Collet Ot Rich Um

RELACION ENTRE INFECCIONES QUIESCENTES DE Colletotrichum
gloeosporioides (Penz) Y LOS DIFERENTES ESTADOS FENOLGICOS

DEL FRUTO DE MANGO (Magnifera indica L) VARIEDAD HILACHA

LORENA PARRA AYA

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de

Microbilogo Agrcola y veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA AGRCOLA Y VETERINARIA
BOGOTA
2008
NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia".


LORENA PARRA AYA

APROBADO

____________________________
M Clemencia Forero de la Rotta
Ingeniera Agrnoma M.Sc.
Directora

________________________ _____________________________
Jos Salvador Montaa Sandra Gmez
Bilogo M.Sc. Ingeniera Agrnoma M.Sc.


LORENA PARRA AYA

APROBADO

________________________ ________________________
INGRID SHULER JANETH ARIAS PALACIOS
Biloga Ph.D Bacteriloga M.Sc-M.Ed
Decana Acadmica Directora de Carrera

Agradecimientos

A Dios.

A mis padres Arnulfo Parra y Betty de Parra por darme la oportunidad de
estudiar y ser una persona de bien, a mis hermanas J ohana, Natalia y Maria
Camila por el apoyo que me brindaron.

A mi novio J ulian por todo el tiempo, colaboracin, dedicacin y apoyo para
poder realizar con xito este proyecto.

Maria Clemencia Forero de la Rotta, por la confianza, por su colaboracin,
por sus enseanzas y por guiarme en este proyecto.

A J airo Osorio por la oportunidad y la confianza de dejarme realizar este
trabajo.

A J uan Clmaco Ho y Erika Patricia Martnez. Laboratorio de Fitopatologa.
CORPOICA. Por su apoyo y colaboracin.

A Carlos y Dimas. Laboratorio de Fitopatologa. CORPOICA Nataima. Por
sus colaboraciones.

A J ohana Rozo por su apoyo, colaboracin y su amistad.

A mis amigas de la universidad, Silvia Duarte, Irene Chabur, Carmen Pinzon
y Diana Valbuena por estar ah.

RESUMEN

La antracnosis cuyo agente causal es Colletotrichum gloeosporioides, es
considerada la enfermedad mas limitante en cultivos de mango variedad
hilacha ocasionando numerosas prdidas en su produccin, incitando a la
bsqueda de alternativas de manejo iniciando por un conocimiento pleno del
agente causal y su relacin parastica con el hospedero. Se obtuvieron
aislamientos de Colletotrichum gloeosporioides de frutos aparentemente
sanos de Mango variedad Hilacha, en los diferentes estados fenolgicos (E1,
E2, E3 y E4) desde fruto en desarrollo hasta fruto maduro.
Las infecciones quiescentes se presentaron con mayor frecuencia en estados
fenolgicos iniciales (E1 y E2), comparados con los estados de desarrollo
avanzado, debido probablemente al efecto del pH del fruto.

Se realizaron pruebas biolgicas para determinar la patogenicidad del hongo
y confirmar la especie de Colletotrichum que se presenta en los frutos de
esta especie. Las pruebas de sensibilidad al Benomyl, la prueba cualitativa
de la proteaza y el medio selectivo para Colletotrichum spp. determinaron la
presencia de la especie C. gloeosporioides como el agente causal de la
antracnosis. La patogenicidad de los aislamientos se evalu inoculando
bloques de agar sobre los frutos. Se demostr que todos los aislamientos
causan infeccin en los frutos.

Palabras Claves: Antracnosis, pH, Fenologa e Incidencia.

ABSTRACT

The anthracnose whose causative agent is Colletotrichum gloeosporioides, is
considered the most limiting disease in mango crops causing numerous
losses in their production, prompting the search for alternative management
by initiating full knowledge of the causative agent and its parasitic relationship
with the accommodation provider. The Insulation of Colletotrichum
gloeosporioides earned of fruits apparently of healthy Mango variety
stringless, at different phenological stages (E1, E2, E3 and E4) from
developing fruit until ripe fruit. The results showed that quiescent infections
were presented with greater frequency in phenological stages initials (E1 and
E2), compared with the advanced stages of development, probably due to the
effect of pH of the fruit.

Biological tests were conducted to determine the pathogenicity of the fungus
and confirm the kind of Colletotrichum occurring in the fruits of this kind.
Evidence of sensitivity to Benomyl, the qualitative evidence from the proteaza
and selective medium for Colletotrichum spp. determined the presence of the
species C. gloeosporioides as the causal agent of anthracnose. The
pathogenicity of the isolates were evaluated by inoculating agar blocks on the
fruits. It showed that all isolates cause infection in the fruits.

Key Words: Anthracnose, pH, Phenology and incidents.

CONTENIDO

Pag
1. INTRODUCCIN 14
2. MARCO TEORICO 16
2.1 Mango comn o Hilacha (Mangifera indica L.) 16
2.1.1 Botnica y Descripcin 16
2.1.2 Condiciones Agroecolgicas 18
2.1.3 Plagas y Enfermedades 19
2.2 Agente Causal 19
2.2.1 Taxonoma 20
2.2.1.1 Estado Telemorfo 20
2.2.1.2 Estado Anamorfo 20
2.3 Generalidades 21
2.4 Desarrollo de la Enfermedad 22
2.4.1 Infecciones quiescentes 24
2.5 Sntomas 28
2.6 Condiciones Epidemiolgicas 29
2.7 Mtodos de Diagnstico 31
2.8 Control 32
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y J USTIFICACION 33
4. OBTETIVOS 35
4.1. Objetivo general 35
4.2. Objetivos especficos 35
5. MATERIALES Y METODOS 36
5.1. Localizacin de la Investigacin 36
5.2. Muestreos de frutos. 37
5.3. Deteccin de infecciones quiescentes 39
5.4. Aislamiento de Colletotrichum sp. 39
5.4.1. Purificacin de Aislamientos 40
5.5. Pruebas Biolgicas 41
5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp. 41
5.5.2 Pruebas de Patogenicidad 42
5.5.3 Prueba de tolerancia al Benomyl 44
5.5.4. Prueba de la Proteasa 44
5.6. Determinacin del pH en los diferentes estados del fruto de
Mango. 45
6. RESULTADOS Y DISCUSION 47
6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp. 47
6.2 Deteccin de Infecciones Latentes en frutos asintomticos de
Mango. 49
6.3 Medio selectivo para Colletotrichum sp. 52
6.4 Prueba de Benomyl 53
6.5 Prueba de la Proteasa. 54
6.6 Pruebas de Patogenicidad 56
6.7 Determinacin de pH en Frutos sanos y Enfermos de Mango. 57
7. CONCLUSIONES 63
8 RECOMENDACIONES 65
9. REFERENCIAS 66
ANEXOS 74

TABLA DE FIGURAS

Pag
Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por
Glomerella cingulata y Colletotrichum gloeosporioides. 22
Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango. 24
Figura 3. Eventos entre el patgeno y el hospedero dentro de la
infeccin quiescente en frutos por C. gloeosporioides. 27
Figura 4. Frutos de Mango. 28
Figura 5. Estados Fenolgicos de Mango. E1, E2, E3 y E4. 37
Figura 6. Frutos de Mango sanos con y sin bloques de agar con
micelio del microorganismo. 42
Figura 7. Caractersticas microscpicas de C. gloeosporioides. 46
Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. 47
Figura 9. Porcentaje de infeccin quiescente de C. gloeosporioides
en los diferentes estados fenolgicos de frutos de mango. 49
Figura 10. Prueba de Benomyl. 52
Figura 11. Prueba de la Proteasa. 54
Figura 12. Frutos de Mango con sntomas de antracnosis iniciales y
avanzadas. 55
Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH en mesocarpio y
exocarpio y sobre tejido tomado en el fruto. 60

LISTA DE TABLAS

Pag
Tabla 1. . Etapas fenolgicas de los frutos de Mango, de acuerdo con
la edad, dimensiones, peso y otras caractersticas.
37
Tabla 2. Clasificacin de las especies segn los medios de
evaluacin biolgica.
41
Tabla 3. Periodo de Incubacin de los Diferentes Estados
Fenolgicos de Frutos de Mango.
48
Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango. 56
Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango. 57

