimizacin del tiempo transcurrido desde la excisin del
tejido hasta situarlo en el fijador o alternativamente remisin
a 4 C envasado al vaco a AP mediante tubo neumtico.
b. Evitar la manipulacin inadecuada de los tejidos y los
tiempos de espera excesivos.
c. Anotar el tiempo total de fijacin formlica y los ocurridos
en el procesador en caso de largas esperas. Idealmente estos
tiempos deben constar en el informe anatomopatolgico.
d. Las pruebas IHQ de tipo II no son vlidas si el tejido ha sido
descalcificado. Las de tipo I pueden realizarse evitando
prolongar los tiempos y de ellas deben recogerse: el tiempo
anterior de estancia en fijador del tejido, el tipo de agente
descalcificante y el tiempo empleado en el proceso.
QC PREANALTICO EN IHQ: ESTNDARES PROPUESTOS
PARA LA FIJACIN DEL TEJIDO (II)
a. Fijador de eleccin: formalina neutra (pH entre 7,2-7,6) en
tampn fosfato y al 10% : mnimo de 8 horas; ptimo de 24
(biopsias pequeas) y 48 horas (biopsias mayores) sin que se
superen en ningn caso las 72.
b. No olvidar que los tiempos de fijacin inferiores a 8 horas son
ms deletreos para el tejido que los superiores a 72 y
provocan refijacin adicional en los alcoholes del procesador
con gran heterogeneidad en las inmunotinciones, sobre todo si
adems requieren tratamiento proteoltico.
c. Si la fijacin ha sido superior a 72 horas para las pruebas de
tipo II o de 10 das para las de tipo I se requiere validacin en el
primer caso y controles positivos y negativos en el segundo.
d. Aunque la proporcin relativa de formol y tejido est en
discusin es recomendable que no sea inferior a 5:1.
QC PREANALTICO EN IHQ: INCLUSIN Y
ALMACENAMIENTO DEL TEJIDO
1. Aunque exista variabilidad en el proceso automtico
de inclusin entre diferentes laboratorios
(concentraciones progresivas de alcoholes, protocolos
sin tolueno o xileno, temperaturas y tipo de parafina,
etc.) este proceso pueden ser estandarizado en cada
uno de ellos.
2. Los problemas surgen con los bloques de tejido
procedentes de otros laboratorios, ya sea por
centralizacin de procedimientos o consultas de
segunda opinin.
QC PREANALTICO EN IHQ: TRATAMIENTO DE LOS CORTES
a. El montaje de los cortes de 3-4 m de espesor debe
hacerse en portaobjetos especiales tratados
electrostticamente para evitar el despegamiento del
tejido.
b. Despegamientos parciales pueden originar falsos
positivos debido al atrapamiento de reactivos.
c. Aunque el secado de los portas debe ser optimizado
en cada laboratorio un secado a 37 C durante toda la
noche o a 60 C durante una hora es suficiente para
garantizar la adherencia del tejido. Calentamientos
excesivos en seco pueden originar la prdida de
antigenicidad.
QC PREANALTICO EN IHQ: ALMACENAMIENTO DE
CORTES DEL TEJIDO
1. Durante mucho tiempo se ha pensado que los cortes de tejido
podan almacenarse indefinidamente. Hoy se sabe que su
estancia a temperatura ambiente durante un tiempo deteriora
su antigenicidad por accin de determinados agentes
medioambientales:
a. El calor
b. La desecacin excesiva
c. La radiacin ultravioleta
2. De manera general puede decirse que el mejor corte de reserva
se encuentra en el bloque de parafina.
3. Evitemos guardar cortes de control para inmunohistoqumica
ms de 30 das! Si deben guardarse algunos envolverlos en papel
de aluminio y almacenarlos en el congelador a -20 C.
QC ANALTICO EN IHQ:
DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO (I)
La mayora de los eptopos antignicos estn enmascarados por la
formalina y necesitan ser recuperados en ms del 80% de los casos.
Agentes desenmascarantes:
a. Calor (de la olla a presin y el microondas al mdulo PT:
La eficiencia del procedimiento esencialmente depende de
cuatro variables: temperatura, tiempo, pH y composicin
qumica de la solucin de incubacin.
b. Tratamientos proteolticos con enzimas (pronasa, proteinasa K,
tripsina, pepsina, ficina, etc.):
Dependen del tiempo de fijacin del tejido (si es escaso el
tratamiento debe ser ms corto; si por el contrario ha sido largo el
tratamiento enzimtico puede ser insuficiente).
