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LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL


PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA
NUMERACIN PRESUNTIVA DE Escherichia coli

LSA P5.4-ML08



INDICE

1. OBJETIVO................................................................................................................... 2

2. ALCANCE ................................................................................................................ 2

3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... ... 2

4. DEFINICIONES.... 2
.
5. RESUMEN .. 2

6. DESARROLLO...... 2

7. FORMULARIOS Y REGISTROS.... 4

8. REFERENCIAS......... 4

9. ANEXOS ............ 5



FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008
FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02











NOMBRE CARGO FIRMA
APROBO

Blga. Soledad Osorio Alva.
Directora del Laboratorio de Salud
Ambiental - DIGESA

REVISO

Blga. Edith Villanueva Huamn
Aseguramiento de calidad. Laboratorio
de Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela
Warthon.
Jefa del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos.
Analista del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.


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SALUD AMBIENTAL
PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA
NUMERACIN PRESUNTIVA DE Escherichia coli
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I OBJETIVO

Describir el mtodo de ensayo para la numeracin presuntiva de Escherichia coli de acuerdo con
el mtodo horizontal ISO 7251:2005 tcnica del numero mas probable.

II ALCANCE

Este mtodo se aplica a muestras de alimentos destinados para consumo humano.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Procedimiento de anlisis para la numeracin de Coliformes.
Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico
Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.

IV DEFINICIONES

Escherichia coli presuntiva : Bacteria la cual a 45C causa fermentacin de lactosa con la
produccin de gas y la cual a 45C produce indol a partir de triptfano, cuando el ensayo es
realizado de acuerdo a lo especificado en este mtodo.

V RESUMEN

La numeracin presuntiva de Escherichia coli, requiere de 3 etapas sucesivas: Empleo del caldo
lauril sulfato triptosa, seguido de la confirmacin de los tubos positivos con gas y turbidez en
caldo E.C., y la confirmacin de E. coli a travs de la prueba de la produccin de indol.

VI DESARROLLO

6.1 Medios de cultivo y reactivos

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de
alimentos para anlisis microbiolgico:

6.1.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa
6.1.2 Segundo medio selectivo: Caldo EC
6.1.3 Agua triptona
6.1.4 Reactivo de Kovacs

6.2 Equipos y materiales.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimento
para anlisis microbiolgico e Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo:

6.2.1 Incubadora de 37C 1 C y 44C 1 C.
6.2.2 Bao de agua, capaz de mantenerse a 44C + 1 C (los tubos inoculados debe ser mantenido a
este temperatura).
6.2.3 Pipetas graduadas terminales de vaciado total, capacidad nominal de 1 mL y 10 mL, graduada
en divisiones de 0,1 mL y 0,5 mL, respectivamente.
6.2.4 Tubos de prueba, de dimensiones aproximadamente 16 mm x 160 mm y 18 mm x 180 mm
20mm x 200 mm.
6.2.5 Tubos Durham, 10 x 75 mm 7 x 70 mm, para el uso en los tubos de prueba de dimensiones de
16 mm x 160 mm.
6.2.6 Asas de siembra de nquel-cromo o platino de 3,0 a 3,5 mm de dimetro.



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6.3 Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones.
6.3.1 Ver Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.

6.4 Inoculacin e incubacin
6.4.1 Tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de doble concentracin. Usando una pipeta estril
transferir a cada uno de estos tubos 10 mL de la muestra problema si es lquida, o 10 mL de la
suspensin inicial en el caso de otros productos.

6.4.2 Luego tomar 3 tubos de medio selectivo enriquecido de simple concentracin. Usando una pipeta
estril nueva, transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra problema si es lquida, o 1
mL de la suspensin inicial en el caso de otros productos.

6.4.3 Para cada uno de las siguientes diluciones, realizar la inoculacin como se realiz con la primera
dilucin. Usar una pipeta estril nueva para cada dilucin. Mezclar cuidadosamente el inculo y
el medio.

6.4.4 Incubar los tubos de medio selectivo de doble y simple concentracin en la incubadora a 37 C
por 24 h + 2 h. si no hay formacin de gas o turbidez, continuar la incubacin otras 24 h + 2 h.

6.5 Inoculacin del segundo medio selectivo

6.5.1 De cada uno de los tubos incubados que muestre formacin de gas, inocular con el asa de
siembra en el segundo medio selectivo.

6.6 Segunda incubacin

6.6.1 Incubar los tubos inoculados en el bao de agua, a 44C 1 C por 24 h+ 2 h. Si en esta etapa
no se observa la formacin de gas incubar por un total de 48 + 2 h.

6.7 Inoculacin en agua triptona e incubacin

6.7.1 Para cada tubo incubado que muestre formacin de gas, inocular con un asa el agua de triptona,
previamente calentando a 44C. Incubar los tubos inoculados por 48 h + 2 h a 44 C.

6.8 Prueba para la produccin de Indol e interpretacin

6.8.1 Aadir 0,5 mL del reactivo de Kovacs a los tubos agua de triptona inoculado e incubados mezclar
bien y examinar despus de un minuto.

6.8.2 Para cada dilucin contar el nmero de tubos con un color rojo en la fase alcohlica, esto indica
la presencia de Indol (tubos positivos).

6.9 Interpretacin final

6.9.1 Por cada dilucin, contar el nmero total de tubos en la cual se observa la formacin de indol
(tubos positivos).

6.10 Clculos y expresin de resultados

6.10.1 Ver Procedimiento de anlisis para la numeracin de Coliformes tem 6.7 y Anexo 5.

6.11 Reporte

6.11.1 Los resultados obtenidos, se expresaran NMP de Escherichia coli / gramo o mililitro.


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6.11.2 Los resultados para cada muestra se transcriben al Registro interno de resultados que luego se
archiva.

