-1-

Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: agadacrist@hotmail.com

1
Estudante do Curso de Biomedicina; e-mail: le_cs@click21.com.br
2
Professor da Universidade Estadual de Campinas; e-mail: cabral@fea.unicamp.br
3
Professor da Universidade Bandeirante de So Paulo; e-mail: mribeiro@uniban.br
4
ATIVIDADE ANTIOMICROBIANA E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE
PRPOLIS OBTIDOS ATRAVS DA EXTRAO POR FLUIDO SUPERCRTICO
Juliana Cristina Pereira Calado
1
;
Leticia Cavalcanti dos Santos
2
;
Fernando Antonio Cabral
3
;
Maria Cristina Marcucci
4
rea do Conhecimento: Cincias da Vida.
Palavras-chaves: prpolis; atividade entimicrobiana; atividade antioxidante; extrao supercrtica
INTRODUO
A prpolis uma resina natural produzida pelas
abelhas e utilizada pela populao para o tratamento de
inmeras condies mdicas, incluindo infamao,
dor e infeces bacterianas. Quimicamente, a prpolis
apresenta diversos compostos, sendo que na denominada
de verde esto presentes vrios compostos fenlicos.
Recentemente, foi demonstrada a tipifcao das amostras
de prpolis no Brasil, associando-as a atividades biolgicas
especfcas. A tipifcao um processo importante que
emprega marcadores qumicos para caracterizar amostras
de prpolis provenientes de regies geogrfcas distintas.
A fnalidade deste projeto quantifcar os marcadores
qumicos da prpolis verde e de fraes obtidas atravs da
extrao por fuido supercrtico, empregando-se a CLAE.
Concomitantemente, ser avaliado o teor de Artepillin C, o
principal marcador da prpolis em questo, em amostras de
alecrim, a principal fonte vegetal para a elaborao desta
prpolis. Paralemente, ser avaliada a atividade biolgica
desta prpolis, fraes e de amostras de alecrim em
ensaios biolgicos, tais como ao antioxidante e atividade
antimicrobiana, entre outros. Para isso, sero utilizados
mtodos qumicos atravs de CLAE, e mtodos e ensaios
biolgicos in vitro, alm da quimiometria que ser empregada
para estabelecer correlaes entre a composio qumica e
as atividades antioxidante e antimicrobiana. Midorikawa
et al (2001) identifcaram a presena de Artepillin C,
cido 4-hidroxi-3-prenilcinmico, cido p-cumrico e
canferide em amostras de prpolis brasileira. Sawaya et al
(2004) usaram cromatogramas obtidos por electrospray
ionization mass spectrometry para caracterizar e
identifcar amostras de prpolis oriundas da Europa, EUA,
frica e das diferentes regies do Brasil, identifcando os
seguintes componentes: cido p-cumrico, 3-metoxi-4-
hidroxicinamaldeido, 2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-
benzopirano, cido 3-prenil-4-hidroxicinmico, crisina,
pinocembrina, cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico
(Artepillin C), cido dicafeoilqumico, entre outros. Pelo
exposto, baseando-se no fato de que a prpolis um
produto de alto valor no mercado internacional e o Brasil
possui um grande potencial para a sua produo, j que
produz prpolis de excelente qualidade (considerada hoje
a melhor do mundo), verifcou-se a no existncia no
Brasil de nenhuma pesquisa usando CO
2
supercrtico para
fracionar a prpolis. Porm, esta tcnica que emprega a
propriedade anti-solvente para o fracionamento da prpolis
j realidade no Japo (JAFRA, 2004), produzindo assim
um produto diferenciado e de altssimo valor agregado.
Considerando tambm a possibilidade de encapsular os
princpios ativos de prpolis usando o dixido de carbono
como solvente ou anti-solvente, os objetivos que sero
especifcados no prximo item foram estabelecidos como
proposta para este trabalho.
OBJETIVOS
Avaliar o contedo de substncias fenlicas
atravs da cromatografa lquida de alta efcincia
(CLAE) quantitativa dos extratos de prpolis obtidos
atravs da tcnica de extrao por fuido supercrtico.
Comparativamente, determinar o teor de Artepillin C em
amostras de alecrim, a fonte vegetal para a elaborao
da prpolis verde. Verifcar a atividade antimicrobiana e
antioxidante das amostras.
-2-
Atividade antimicrobiana in vitro
Os microrganismos empregados nos testes
foram: Staphylococcus aureus (S.aureus) ATCC 29213,
Salmonella ATCC 33277, Escherichia coli (E.coli) ATCC
25922, Candida albicans (C.albicans) ATCC 10231 e
Bacillus cereus (B.cereus). As culturas de bactrias foram
mantidas a 20C em TSB + 15% de glicerol e reativadas
em meio apropriado para cada cepa.