Mtodos: A optimizar para cada antgeno y procedimiento de
inmunotincin.
QC ANALTICO EN IHQ: DESENMASCARAMIENTO
ANTIGNICO Y pH (II)
Existen 4 comportamientos posibles para los antgenos:
Antgenos que se recuperan a cualquier pH (CD20)
Antgenos que se recuperan bien a pH muy bajo o alto
con notable disminucin del proceso entre valores de 3 a
6: Ki67 y receptor de estrgenos.
La gran mayora de los antgenos se recuperan mejor a
pH alto (Tris/EDTA 8-9) aunque en muchos laboratorios
an se sigue trabajando en rutina a pH 6.
Antgenos que se recuperan mejor a pH bajo: protenas
prinicas, EMA.
QC ANALTICO EN IHQ: ANTICUERPOS PRIMARIOS
1. En diagnstico: Anticuerpo primario prediluido optimizado,
recomendaciones predefinidas de pretratamiento y
automatizacin total del laboratorio:
a) Permite centrarse en los problemas especficos que surjan
en la puesta a punto del mtodo.
b) Mejora la seguridad del paciente evitando errores.
c) Asegura la trazabilidad al evitar manipulaciones intermedias.
d) Facilita la estandarizacin y la acreditacin.
2. En investigacin: Anticuerpo primario concentrado donde es
imprescindible la optimizacin individual de cada anticuerpo
con lo que ello conlleva: ensayo de diferentes
desenmascaramientos, uso de detergentes, diluciones, tiempos
y temperaturas de incubacin, controles, etc.
Sistemas de deteccin indirectos basados en nuevos complejos
polimricos con alto poder de amplificacin que permiten:
Eliminar la biotina del proceso de revelado.
Amplificar hasta 10 veces la seal primaria obtenida con los
complejos tradicionales de avidina-biotina.
Acortar los tiempos de incubacin de anticuerpo primario y los
propios componentes de revelado.
Qu complejo elegir para una mejor calidad del proceso?
Para m lo ms importante es mejorar al mximo el lmite de
deteccin del anticuerpo primario entendido este como la ms
baja proporcin de antgeno que es estadsticamente distinguible
de la tincin de fondo inespecfica o el control negativo.
Esta mejora es muy evidente en algunos antgenos que en
ocasiones se expresan dbilmente como: Bcl-6, CD4, MSH6, etc.
QC ANALTICO EN IHQ: SISTEMAS DE AMPLIFICACIN
QC ANALTICO EN IHQ: SISTEMAS DE AMPLIFICACIN
Tomado de Nielsen S: Most common laboratory pitfalls in immunohistochemistry. Nordiqc Seminar,
Krakow, 2010.
QC ANALTICO EN IHQ: LA ENZIMA Y EL CROMGENO
La universalizacin de procedimientos, la optimizacin
de recursos, su compatibilidad con los medios
hidrofbidos de inclusin, la facilidad de manejo y el
menor precio han impuesto a la peroxidasa de rbano
picante como sistema de marcaje para potenciar la
seal y a la diaminobencidina como sustrato a pesar de
su demostrado poder carcinognico.
Yo prefiero la diaminobencidina potenciada para
producir inmunotinciones de color negruzco ms que
pardo suave.
TRES CUESTIONES QUE POR S MISMAS MERECEN UN
CURSO DE INMUNOHISTOQUMICA:
La tincin inespecfica de fondo:
Cualquier tincin positiva en el tejido problema que no es resultado
de la reaccin especfica de los anticuerpos con el antgeno al
que van destinados.
Los controles:
a. Positivos: Muestras que contienen el antgeno a detectar
por el anticuerpo ensayado procedentes de tejidos
normales (preferible por contener cantidades antgeno
predecibles), otros pacientes con patologa equivalente o
lneas celulares bien caracterizadas.
b. Negativos: Son tejidos que no contienen el antgeno
problema y por tanto identifican la reactividad cruzada del
anticuerpo primario.
Es un reto importante pero no misin imposible
Se basa en:
Usar controles apropiados
Emplear un sistema de deteccin lo ms preciso, fiel,
sensible y especfico posible
Manejar con eficiencia el desemascaramiento
antignico por calor y enzimas cuando sea preciso
Usar anticuerpos primarios optimizados para
inmunoteidores automticos y clones apropiados
Armonizar, optimizar y estandarizar al mximo posible
todos los procesos
EL CONTROL DE CALIDAD EN IHQ: RESUMEN