LISTA DE ANEXOS

Pag
ANEXO 1. Preparacin de Agar Agua. 73
ANEXO 2. Preparacin de PDA. 74
ANEXO 3. Protocolo de Cmaras Hmedas. 75
ANEXO 4. Protocolo Monospricos. 77
ANEXO 5. Medio para evaluar la reaccin de la proteasa producida
por Colletotrichum acutatum.
80
ANEXO 6. Protocolo Medio Suplementado con base Benomyl. 81
ANEXO 7. Protocolo Medio Suplementado con Hidrxido de Cobre y
Estreptomicina.
83
ANEXO 8. Incidencia de Infecciones Quiescentes en los estados
fenolgicos de frutos de Mango.
85
ANEXO 9. Pruebas de Validacin, Normalidad y comparacin de
promedios en la incidencia de infecciones quiescentes en los estados
fenolgicos de frutos de mango.
88
ANEXO 10. Caractersticas Morfolgicas de los Aislamientos. 91
ANEXO 11. Prueba de Benomyl con 2 repeticiones. 92
ANEXO 12. Prueba de la Proteasa con 2 repeticiones. 93
ANEXO 13. Prueba de medio selectivo para Colletotrichum sp. 94
ANEXO 14. Presencia de sntomas iniciales de Antracnosis en los
tratamientos de Patogenicidad.
96
ANEXO 15. Efecto de la Enfermedad sobre el pH en reas sanas y
enfermas de frutos enfermos y en frutos sanos.
97
ANEXO 16. Pruebas de Validacin, Normalidad y comparacin de
promedios en el efecto de la enfermedad sobre el pH.
111

13
1. INTRODUCCIN

El mango es una de las frutas tropicales considerada de gran importancia
socioeconmica en Colombia junto con el banano y los ctricos, ya que
constituye una alternativa productiva de alto potencial en el mercado nacional
y de exportacin.

En Colombia existen alrededor de 13.900 hectreas sembradas con este
frutal, que producen aproximadamente 170.000 toneladas de frutas al ao.
Los departamentos de mayor produccin son Tolima y Cundinamarca.
Debido a la expansin del mercado interno y a las posibilidades de
exportacin se requiere la utilizacin de tecnologa para optimizar y mejorar
los rendimientos. Dentro de la tecnologa demandada el mayor inters se
centra en el manejo de la antracnosis, por ser el problema fitosanitario ms
limitante de la produccin de mango.

La antracnosis es causada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides
(Penz), afecta frutos y otras estructuras de la planta. Las prdidas por esta
enfermedad durante la cosecha se han calculado aproximadamente en un
40%; no obstante, los daos en poscosecha como consecuencia de
infecciones quiescentes hacen de la enfermedad una verdadera amenaza
para la competitividad de los sistemas productivos.
Actualmente en Colombia el manejo de la enfermedad en mango se
fundamenta en la aspersin programada de fungicidas durante la fase
productiva, de esta forma se hacen entre 8 y 12 aspersiones, lo cual resulta
muy costoso y perjudicial para los seres vivos y el medio ambiente; en
muchos casos no se obtienen resultados favorables. Debido a la importancia
econmica de esta enfermedad es conveniente conocer la incidencia de las
infecciones quiescentes de C. gloeosporioides (Penz.) a lo largo del
14
desarrollo del fruto y simultneamente establecer una posible relacin entre
ellos, para llegar a enfocar de manera adecuada programas de control
integrado que presenten menor grado de contaminacin al ambiente.

15
2. MARCO TEORICO

2.1. Mango comn o Hilacha (Mangifera indica L.)

El mango es una de las frutas ms importantes en el trpico, se cultiva en
todos los pases que se encuentran en esta rea. Se conoce hace mas de
4000 aos en la India, donde en la actualidad existen mas de 800.000
hectreas cultivadas con este frutal. (Salazar, 1992).

Es originario de la India, de donde se distribuy por todo el suroeste de Asia
y el archipilago malayo. A Amrica lleg por dos vas: de Asia fue llevado
por los portugueses al sur de frica y luego a las costas brasileas, en el
siglo XVI. Los espaoles lo introdujeron a Mxico en los siglos XV y XVI,
mediante el comercio que se estableci con Filipinas. (Salazar, 1992).

Colombia cuenta con extensas zonas aptas para su cultivo: la costa Atlntica,
los Llanos Orientales, todo el valle del Magdalena, Cauca (Pata), Guajira,
Tolima y Huila. La gran aceptacin de esta fruta tanto en el mercado nacional
como en el internacional, hace que el cultivo a escala comercial en Colombia
sea una empresa rentable y de gran porvenir para el pas (Pez, 2006).

2.1.1. Botnica y Descripcin

El mango Mangifera indica L. pertenece a la familia de las anacardiceas, el
gnero Magnifera tiene 62 especies arbreas, de las cuales 16 producen
fruto comestible. Forman parte del orden de las terebintales. (Salazar, 1992).

16
Es un rbol de gran porte que puede llegar a medir 30 m de altura y de gran
longevidad. El tronco es grueso con una corteza parda oscura, spera, de
ramas separadas; la forma del rbol depende de varios factores:
propagacin, podas, variedad y medio ambiente. El sistema radicular
presenta un amplio desarrollo pudiendo penetrar las races principales de 6 a
8 metros, mientras que se extienden en un radio de 10 metros, esta
distribucin le permite resistir pocas de baja humedad. (Salazar, 1992).

Las hojas al principio tienen un color rojizo o prpura, que del cual cambian a
verde claro y luego a verde oscuro. Durante estos estados su actividad
fotosinttica cambia dado a la acumulacin de clorofila en los tejidos. Las
ramas de un mismo rbol no crecen al tiempo por lo cual es corriente ver el
rbol en diferentes estados de desarrollo y florecido todos los aos. (Salazar,
1992).

La flor se presenta en paniculas ramificadas, provenientes de yemas
terminales; el nmero de flores por panicula puede variar de 300 a 2.000,
dependiendo de la variedad. Las flores tienen un pednculo muy corto: el
cliz se forma de 5 spalos libres, verdosos, de 2 a 4 mm de largo y de 1 a 2
mm de ancho; los ptalos tambin libres y caedizos miden de 3 a 6 mm de
largo por 1 a 2 mm de ancho y tienen pice agudo y curvo. Los rboles
provenientes de semilla florecen de 6 a 8 aos despus de sembrados,
mientras que los injertados florecen en la mitad del tiempo. La floracin en
mango tiende a ser alterna o bianual. (Cartagena, 2001).

El fruto es una drupa con endocarpio duro, del cual salen fibras que se
extienden a travs de la pulpa. Vara considerablemente en tamao, color,
forma, sabor y olor, as como en la cantidad de fibra en la pulpa y en sus
caractersticas qumicas. El mesocarpio es firme, con jugo dulce y de un
17
exquisito sabor, su color vara de amarillo cremoso a naranja oscuro.
(Cartagena, 2001).

El mango se caracteriza por una elevada cada de flores completas y frutos
jvenes, llegando a ser hasta del 99%. Algunos autores aseguran que solo el
0.1% de las flores bisexuales llegan a producir fruto maduro. La mayor cada
de frutos se presenta en las tres primeras semanas. (Cartagena. 2001). El
mango comn o hilacha tiene un fruto alargado que se caracteriza por tener
la pulpa fibrosa. Es conocido tambin como Hilaza, brechoso, mango de
puerco, dependiendo de la zona de produccin. (ICONTEC, 2002).

2.1.2. Condiciones Agroecolgicas

El mango puede prosperar en zonas subtropicales, donde la temperatura
promedio es de 15C, es muy sensible a bajas temperaturas mostrando una
reduccin de crecimiento. Los suelos muy alcalinos daan el cultivo, los
lmites del pH para el cultivo de mango estn entre 5.5 y 7.5. Por tener un
sistema radicular profundo, las caractersticas del subsuelo y el nivel fretico
se deben tener en cuenta. (Salazar, 1992).