Difuso em disco
A atividade antimicrobiana da amostra de
prpolis e das fraes dela obtidas e dos extratos de
alecrim foi avaliada pelo mtodo de difuso em disco
(ensaio preliminar) para confrmar suas atividades contra
os microrganismos C. albicans, E. coli e S. aureus, sendo
estipulada qualitativamente pelo mtodo de difuso em
disco preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2005). As placas foram incubadas a 37
o
C, exceto para a C.albicans (24
o
C) por 24 horas e, em
seguida, o halo de inibio (em mm) foi medido com um
paqumetro.
Diluio em agar
O mtodo de diluio em agar, descrito pelo
CLSI (2005), foi utilizado para ser comparado com o da
macrodiluio descrita a seguir. A concentrao inibitria
mnima (CIM) da amostra de prpolis, das fraes dela
obtidas e dos extratos de alecrim foi avaliada como se
segue. As concentraes fnais dos extratos hidroalcolicos,
a partir do estoque a 1%, foram 0,005%, 0,010%,
0,015%, 0,020%, 0,025%, 0,030% e 0,035%. Estas foram
individualmente diludas em meio de cultura gar Muller-
Hinton (Merck). O inculo (C. albicans, E. coli, S. aureus,
Salmonella e B. cereus) foi preparado atravs de suspenso
direta de colnias com turvao equivalente a 0,5 da escala
de McFarland em 5,0 ml de soluo salina a 0,85%. Em
seguida, foi diludo 1/10 para ser obtida uma concentrao
de 10
7
UFC/ml (unidades formadoras de colnias por
mililitro). 1 l de cada inculo foi distribudo na superfcie
do gar, sendo que a concentrao fnal do inculo foi de
aproximadamente 10
4
UFC. Uma placa contendo somente
meio de cultura e os inculos bacterianos foi utilizada
como controle. Todas as placas foram incubadas a 35
o
C
por 20h. A CIM foi determinada a partir da placa em que
no houve crescimento bacteriano. Este teste foi realizado
somente com o material que apresentou halo de inibio,
conforme descrito no item anterior.
Leitura e interpretao dos resultados
Para o mtodo de difuso em disco, os resultados
foram interpretados de acordo com halo de inibio
alcanado pela prpolis para cada microrganismo sendo
a leitura dos resultados realizada a partir da medio
do dimetro dos halos em milmetros. Para o mtodo
METODOLOGIA
Uma amostra de prpolis bruta do tipo verde, de
boa qualidade, proveniente da regio sudeste do Brasil foi
fornecida pela Bioessens Ltda. A amostra contm 8,2 mg/
g de cido p-cumrico e 44,0 mg/g de Artepillin C. Esta
amostra foi fracionada no Laboratrio Extrae (Laboratrio
de Extrao Termodinmica Aplicada e Equilbrio) da
Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp.
As amostras de alecrim (Baccharis dracunculifolia)
foram cedidas pelo Centro Plurisdisciplinar de Pesquisas
Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA) da Unicamp.
Metodologia para a Obteno do Extrato
Etanlico da Prpolis (EEP)
O extrato etanlico de prpolis foi obtido atravs
da mistura de 3 gramas de prpolis bruta com 10 ml de
lcool etlico p.a. (ou na mesma proporo) em agitador
magntico na temperatura ambiente por 1 dia. Aps esse
procedimento, a amostra foi fltrada para a separao da
poro insolvel, o fltrado armazenado em freezer por
24 horas e fltrado novamente para a reduo do teor de
gordura no extrato. O solvente foi evaporado em estufa
a temperatura de 50C at a obteno do extrato seco de
prpolis.
Clculo do teor de slidos solveis
Para cada um dos extratos, tanto o etanlico
como os obtidos por extrao supercrtica com CO
2
,
foi observado o seguinte procedimento: foi pesado um
becker de 25 ml e anotado o peso. 5 ml do extrato foram
pipetados no becker e este levado estufa a 60 C at a
secura. O becker foi retirado e resfriou-se o que nele havia
no dessecador. Pesou-se e repetiu-se a operao at peso
constante. O procedimento foi realizado em triplicata.