6.12 Control de calidad
6.12.1 Para verificar la capacidad del laboratorio para la numeracin de Escherichia coli, con el mtodo
y medios descritos en este procedimiento, se siembra en el medio de cultivo (caldo) con una
cepa de Escherichia coli y se procede a travs de todo el protocolo analtico usado para la
muestra prueba. Un medio de control positivo asegura que ninguna sustancia en el medio de
cultivo es inhibidor para los coliformes.
6.12.2 Incluir adems un medio de control negativo. El control es preparado colocando un tubo con el
medio de cultivo sin inocular a travs de todo el procedimiento realizado para la muestra prueba.
Un medio de control negativo asegura que el medio preparado no esta contaminado con
Escherichia coli.

VII FORMULARIOS Y REGISTROS

7.1 Registro de numeracin presuntiva de Escherichia coli.

VIII REFERENCIAS

8.1 ISO 7251:2005. Microbiology General guidance for enumeration of presumptive Escherichia coli
Most probable number technique.

8.2 ISO 7218: 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for
microbiological examinations.


IX ANEXOS



























N ANEXO TITULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)
2 Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)




90 mL
APS

9 mL
APS
10
-1
10
-2
10
-3

1 mL
1 mL 1 mL
Pasar los tubos positivos con gas y turbidez, a:
Caldo EC
....
1 mL 1 mL
1

2 X
X
Incubar a 37C por 24 h a 48 h + 2 h
-1


10 mL
10 g de muestra
-3 -2
....
Incubar los tubos en bao de agua o incubadora
a 44C + 1 C por 24 h a 48 h + 2 h
Pasar los tubos positivos: gas y turbidez, a:
Caldo o Agua triptona.
Incubar a 44C por 48 + 2 h.
Aadir 0,5 ml del reactivo de Indol (Kovacs), en cada tubo inoculado, mezclar
bien y examinar despus de 1 minuto.
Hacer la lectura, de cada tubo por dilucin, contando el N de tubos con color
rojo, que indica la presencia de Indol (tubos positivos).
Considerar tubos
para control (+) y (-)
Considerar tubos
para control (+) y (-)
Prueba
Confirmativa
Confirmacin
Bioqumica
Presencia de
Escherichia coli
Ver Tabla NMP, clculo y expresin de resultados

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ANEXO 2: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos

3.1 Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa

Composicin
a) Medio de doble
concentracin
b) Medio de simple
concentracin
Triptosa 40 g 20 g
Lactosa (C
12
H
22
O
11
.H
2
O) 10 g 5g
Fosfato hidrgeno di potsico
(K
2
HPO
4
)
5,5 g 2,75 g
Fosfato di hidrgeno
potsico (KH
2
PO
4
)
5,5 g 2,75 g
Cloruro de sodio 10 g 5 g
Lauril sulfato de sodio 0,2 g 0,1 g
Agua 1000 mL 1000 mL

Preparacin
Disolver los diferentes componentes o del medio completo deshidratado en el agua, si es necesario,
calentar.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 6,8 + 0,2 a 25C.
Dispensar el medio en cantidades de 10 mL en tubos de dimensiones de aproximadamente de 16 mm x
160 mm, conteniendo tubos Durham en el caso de medio de simple concentracin, y en los tubos de
dimensiones de aproximadamente 20 mm x 200 mm (no contienen tubos Durham) en el caso del medio
de doble concentracin.
Esterilizar en la autoclave a 121C por 15 minutos.
Los tubos Durham no deben contener burbujas despus de la esterilizacin.

3.2 Caldo EC

Composicin
Triptosa o tripticasa 20 g
Lactosa (C
12
H
22
O
11
.H
2
O) 5 g
Bilis de buey desecado 1,5 g
Fosfato hidrgeno di potsico (K
2
HPO
4
) 4,0 g
Fosfato dihidrgeno potsico (KH
2
PO
4
) 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agua 1000 mL

Preparacin
Disolver los componentes o del medio completo deshidratado en el agua, calentar si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 6,8 a 25C.
Dispensar el medio en cantidades de 10 mL en tubos de prueba de aproximadamente 16 mm x 160 mm
conteniendo tubos Durham.
Esterilizar en una autoclave a 121C por 15 minutos.
Los tubos Durham no deben contener burbujas despus de la esterilizacin.

3.3 Agua triptona

Composicin
Triptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agua 1000 mL

Preparacin
Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, para que luego de la esterilizacin este sea 7,3 a 25C.

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Dispensar el medio en cantidades de 5 mL en tubos de prueba de aproximadamente 13 mm x 100 mm.
Esterilizar en una autoclave a 121C por 15 minutos.

3.4 Reactivo para indol

Composicin
4-Dimetilaminobenzaldehido 5,0 g
2-metilbutan-1-ol o pentan-1-ol 75,0 mL
Acido hidroclrico, (= 1,18 g/mL a 1,19 g/mL) 25,0 mL

Preparacin
Disolver el 4-Dimetilaminobenzaldehido en alcohol por calentamiento suave por medio de bao de agua
contenindolo a 50C a 55 C aproximadamente.
Enfriar y aadir el cido.
Proteger de la luz y almacenar a 4C aproximadamente.
El reactivo debe ser amarillo claro a marrn claro.