El mango fructifica en zonas en donde la precitacin vara de 240 a 1500
mm. No es tan importante la cantidad de agua ni el volumen final del ao,
sino su distribucin durante el ao. La humedad relativa es uno de los
factores limitantes para el mango porque favorece el desarrollo de
enfermedades; por esta razn se debe desarrollar en climas secos, donde la
humedad relativa sea baja. Todos estos aspectos de altura, temperatura,
humedad relativa y precipitacin indican que el cultivo de mango es exigente
en radiacin solar para el buen desarrollo de los frutos, de manera que
presenten excelente calidad y color. (Cartagena, 2001).
18

Los suelos de Tolima y Huila sembrados con mango son arenosos con un
pH que oscila entre 6.5 y 7.2 y su fertilidad es medianamente alta. Estas
regiones se encuentran ubicadas entre los 380 y 600 m.s.n.m., la
temperatura promedio es de 28C y la humedad relativa promedio es de
68%, el promedio de lluvias est entre 1000 y 1300 mm anuales. (Cartagena,
2001).

2.1.3. Plagas y Enfermedades

En la actualidad el cultivo de mango se ve afectado por innumerables plagas
y enfermedades, las plagas mas importantes que afectan el cultivo de mango
son: Mosca de la fruta Anastrepha sp., el falso piojo blanco Aulacaspis
tubercularis, la escama articulada Selenaspidus articulatus y los comedores
de hoja Megalopyge lanata. Entre las enfermedades fungosas se encuentra
la antracnosis que es la principal enfermedad que ataca los mangos en
Colombia y el agente causal es C. gloeosporioides (ICA, 1996).

2.2. Agente Causal de la Antracnosis

Colletotrichum sp., es considerando el principal agente causal del deterioro
en precosecha y poscosecha de muchos frutales tropicales y subtropicales
(Bernstein et al., 1995); de acuerdo con numerosas investigaciones, la gran
mayora de estas enfermedades se atribuyen a ataques del hongo C.
gloeosporioides (Zulfiqar et al, 1996), sin desconocer que tambin causa
daos en otros tejidos de la planta; sin embargo es durante la poscosecha
donde mayores prdidas econmicas se generan en todo el mundo (Ploetz, y
Prakash, 1997).
19

2.2.1. Taxonoma

Segn Arauz, (2000) la antracnosis en mango es causada por el hongo
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc (anaformo),
Glomerella cingulata (Telemorfo) Spauld. & H. Schrenk.

2.2.1.1. Estado Telemorfo

REINO Fungi
SUBDIVISION Ascomicotyna
CLASE Pyrenomicetos
ORDEN Sphaeriales
GENERO Glomerella
ESPECIE cingulata

2.2.1.2. Estado Anamorfo

REINO Fungi
SUBDIVISION Deuteromicotina
CLASE Deuteromycetes
ORDEN Melanconiales
GENERO Colletotrichum
ESPECIE gloeosporioides

20
2.3. Generalidades

Colletotrichum es un habitante muy comn en cultivos y con frecuencia no
ocasiona sntomas de enfermedad en los rganos de la planta; en los frutos
de algunas especies frutales solo se manifiesta cuando el pericarpio es
debilitado, o cuando ocurren aumentos en los niveles de etileno como
resultado de procesos de maduracin de los frutos. (Adoskaveg y and Hartin,
1997).

Este hongo presenta un micelio septado de coloracin hialina o castaa
clara, los acrvulos separados tienen forma de disco o cojn, de textura
cerosa y puede ubicarse en forma subepidermal, epidermal o subcuticular.
Tpicamente presenta setas o espinas negras en los bordes o entre el
conidiforo; los acrvulos estn formados por pseudoparnquima con
paredes delgadas o gruesas, conidiforos simples, elongados con
numerosas conidias. Las conidias son hialinas, curvadas y fusiformes, y por
lo general un acrvulo setoso. Las conidias son producidas en estructuras
especializadas llamadas acrvulos, que se forman en la superficie de los
tejidos infectados. (Barnett ,1998 y Holliday, 1995). El gnero Colletotrichum
tiene enorme variacin ecolgica, morfolgica y patolgica, las diferentes
formas en la naturaleza varan desde saprofito a cepas parasticas con un
estrecho rango de hospederos (Mena, 1999).

Las conidias son producidas en masas mucilaginosas tpicamente hundidas,
de color rosado y con un contorno irregular en las lesiones necrticas, este
tipo de lesiones que con frecuencia se observa sobre las hojas, frutos y
ramas son las conocidas como antracnosis; sin embargo en algunos frutos
tambin es frecuente observar lesiones como chancros, cicatrices, verrugas
o costras con relieve. (Mena, 1999).

21
Una caracterstica de algunas especies de Colletotrichum, es que pueden
causar infecciones latentes o quiescentes sobre los frutos, que
posteriormente se desarrollan durante la fase de maduracin. Las diferentes
especies sobreviven por largos periodos sobre los desechos vegetales o en
el suelo; el patgeno mas comn en los trpicos es Colletorichum
gloeosporioides. (Holliday, 1995).

Las infecciones quiescentes en el contexto de enfermedades de poscosecha
involucra la inhibicin del desarrollo del patgeno a travs de condiciones
fisiolgicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado
de maduracin. Una vez el hongo penetra la capa exterior del fruto, este
permanece all en estado de quiescencia o dormancia hasta que ocurren
cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan las condiciones
adecuadas para permitir una infeccin (Contreras, 2006).

2.4. Desarrollo de la enfermedad

El inculo del microorganismo que ha sobrevivido en hojas, frutos y ramas
afectadas causa las infecciones de los frutos por la dispersin de las conidias
transportadas en el agua. (Adoskaveg y Hartin, 1997). Una vez dispersas las
conidias se adhieren a la superficie del hospedero y germinan en un periodo
de 12 a 24 horas y luego produce tubo germinal que penetra la cutcula
directamente. Las fuentes de inculo son las conidias producidas en
acrvulos o las ascosporas producidas y liberadas en el peritecio. (Figura 1.).
La hifa infectiva penetra directamente la cutcula colonizando la pared celular
de las clulas de hospedero (Kuo, 1999). Existen varias formas de
penetracin, una de ellas es a travs de aberturas naturales como estomas,
lenticelas y otras por penetracin directa o a travs de pequeas heridas.
22

Figura 1. Ciclo de vida de la enfermedad de Antracnosis causada por Glomerella cingulata y
Colletotrichum gloeosporioides. Tomado de Agrios 2002.

La infeccin se puede desarrollar casi en cualquier tejido de la planta. Una
vez el microorganismo penetra la cutcula, se pueden presentar dos
estrategias de infeccin: la primera es conocida hemibiotrofa intracelular y la
segunda necrotrofa subcuticular e intramural. (Agrios, 2002).

Muchas especies de Colletotrichum presentan procesos infectivos en dos
fases: la fase asintomtica inicial, donde el patgeno se establece en los
tejidos sin matar las clulas y son consideradas especies biotrficas
(hemibiotrofia intracelular) y la fase destructiva visible (necrotrofa
23
subcuticular e intramural), donde el patgeno crece bajo la cutcula y disuelve
extensamente la matriz pptica de las clulas epidermales (Bailey, 1992). El
desarrollo intramular se asocia a la hinchazn y disolucin de las paredes
celulares (OConnell et al., 2000).

En condiciones favorables, el hongo puede crecer rpidamente en la planta y
causar diversos sntomas muy rpidamente, pero en otras circunstancias el
hongo puede permanecer quiescente dentro de los tejidos por un largo
periodo, que en algunos casos solo se evidencia despus de la cosecha
(Figura 2.). Pero tambin durante periodos de condiciones ambientales
extremas, puede permanecer en latencia por algn tiempo en el suelo o
permanecer por largos periodos sobre tejido vegetal muerto (CABI-EPPO,
1996).

2.4.1. Infecciones quiescentes

Una de las caractersticas destacadas de Colletotrichum sp., es su capacidad
de sobrevivir en estado de dormancia o quiescencia cuando las condiciones
ambientales o fisiolgicas del hospedero le impiden desarrollarse (Figura 2.).
Los cambios bioqumicos que ocurren durante la maduracin el fruto, se
creen que son los que permiten que la infeccin continu su curso. En
aguacate, el cambio en los compuestos antifngicos llamados dienes, son
importantes en la regulacin de la quiescencia de la antracnosis. (Prusky,
1996).

24

Figura 2. Proceso de las infecciones quiescentes en Mango. Tomado de (Arauz, 2000).