Anlise da prpolis por CLAE
Uma quantidade de aproximadamente 50mg da
prpolis bruta e de todas as fraes obtidas por extrao
em fuido supercrtico foram solubilizadas com 5ml de
metanol a quente, fltrada em papel de fltro e passada por
um fltro Millipore (0,45, Sartorius) para a anlise por
cromatografa lquida de alta efcincia em fase reversa
(CLAE). A composio qumica das amostras da prpolis
foi avaliada por CLAE (cromatgrafo LaChrom, modelo
D-7000, Fapesp proc. 95/09306-5) empregando-se uma
coluna C18 em fase reversa e um gradiente linear (fuxo
de 1 ml/min) composto de metanol e gua acidifcada com
5% de cido frmico. Foi utilizado um detector de rede de
diodos na deteco dos picos.
Atividade biolgica e antioxidante
A atividade antioxidante foi avaliada empregando-
se o radical difenil-picril-hidrazila, conforme o mtodo
descrito por Hatano et al, 1989 e Banskota et al, 2000.
-3-
de diluio em Agar, a CIM foi determinada a partir da
placa em que no houve crescimento bacteriano, sendo
os resultados expressos como positivo (houve inibio) e
negativo (no houve inibio).
RESULTADOS E DISCUSSO
Com respeito atividade antioxidante,
empregando-se o DPPH, as amostras se comportaram
de maneira distinta, isto , algumas apresentaram boa
atividade antioxidante, quando comparada com a da
prpolis bruta. O valor de CE
50%
expressa a concentrao
que elimina 50% dos radicais livres, isto , quanto menor
esta concentrao, maior a atividade. A amostra C3 foi a
que apresentou a melhor atividade antioxidante (CE
50%
=
7,91) sendo comparada a da prpolis bruta (CE
50%
= 7,58).
Os valores so mostrados na tabela 1.
A atividade antimicrobiana das fraes foi
avaliada contra alguns microrganismos. A maioria
das fraes da prpolis no inibiu os microrganismos
testados, sendo que as amostras C1 a C9 apresentaram
halo de inibio, empregando-se o mtodo de difuso
em disco. A amostra PB101 foi a que apresentou o maior
halo de inibio (10 mm). Outras amostras da srie Pb
e SC tambm apresentaram halos de inibio. O extrato
etanlico de prpolis avaliado, apresentou halo de inibio
somente contra S.aureus (10 mm) sendo que no foi
possvel realizar o ensaio com o microrganismo E.coli
pois foi necessria a sua reativao. As amostras C5 e C9
apresentaram atividade antimicrobiana na concentrao de
50 g/ml contra o B.cereus. A amostra Pb101 aprensentou
atividade comprovada contra B.cereus e S.aureus na
concentrao de 100 g/ml, bem como o EEP contra os
mesmos microrganismos nesta concentrao. Nenhuma
das amostras apresentou atividade antimicrobiana contra
C.albicans. A amostra C5 inibiu a Salmonella numa
concentrao de 300 g/ml. A tabela 6 mostra o controle
microbiano, indicando a ausncia do crescimento da E.coli,
motivo pelo qual no foi realizado o ensaio de diluio
em agar. As amostras de alecrim foram avaliadas quanto
sua atividade antioxidante e antimicrobiana (difuso
em disco). As amostras testadas no apresentaram boa
atividade antioxidante, quando comparadas com a prpolis
(resultados no mostrados). Estas amostras tambm no
apresentaram atividade antimicrobiana.
CONCLUSES
Os resultados encontrados mostram um caminho
promissor para o uso da extrao supercrtica na obteno
de fraes de prpolis ricas em compostos fenlicos, com
atividade antioxidante e antimicrobiana, conforme indicam
os resultados. Os dados foram incorporados ao projeto com
prpolis do laboratrio Extrae do Prof. Dr. Fernando Cabral
da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp. A
parceria frmada com o prof. Cabral foi consolidada atravs
dos resultados mostrados no presente relatrio.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BANSKOTA, A. H., TEZUKA, Y., ADNYANA, I.K.,
MIDORIKAWA, K., MATSUSHIGE, K., MESSAGE,
D., HUERTAS, A. A. G.,KADOTA, S. (2000). Journal of
Ethnopharmacology 72, 239-246.
CLSI (2008). Clinical Laboratory Standards Institute.
www.clsi.org.
HATANO, T., EDAMATSU, R., MORI, A., FUJITA, Y.,
YASUHARA, T., YOSHIDA, T., OKUDA, T. (1989).
Chemical and Pharmaceutical Bulletin 37, 2016-2021.
JAFRA (2004) http://jafra.gr.jp/propolis-e-html
SAWAYA, A.C.H.F., TOMAZELA, D.M., CUNHA IBS,
BANKOVA, V.S., MARCUCCI, M.C., CUSTODIO, A.R.,
EBERLIN M.N. (2004). Analyst, 129, 739-744.
Tabela 1 Resultados da atividade antioxidante expressos em CE50 (concentrao que elimina 50% dos radicais livres
em g/ml)