25

Segn Yerhoeff (1974), una relacin parastica latente o quiescente, se
define como una condicin en la cual el patgeno reduce su actividad
metablica, deteniendo el proceso de infeccin por un periodo considerable
durante la vida del hospedero, que se reactiva cuando las circunstancias
fisiolgicas o ambientales especficas lo permitan. De Lapeyre (2000), define
el estado quiescente del hongo como la circunstancia en la cual una espora
que entra en contacto con la superficie del fruto, germina y forma un
apresorio que se melaniza y permanece inactivo hasta la maduracin del
fruto.

Segn Swimburne (1983), un organismo se puede tornar quiescente en
cualquiera de las siguientes etapas de su vida: en germinacin, elongacin
del tubo germinativo, formacin del apresorio y penetracin. Un punto de
infeccin se desarrolla cuando la hifa penetra la cutcula y la pared celular del
hospedero, con la ayuda de enzimas cutinasas y celulolticas. La fase latente
puede ser corta como ocurre en las enfermedades de floracin, y de dos o
tres semanas a varios meses, como ocurre en frutos. (Bailey, 1992). En la
permanencia de la latencia del patgeno dentro del hospedero hay una
dinmica de equilibrio entre el hospedero, el patgeno y el ambiente; de tal
manera que los cambios fenolgicos y fisiolgicos en el hospedero, en el
ambiente o en ambos, conllevan a la prdida del equilibrio establecido y
permiten que el patgeno continu su ataque. (J arvis, 1994).

Flaishman y Kolattukudy (1994) indican que la participacin del etileno en la
terminacin de la quiescencia, se debe a la habilidad de Colletotrichum sp.
para desarrollar un mecanismo donde usa la hormona de la maduracin del
hospedero como seal para reactivar el proceso de infeccin. Este
mecanismo evita el contacto del patgeno con tejidos del hospedero que
tienen altos niveles de compuestos antifngicos (Figura 3.)
26

INFECCIONES QUIESCENTES

PATGENO INTERACCIN HOSPEDERO

Infeccin Desarrollo del
Invasin RESISTENCIA fruto

Quiescencia
Fruto en maduracin

Estimulo Periodo
Reactivacin del Climatrico
Patgeno

Fruto maduro
Invasin ENFERMEDAD

Figura 3. Eventos entre el patgeno y el hospedero dentro de la infeccin quiescente en
frutos por C. gloeosporioides. Adaptacin de Arauz, 2000.

Existen varias condiciones que promueven la quiescencia como condiciones
fsicas adversas como el inapropiado almacenamiento de frutos, daos
fsicos, mecnicos, plagas, estrs y cambios climticos bruscos en campo; y
condiciones fisiolgicas como deficiencia nutricional y cambios fisiolgicos en
la maduracin del fruto. (Swinburne, 1983). Las infecciones latentes han sido
reportadas en frutas como ctricos (Zulfigar et al, 1996), en tomate de rbol
(Rondn, 2003) y en mora de castilla (Forero de la Rotta, 2001). C.
gloeosporioides, ha sido asociado con infecciones quiescentes y de
poscosecha sobre frutos como mango, aguacate, papaya, maracuy,
guayaba, ctricos, uva, granadilla, manzana y mora. (ICA, 1996).

Reduccin en
Compuestos
Antifungoso

Etileno

Factores
Nutricionales
27

2.5. Sntomas

Colletotrichum sp. causa numerosas enfermedades en un amplio rango de
plantas a nivel mundial, tanto en precosecha como en poscosecha. En
poscosecha predomina en los trpicos, donde es un factor limitante en la
calidad de los frutos ocasionando grandes prdidas en la comercializacin
interna y en los mercados internacionales. El efecto del hongo en el
rendimiento radica en el hecho que afecta frutos en todos los estados de
desarrollo, los cuales se desechan en el momento de comercializacin
(Cartagena & Vega, 2001).

En plantas de mango (M. indica), se presentan primero en las panculas
florales, con pequeas manchas de color negras o cafs, que se van
agrandando y pueden causar ennegrecimiento total de la inflorescencia y
marchitamiento antes que el fruto inicie su formacin. Los sntomas en la
superficie del fruto son manchas hundidas de color negro (Figura 4.),
presentando un alto grado de severidad despus de periodos de clima
hmedo (Allende-Molar y Cols, 2003).

28

Figura 4. Frutos de Mango. A: Fruto sano, B: Fruto con lesiones de antracnosis. (Foto
L.Parra).

En los frutos jvenes se producen pequeas lesiones hundidas, mientras en
los grandes (4-5 cm), por lo general no hay desarrollo de la enfermedad, pero
el hongo permanece en estado de quiescencia hasta que los frutos maduran
y aparecen las lesiones oscuras, necrticas, angulares o de forma irregular.
En todos los casos el desarrollo de la enfermedad va acompaado de masas
de conidias de color salmn como consecuencia de la maduracin del
acrvulo.

2.6. Condiciones epidemiolgicas

Aunque se han realizado varias investigaciones acerca de la epidemiologa
de esta enfermedad en mango, dichos estudios se han concentrado en las
relaciones entre variables del clima y la cantidad de la enfermedad en el
cultivo. La infeccin ocurre cuando el fruto se desarrolla o durante los
periodos de cosecha, pero por lo general permanece en estado de
quiescencia hasta la maduracin del fruto. En el cultivo, el desarrollo del
hongo se ve favorecido por condiciones ambientales como humedad relativa
A
B
29
del 96% con temperaturas entre 10-30C, ocasionando lesiones sobre hojas,
ramas e inflorescencia momificadas. (Bailey, 1992).

Existe una correlacin importante entre la precipitacin en todo el ao y el
desarrollo de la enfermedad, demostrando que el hongo es dependiente de la
precipitacin y la humedad relativa para su germinacin, desarrollo y
dispersin. (lvarez, 1996). Para el desarrollo de la enfermedad se requiere
agua durante todas las etapas, de esta manera la esporulacin no solo
necesita altos niveles de humedad (95%), sino que la liberacin y dispersin
de las esporas es dependiente del agua libre y se requiere de
aproximadamente cuatro horas mas de humedad a temperaturas ptimas de
20-25C; la ubicuidad de la fuente de inculo tiende a sobrepasar cualquier
restriccin en el desarrollo de la enfermedad que pueda imponer el agua.
(lvarez, 1996).

La variabilidad en la latencia del patgeno representa una adaptacin muy
importante a las condiciones fisiolgicas de los tejidos y los patrones
climticos que ocurren durante el ciclo de cultivos perennes. Debido a esta
variabilidad el impedimento para tomar medidas de control exitosas se
dificulta. (Waller, 1992).

Los estudios realizados en tomate de rbol por Rondn (1998), determinaron
que las hojas, los pednculos, las ramas jvenes, los racimos, botones,
flores, spalos de la flor y los frutos en cualquier estado, son tejidos
potencialmente susceptibles al hongo.

30

2.7. Mtodos de Diagnstico

Las herramientas moleculares han ganado gran aceptacin en los ltimos
aos, siendo empleados para diferenciar entre poblaciones de Colletotrichum
en diferentes hospederos y tambin para diferencias entre especies y
subespecies que no se permite con las tcnicas tradicionales. Las tcnicas
moleculares ms utilizadas son: anlisis de las regiones codificadoras del
DNA ribosomal (ITS), realizando amplificaciones va PCR (Polymerase Chain
Reaction) con cebadores o primers especficos. Anlisis de polimorfismo en
DNA nuclear con marcadores moleculares RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNAs) y AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) al
interior de la especie, para determinar la posible existencia y los niveles
aparentes de variabilidad gentica en la poblacin, adems del anlisis de
enriquecimiento de A+T-rich DNA asociado con (mt) DNA (Freeman et al.,
1998).

Los mtodos tradicionales son empleados aunque en algunos casos no
permiten diferenciar entre especies y subespecies de Colletotrichum. Para
las especies C. acutatum y C. gloeosporioides, algunas caractersticas como
la velocidad de crecimiento y color predominante de la colonia en medios
selectivos, la susceptibilidad o la tolerancia que presenta el patgeno en el
medio suplementado con el fungicida benomyl y la prueba cualitativa de la
proteasa (Martn & Garca-Figueres, 1999), por la produccin de enzimas
extracelulares que hidrolizan la caseina de la leche generando halos
transparentes de 3 a 4 mm sobre el medio de cultivo, permitiendo diferenciar
entre C. acutatum y C. gloeosporioides (Freeman et al., 1998; Peres, et al;
2002 y Abang et al., 2003).

31

2.9. Control

El control qumico es el ms comn debido a la importancia econmica del
cultivo. Se disponen de muchos qumicos, entre los ms utilizados se
encuentran compuestos como: dithiocarbamato, benzamidazoles y triazoles;
y otros fungicidas como chlorothalonil, imazalil y prochloraz. Los fungicidas
sistmicos son tiles y ampliamente utilizados, pero es mejor alternarlos con
aplicaciones de productos de accin protectante (Pez, 2006).

Es necesario planificar las aspersiones con los fungicidas que por lo general
inician antes de la floracin y continua hasta que el fruto este en procesos de
maduracin. Las aplicaciones se hacen con intervalos de 7, 14, 21 o 30 das
dependiendo de la frecuencia de la lluvia. Los productos comerciales mas
empleados son benlate 07 (1g/L), dithane M45 y oxicloruro de cobre (2-3g/L),
mezclados con un adherente (sulfatante HA o superstiker), para asegurar la
cobertura apropiada de la superficie cerosa del follaje y fruto. (Sena, 2006).

En los controles culturales se emplean podas que ayudan con el rpido
secado de la copa del rbol. La reduccin de daos mecnicos o fisiolgicos
por el ataque de otras plagas, disminuyen las infecciones secundarias por el
hongo. (Pez, 2006).

32
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

El rea dedicada al cultivo del mango, es mayor ao tras ao a nivel mundial
y nacional es as como en el ao 2005, segn cifras del Ministerio de
Agricultura, existen aproximadamente 13.900 has de mango cultivado en 14
departamentos, las cuales producan alrededor de 170.000 toneladas
anuales de diferentes variedades. Los departamentos en los que se
concentra la mayor produccin de mango son Tolima y Cundinamarca,
seguidos de Antioquia, Bolvar y Magdalena. En el periodo de 1992 al 2003
en conjunto, estos 4 departamentos, han cultivado entre el 70 y el 80% del
rea cultivada a nivel nacional; mientras que la produccin en el mismo
periodo fue entre el 62 y el 83%. (Ministerio de Agricultura 2005).

El cultivo de mango presenta mltiples problemas fitosanitarios, la
antracnosis es una de las enfermedades ms importantes y la mas frecuente,
sobre todo en regiones con temperaturas y humedades relativas elevadas.
(Fitzell y Peak, 1984).

En Colombia la antracnosis se encuentra diseminada en todas las zonas
productoras de mango, afectando la mayora de variedades de mango
cultivadas. En la actualidad las variedades criollas, azcar e hilacha, son las
que ofrecen grandes ventajas en comparacin con variedades mejoradas y
que si son bien utilizadas por los cultivadores, pueden liderar el mercado, la
comercializacin y el precio del mango a nivel nacional; ya que poseen
resistencia a plagas y enfermedades, no exigen un manejo agronmico
estricto y presentan caractersticas ptimas para la obtencin de pulpa
(Cartagena & Vega, 2001).

El estudio de infecciones quiescentes causadas por Colletotrichum sp. es de
gran importancia, ya que conocer su dinmica e incidencia de acuerdo con
33
los diferentes estados de desarrollo del fruto, permite desarrollar las
estrategias de control. A pesar de que estas infecciones se inician en el
campo y solo se desarrollan cuando el fruto madura, ocasionan grandes
prdidas en el momento de su comercializacin.

34
4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar la relacin entre el estado de desarrollo de frutos de mango
variedad hilacha y la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum
gloeosporioides.

4.1 OBJETIVOS ESPECIFICOS

4.2.1. Determinar la incidencia de infecciones quiescentes de Colletotrichum
gloeosporioides en cada uno de los estados fenolgicos del fruto.

4.2.2. Confirmar mediante pruebas biolgicas la patogenicidad del agente
causal de las infecciones quiescentes encontradas en los frutos recolectados.

4.2.3. Determinar las variaciones del pH de los frutos enfermos durante los
diferentes estados de maduracin.

35
5. MATERIALES Y METODOS

5.1. Localizacin de la investigacin

El estudio se adelant entre los meses de noviembre 2007 y febrero 2008,
analizando la presencia y cantidad de infecciones quiescentes en frutos de
mango variedad hilacha en los estados fenolgicos, muestreados cada 25
das en los lotes del Centro de Investigacin Nataima de la Corporacin
Colombiana de Investigacin, CORPOICA que se encuentra ubicado en el
departamento del Tolima, municipio de Espinal, donde la temperatura
promedio anual est en 28 C, con una precipitacin de 1300 mm al ao, una
humedad relativa del 70%, 430 m.s.n.m de altitud y presenta una ubicacin
de 4 12 de latitud norte y 74 56 longitud oeste. (IDEAM, 2006).

La investigacin se desarroll en las instalaciones de Fitopatologa del
Programa Manejo Integrado de Plagas de CORPOICA, Tibaitat, ubicado en
el municipio de Mosquera (Cundinamarca), km 14 de Bogot, D. C. (N 4 42',
W 74 12'; 2543 msnm). Los ensayos realizados permitieron detectar y
cuantificar las infecciones quiescentes y mediante pruebas biolgicas se
determin el agente causal de la antracnosis. Despus de haber establecido
el comportamiento de las infecciones quiescentes en los fruto de mango, se
desarrollaron pruebas para determinar el pH en frutos y as establecer una
posible relacin entre las infecciones quiescentes y los valores de pH.

36
5.2. Muestreos de frutos

Los frutos se seleccionaron en un lote de rboles de mango variedad hilacha,
de 15 aos de edad, al los que generalmente se les realiza podas de
formacin y un control peridico de malezas.

El nmero de frutos que fueron muestreados corresponden al tamao mnimo
de muestra que permite un anlisis estadstico adecuado con un error
experimental de 0.05. Se realizaron 4 muestreos entre los meses de
Noviembre 2007 y Febrero 2008, con intervalos de 25 das para facilitar la
seleccin de los frutos en el campo, y de acuerdo con la metodologa
sugerida por Medilicott et al (1986), con algunas modificaciones, en cada
muestreo se colectaron al azar 112 frutos (aparentemente sanos) en
diferentes estados de desarrollo, (Tabla 1.); para el muestreo se tomaron
frutos de los estados E1, E2, E3 y E4. (Figura 5.).

Los frutos colectados fueron empacados en papel dentro de bolsas plsticas
una vez removidos del rbol y se colocaron en una nevera de icopor, para su
transporte al Laboratorio de Fitopatologa del Centro de Investigacin de
Tibaitat.

37
Tabla 1. Etapas fenolgicas de los frutos de Mango, de acuerdo con la edad, dimensiones,
peso y otras caractersticas. Modificacin de Medilicott, Mohinder, y Reynolds, 1986.

ETAPAS DIAS
LARGO
(cm.)
ANCHO
(cm.)
PESO
(g)
CARACTERISTICAS ESTADO
FENOLOGICO
I 0-10 1.9 1.5 1-3
II 10-21 3.1 2.3 3-10
Altas tasas de respiracin y
crecimiento, mximo coontenido
de agua y rpido aumento de
nitrgeno y cidos, baja relacin
carbohidratos/nitrgeno.
E1 Fruto
pequeo verde
III 21-35 4.1 3.1 10-20
IV 35-49 5.6 4.1 30-40
Desarrollo de aromas y sabores,
tasas medias de respiracin,
aumento de la presin osmtica,
disminucin del contenido de
humedad y cada rpida de
glucosa y aumento de sacarosa.
E2 Fruto verde
oscuro
V 49-60 6.4 4.8 88
VI 60-72 8.9 6 92
Disminucin del contenido de
cidos, mnima respiracin y
disminuye contenido de nitrgeno.
E3 Fruto verde
claro
VII
72-
90
9.5 6.5 100
VIII
90-
120
10 6.5 100
Aumento de tasa de respiracin,
bajo contenido de humedad y
disminucin del crecimiento del
fruto
E4
Amarillamiento
(Maduro)

Figura 5. Estados Fenolgicos de Mango. E1, E2, E3 y E4. (Foto L. Parra).

E1 E2 E3 E4
38
5.3 Deteccin de infecciones quiescentes

Los frutos recolectados fueron lavados en tres oportunidades con agua
corriente, luego se desinfestaron por un minuto con hipoclorito de sodio al
2.6% y se lavaron dos veces con agua destilada; por ltimo se trataron con
alcohol al 70% y se lavaron nuevamente con agua destilada. Una vez secos
se llevaron a incubar en cmaras hmedas a temperatura ambiente.
(Cedeo, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).

Para el montaje de las cmaras se utilizaron contenedores plsticos
transparentes de 30 cm de ancho, 45 cm de largo y 17 cm de alto, con rejillas
plsticas previamente lavadas con detergente y agua, desinfestadas con
hipoclorito de sodio al 2.6% y asperjadas con alcohol antisptico. (Anexo 3).
La presencia de las infecciones quiescentes se evalu diariamente,
observando el tiempo de aparicin de los primeros sntomas de la
enfermedad (Reyes, A,. 2007).

El diseo experimental que se utiliz en el ensayo fue un diseo de bloques
completos al azar BCA, con cuatro repeticiones y cuatro tratamientos
correspondientes a los estados fenolgico. La unidad experimental estuvo
representada por una cmara hmeda con 7 frutos. Por cada tratamiento se
colectaron 28 frutos, para un total de 112 frutos.

5.4. Aislamientos de Colletotrichum sp.

A partir de los frutos que presentaron las lesiones caractersticas de la
enfermedad, con la ayuda de un bistur estril se tomaron fragmentos del
tejido enfermo de aproximadamente 5X5 mm, tratando de involucrar tejido
infectado (20%) y sano (80%); que posteriormente se sembraron en cajas de
39
Petri con (PDA) papa-dextrosa-agar (Anexo 2); se realizaron 2 repeticiones
por fruto, colocando cuatro fragmentos de tejido en la placa de agar.
(Cedeo, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995).

Las cajas sembradas se incubaron a temperatura ambiente (20C), durante
6 das, luego cada uno de los aislamientos obtenidos se le asign un nmero
consecutivo y con el fin de purificar el hongo, se resembraron por separado
en placas de PDA; simultneamente se realizaron observaciones
microscpicas coloreadas con azul de lactofenol para verificar las
caractersticas del hongo (Contreras, 2006). La taxonoma del hongo se
realiz con base a la clave para la identificacin de hongos imperfectos de
Barnett (2003) y las caractersticas registradas por Bailey (1992).

5.4.1 Purificacin de Aislamientos

Luego de confirmar que los aislamientos obtenidos pertenecan al hongo en
estudio, se realizaron cultivos monospricos de acuerdo a una modificacin
de la metodologa propuesta por Wang-Ching y Wen-Huising (1997), para
obtener colonias puras (Anexo 4). Para este fin se llenaron con 1 ml de agua
destilada estril 160 tubos de vidrio de 6x1.5 cm previamente lavados y
esterilizados. Con un asa estril se tom una pequea porcin de cada uno
de los aislamientos y se incorpor en los tubos, en donde con ayuda del
vortex se homogeniz la solucin. Para calcular la concentracin de 1
esporas/ml, se tomaron 10 l de la solucin y se sirvi en una cmara de
Nuebauer, en donde se cont el nmero de esporas localizadas en los 64
cuadros y posteriormente se estableci el volumen inicial para obtener una
concentracin final de 1 espora/l (Manual de procedimientos CORPOICA,
2001).

40
Se tomaron cajas con agar agua (Anexo 1) y en la base con un marcador de
vidrio se dividieron en 18 crculos aproximadamente de 7mm de dimetro
cada uno, para que una vez obtenidas las soluciones para cada aislamiento,
sembrar 1.7 l de la solucin en cada uno de los pozos. Las placas con agar
agua fueron incubadas por 24 horas a 27C en penumbra. Transcurridas las
24 horas se observ bajo el microscopio (40X) la superficie de la placa de
agar agua buscando una nica espora germinada, la cual se sembr en PDA
y se incub a 27C en penumbra, hasta obtener la colonia pura (Manual de
procedimientos CORPOICA, 2001).

5.5. Pruebas biolgicas

Las pruebas biolgicas se realizaron con el objeto de establecer la etiologa
del agente causante de las infecciones quiescentes observadas en los frutos
de Mango y su patogenicidad sobre frutos sanos.

5.5.1. Medio selectivo para Colletotrichum sp.

El medio selectivo para Colletotrichum sp., se compone de Hidrxido de
Cobre (CuOH2) como ingrediente activo (42mg /L Cu) y 300 mg/L de
estreptomicina (Anexo 7). El CuOH2 es un fungisttico que acta
desnaturalizando las protenas, a travs de la reactivacin de los grupos
sulfhdricos (Ware y Whitaker, 2000). Este medio permite una aproximacin
para clasificar los aislamientos obtenidos y visualizar algunas caractersticas
que pueden diferenciar estas dos especies de Colletotrichum sp., dentro de
las mas evidentes se tiene la coloracin predominante de la colonia y la tasa
de crecimiento (Abang, et al., 2003; Alvis, 2007).

41
Algunos investigadores plantean que la velocidad de crecimiento de la
colonia que se evala en este medio, puede ser rpida (fast) o lenta (slow) y
los colores predominantes de las cepas pueden ser naranja (orange), verde
(olive), gris (gray) y salmn (salmn). A partir de estos criterios de
evaluacin se pueden obtener las clasificaciones: FGG (Fast growing gray),
SGG (Slow growing gray), FGS (Fast growing salmon), SGO (Slow growing
orange) y FGO (Fast growing olive) (Abang, et al; 2003).

Estas caractersticas se utilizan para diferenciar al patgeno, entre las
especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten
clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO
y la clasificacin SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Tabla 2).

Tabla 2. Clasificacin de las especies segn los medios de evaluacin biolgica. (Abang et al., 2003).

Medio Selectivo Medio Benomyl Clasificacin
FGG Susceptible C. gloeosporioides
FGO Susceptible C. gloeosporioides
SGO Tolerante C. acutatum
SGG Susceptible C. gloeosporioides
FGS Susceptible C. gloeosporioides

5.5.2. Pruebas de Patogenicidad

Este ensayo tuvo como objetivo conocer la capacidad patognica que tienen
los diferentes aislamientos, para generar sntomas de la enfermedad sobre
frutos sanos. Se emplearon dos frutos por aislamiento y dos se dejaron como
42
controles; en todos los casos se realiz el proceso de desinfestacin de
frutos descrito anteriormente.

Posteriormente, sobre la parte media y superior de cada uno de los frutos se
les coloco un disco de agar con el aislamiento (Figura 6.), ya que mediante
las observaciones preliminares es la zona donde con mayor presencia se
presentan las infecciones quiescentes. Sobre los frutos usados como
controles se colocaron discos de agar estril, luego de la inoculacin se
colocaron en cmaras hmedas estas se mantuvieron a una temperatura de
18 C por un periodo de 10 das y diariamente se revisaron para observar
el momento en que se evidenciaran los primeros sntomas de la enfermedad.
A partir de las primeras lesiones se realizaron los aislamientos del
microorganismo para comprobar los postulados de Koch. (Cedeo et al..
1993).

Figura 6. Frutos de Mango sanos. A. Fruto sin bloques de agar y B, Fruto con bloques de
agar con micelio del microorganismo. (Foto, L. Parra).

A B
43
5.5.3. Prueba de susceptibilidad al Benomyl

De acuerdo a las metodologa que usaron (Pres, et al., 2005) para
identificar y conocer la susceptibilidad o la tolerancia que presentan las
especies de Colletotrichum sp. a este producto. Se utiliz la concentracin
del fungicida Benomyl (PDA + Benomyl 2g/ml), ya que las mnimas
concentraciones del fungicida fueron efectivas. Con base en la
susceptibilidad que presenta C. gloeosporiodes y la tolerancia de C.
acutatum. (Anexo 6) se diferenciaron las especies del patgeno. Para cada
aislamiento se realizaron dos repeticiones, una vez inoculadas las cajas se
incubaron por 72 horas en penumbra a una temperatura de 27C.

En este medio se evalu el dimetro de crecimiento de cada colonia
tomando como parmetro de comparacin el dimetro de crecimiento que
present el hongo en el medio PDA. Esto se hace con el fin de determinar el
porcentaje de inhibicin del microorganismo, al crecer en contacto con este
fungicida, respecto al control en PDA (Alvis, 2007).

5.5.4 Prueba de la Proteasa

Esta prueba ha sido utilizada para diferenciar las especies de de C. acutatum
y C. gloeosporioides. El medio hidrlisis de la casena (MHC) (Anexo 5),
permite establecer dos tipos de reaccin una positiva (+) y otra negativa (-).
El principio de esta prueba se basa en la produccin extracelular de la
enzima proteasa (prueba +), caracterstica de la especie C. acutatum, que
hidroliza la casena de la leche, en aminocidos y pptidos. Esta reaccin
ocasiona que en el agar, normalmente opaco por la leche se observen halos
transparentes alrededor del crecimiento de la colonia del microorganismo
(Paterson y Bridge, 1994).
44

Una vez preparado el medio de la hidrlisis de la casena (MHC) (Anexo 5) y
servido en las cajas de Petri estriles, se tomaron bloques de PDA con el
crecimiento micelial de cada aislamiento y se colocaron sobre la superficie
del medio MHC. Se realizaron 4 repeticiones por cada aislamiento (Martn &
Garca-Figueres, 1999); las lecturas se realizaron 24 horas despus de
iniciada la prueba. Para asegurar que el medio funcionaba se tomo como
control positivo una cepa de C. acutatum (c-852) y un control negativo con
una cepa de C. gloeosporioides (c-1042) caracterizadas molecularmente, que
se encuentran en la Coleccin Nacional de Colletotrichum del Laboratorio de
Fitopatologa de CORPOICA

5.6. Determinacin del pH en frutos sanos y enfermos de Mango.

De acuerdo con Prusky, Keen (1993), la transicin de una etapa biotrfica a
una necrotrfica en este grupo de microorganismos, parece estar relacionada
con factores que son modulados intracelularmente y son afectados por los
contenidos de nutrientes y el pH presente en el sustrato; por esta razn es
necesario conocer las variaciones de los niveles de pH en los diferentes
estados fenolgicos de los frutos, para de esta manera comprender la
dinmica de las infecciones quiescentes en la medida que se va
desarrollando el fruto.

En este trabajo, se estudiaron las variaciones del pH, con el fin de comprobar
que este es un factor estrechamente relacionado con el establecimiento de
una relacin parastica patgeno-hospedero. (Prusky, 2001).

45
Para esta prueba se colectaron para cada estado fenolgico, 4 frutos de
mango sanos y 4 enfermos, se lavaron tres veces con agua destilada (pH 7),
durante 10 minutos, luego se colocaron sobre papel peridico y se dejaron
secar a temperatura ambiente por un periodo de 30 minutos, para garantizar
un completo secado.

Luego con ayuda de un bistur, se removieron 0.5 mm. del exocarpio de los
frutos, en los enfermos por antracnosis se separ el exocarpio y mesocarpio
enfermo del sano; para evitar alteraciones de las lecturas, se dejo una
distancia de 3 cm. entre el tejido sano del afectado. El exocarpio se macer
en un mortero y una vez se obtuvo una pasta pura se realiz la lectura
directa del pH con ayuda de un potencimetro de (Beckam).

Para determinar el pH del mesocarpio tanto de rea enferma como sana, se
realiz un orificio de 2 cm de dimetro, en el cual se macer el tejido
circunvecino con ayuda de un cuchillo estril y una vez macerado el tejido se
introdujo el electrodo para la lectura del pH. En este caso los frutos
evaluados presentaron lesiones aceitosas de color negro, con bordes
definidos y centro deprimido.

Para establecer los valores de pH en frutos sanos de cada estado fenolgico,
se realizaron cuatro lecturas del exocarpio y cuatro lecturas del mesocarpio;
en los frutos enfermos se hicieron cuatro lecturas tanto del exocarpio sano y
enfermo, como del mesocarpio sano y enfermo. Para en anlisis estadstico
se empleo un diseo completamente al azar, evaluando un factorial de
4x3x2.

46
6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Aislamientos de Colletotrichum sp.

En este estudio se obtuvieron varios aislamientos del hongo y se agruparon
segn su color y crecimiento, obteniendo un total de 20 aislamientos (Anexo
10), que fueron clasificados dentro del gnero Colletotrichum de acuerdo a
las observaciones microscpicas realizadas, donde se identificaron las
estructuras del hongo (Figura 7). Los aislamientos se obtuvieron de
diferentes partes del fruto, confirmando lo encontrado en otros cultivos como
aguacate, guanbana, tomate de rbol, en donde el hongo fue aislado de
diferentes tejidos de la planta (Agostin, et al., 1992). Todos los aislamientos
tuvieron un buen crecimiento en PDA (Figura 8), lo cual concuerda con lo
propuesto por Agostin (1992), quien manifiesta que las especies de
Colletotrichum sp. no requieren de medios selectivos para su crecimiento.

Figura 7. Caractersticas microscpicas de C. gloeosporioides. A: Micelio y conidias del
hongo formadas en PDA, B: Conidias tpicas del microorganismo. (Foto L. Parra).

A
B
47
El crecimiento de las colonias se present en forma radial y de aspecto
algodonoso, el color predominante fue el gris y el oliva lo que indica segn
Contreras (2006) que pertenecen al gnero Colletotrichum sp. y a la especie
C. gloeosporioides (Figura 8); sin embargo se han demostrado incoherencias
entre las descripciones morfolgicas y los estudios moleculares para la
identificacin de especies de Colletotrichum sp. (Afanador, et al., 2003).

Figura 8. Aislamientos de Colletotrichum sp. En PDA. A y B Colonias obtenidas directamente
a partir de frutos enfermos, C y D colonias obtenidas de cultivos monospricos. (Foto L.
Parra).

A
B
C
D
48
6.2 Deteccin de Infecciones Latentes en frutos asintomticos de
Mango

Transcurrido el periodo de incubacin para cada estado fenolgico, se
observ sobre la superficie de los frutos, la presencia de lesiones de color
negro y hundidas, caractersticas de antracnosis tal como lo afirma (Allende-
Molar y Cols, 2003) (Tabla 3.).

Tabla 3. Das Transcurridos hasta que aparecieron las lesiones en los Diferentes Estados
Fenolgicos de Frutos de Mango.

Estado Fenolgico Tamao de Muestra
Periodo de Incubacin
(Das)
E1 28 10
E2 28 10
E3 28 15
E4 28 15

Se observaron infecciones quiescentes en todos los estados fenolgicos del
fruto de mango; en los estado fenolgico E1 y E2, el porcentaje de incidencia
fue superior al 75%, es decir que de un total de 112 frutos incubados en todo
el estudio, 84 frutos mostraron lesiones de infecciones quiescentes, mientras
que para los estados fenolgicos E3 y E4 la incidencia de las infecciones
estuvo por encima del 60%. (Figura 9). Estos resultados ratifican la presencia
de infecciones quiescentes de C. gloeosporioides en frutos aparentemente
sanos, lo cual coincide con los resultados obtenidos por Arauz, (2000).

49
81,13
79,05
64,75
60,68
0
20
40
60
80
100
E1 E2 E3 E4
Est ados Fenolgicos
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e

I
n
c
i
d
e
n
c
i
a

Figura 9. Porcentaje de infeccin quiescente de Colletotrichum gloeosporioides. en los
diferentes estados fenolgicos de frutos de mango.

Las diferencias en la incidencia de infecciones quiescentes de C.
gloeosporioides entre los cuatro estados fenolgicos no fueron
estadsticamente significativas (P>0.05); sin embargo biolgicamente se
evidenci mayor presencia de estas infecciones en los estados iniciales de
desarrollo del fruto. Se realizaron pruebas de validacin, normalidad y
comparacin de promedios para corroborar que no se presentaron errores y
las varianzas fueran homogneas. (Anexo 8 y 9).

El estado de quiescencia en varias frutas se debe a que las conidias de
Colletotrichum sp., germinan, forman el apresorio y penetran la cutcula;
posteriormente la hifa infectiva que permanece subcuticularmente en estado
de letargo metablico, no contina el proceso de infeccin hasta que las
condiciones ambientales y nutricionales sean las adecuadas, un ejemplo de
esto es la maduracin del fruto (Soriano, et al,. 2001).

50
Se podra sugerir que la fenologa del fruto tiene un efecto en la incidencia de
las infecciones quiescentes, siendo los frutos maduros menos susceptibles a
adquirir estas infecciones. Cuatro mecanismos han sido postulados para
explicar la presencia de Colletotrichum sp. como infeccin quiescente en
frutos inmaduros: a) Requerimientos nutricionales del patgeno, b)
Compuestos antifungales preformados presentes en frutos verdes que
disminuyen a medida que el fruto madura por un aumento en la actividad de
la enzima lipoxigenasa, cuya actividad es regulada por la presencia de
flavan-3-ol, epicatequin (compuesto fenolgico). Estos compuestos son el 1-
acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-henicosa-12, 15-dieno y el 1-acetoxi-2,4-dihidroxi-n-
heptadeca-16-eno., c) Presencia de fitoalexinas y compuestos preformados y
d) Factores de patogenicidad que pueden ser activados solamente en frutos
maduros. (Prusky, et al,. 1996).

Para que el hongo pueda penetrar la cutcula del fruto requiere de un
complejo enzimtico que le permita macerar la cutcula y penetrar en
exocarpio. Segn Wattad y Prusky (1994), la secrecin de enzimas
pectolticas responsables de la maceracin de la pared celular durante el
ataque de C. gloeosporioides, es un factor limitante durante la patognesis y
las condiciones que afectan la secrecin de estas enzimas, pueden evitar la
activacin del Colletotrichum sp. en la colonizacin de frutos inmaduros.

Otro factor que determina la relacin parastica hospedero-patogeno es el pH
del hospedero, que puede ser concluyente en la dinmica de las infecciones
quiescentes en los diferentes estados fenolgicos de los frutos de mango.
Yakoby et al,. (2000), sugieren que la secrecin de pectinasas estn
influenciadas por el pH, indicando que la susceptibilidad de los frutos est
regulada por decrecimientos de compuestos antifungales e incrementos en el
pH del pericarpio que modula la secrecin de pectinasas y otras enzimas. La
51
variacin en los niveles de pH explica el comportamiento de las infecciones
quiescentes en frutos de mango. (Reyes, 2007).

Las pectinasas de C. gloeosporioides son secretadas con valores de pH
mayores a 5.8, aunque tambin puede ser producida con valores de 5.1
(Prusky, et al,. 2001), lo que indica que cuando los niveles de pH del
hospedero son adecuados se puede iniciar el proceso de infeccin. A medida
que maduran los frutos de mango se van reduciendo los niveles de pH, lo
que sugiere que los inicios del proceso de infeccin ocurren en los primeros
estados de desarrollo del fruto.

La temperatura promedio semanal durante los muestreos fluctu entre 27C
y 28C, las cuales fueron favorables para el establecimiento de las
infecciones quiescentes, segn Arauz, (2000), temperaturas entre 20C y
30C, han sido reportadas como ptimas para la infeccin de C.
gloeosporioides. El hongo requiere una humedad relativa superior a 95%
para que las conidias germinen y se presente la formacin del apresorio
(Arauz, 2000). En este estudio la humedad relativa durante los muestreos,
estuvo entre 67% y 79%.

6.3 Medio Selectivo para Colletotrichum sp.

En esta prueba se obtuvieron colonias con crecimiento rpido y coloracin
gris y verde oliva (Anexo 13). Este medio permite clasificar los diferentes
aislamientos, entre estas dos especies de Colletotrichum sp., por medio de la
observacin de la coloracin que predomina en la colonia y la tasa de
crecimiento (Abang, et al., 2003; Alvis, 2007). El CuOH2 es un fungisttico
que acta desnaturalizando las protenas, a travs de la reactivacin de los
grupos sulfhdricos (Ware y Whitaker, 2000).
C
D
C
D
52
Las diferentes clasificaciones se utilizan para diferenciar al patgeno entre
las especies C. acutatum y C. gloeosporioides. Los criterios que permiten
clasificar a las cepas como C. gloeosporioides son: SGG, FGG, FGS y FGO
y la clasificacin SGO orienta hacia la especie C. acutatum (Figura 10).

Figura 10. Desarrollo de las colonias de Colletotrichum en los diferentes medios de cultivo:
A, Crecimiento sobre PDA, B, Medio selectivo para Colletotrichum sp.(CuOH2) y C, Medio
Benomyl (2l/ml) (Foto L. Parra).

6.4 Prueba de Benomyl

En esta prueba que permite diferenciar especies de C. acutatum y C.
gloeosporioides (Freeman, et al,.1998; Bernstein, et al,. 1995), se encontr
que todos los aislamientos fueron susceptibles al Benomyl (Anexo 11), por lo
tanto se considera que pertenecen a la especie C. gloeosporioides (Figura
10).
Estos resultados son similares a encontrados por Cern et al (2006) en
trabajos de investigacin realizados con aislamientos de las dos especies de
Colletotrichum que afectan los cultivos de lulo (Solanum quitoense L.).

A B C
53
El mecanismo de accin de los benzimidasoles consiste en inhibir el proceso
mittico fungoso, bloqueando al mismo tiempo la sntesis de cido
desoxirribonucleico (De la Isla, 1994). Los fungicidas sistmicos como el
benomyl son convertidos en las plantas al compuesto metil benzimidazol
carbamato, el cual interfiere en la divisin nuclear de los hongos que son
sensibles a sus componentes (Agrios, 2002).

En nuestro pas dentro de las prcticas de manejo de la antracnosis, se
utiliza con frecuencia el producto, el cual slo es efectivo en el control de la
enfermedad cuando el agente causal es C. gloeosporioides (Pez, 2006), por
lo cual es necesario que en el pas se inicie su manejo mediante diferentes
alternativas de control.

6.5 Prueba de la Proteasa

En las lecturas realizadas en el medio MHC se observ que todos los
aislamientos presentaron una reaccin negativa (-), que corresponden a C.
glooesporioides (Anexo 12). Esta prueba ha mostrado ser una forma rpida y
til para diferenciar entre especies de C. gloeosporioides y C. acutatum
(Martn & Garca-Figueres, 1999). La respuesta positiva consisti en que en
el medio se observ la formacin de un halo transparente alrededor del sitio
de contacto con el aislamiento del hongo y cuando no se observ algn
cambio en el medio, la reaccin se tomo como negativa (Figura 11).

54

Figura 11. Prueba de la Proteasa. A. Respuesta negativa sin halo transparente
caracterstica, de la especie gloeosporiodes. B. Respuesta con halo transparente, tpica de
acutatum. (Foto, L. Parra).

Los hongos patgenos de plantas utilizan diferentes enzimas capaces de
destruir los componentes estructurales de los tejidos vegetales ocasionando
la muerte celular. Estas enzimas degradan carbohidratos que disuelven la
pared celular e hidrolizan la cutcula. Existen otras enzimas que degradan la
pared celular como las pectinliasas y proteasas que son consideradas
indispensables para la colonizacin de las plantas por parte del patgeno
(Bailey, et al,. 1992). En el caso de las proteasas, cuando el patgeno
secreta estas enzimas, inactiva los componentes protenicos de respuesta de
defensa de las plantas tales como las quitinas y la - 1,3 glucanasa. (Cern,
2004).

A B
55
6.6 Pruebas de Patogenicidad

De los frutos evaluados cuando se emplearon discos de agar con el
crecimiento del microorganismo, el 100% mostraron los sntomas
caractersticos de antracnosis. Los primeros sntomas se identificaron como
puntos superficiales necrticos de color caf oscuro y negro, que
posteriormente ocasionaron el hundimiento en la zona central, como se
puede observar en la Figura 12 (A y B). El reaislamiento del patgeno a
partir de los frutos con sntomas confirm la presencia del mismo
comprobando los postulados de Koch.

En los aislamientos caracterizados como C. gloeosporioides segn las
pruebas de Benomyl, proteasa y medio selectivo para Colletotrichum spp.
causaron en los frutos los sntomas inicialies de antracnosis a los 4 das en
su gran mayora y algunos con 7, 5 y 9 das. (Anexo 14)

La humedad de los tejidos permite que la conidia germine, forme apresorio y
se desarrolle la enfermedad, condicin que al igual que en otras especies de
frutos favorece el desarrollo del microorganismo. (Arauz, L. F. 2000).

Figura 12. Frutos de Mango con lesiones de antracnosis. A, Lesiones primarias y B,
Lesiones avanzadas. (Foto, L. Parra).

A B
56
6.7 Determinacin de pH en frutos sanos y enfermos de Mango

Segn Lakshminarayana et al (1970) los frutos de mango en sus primeros
estados son cidos y altamente astringentes, con mayor desarrollo presentan
un contenido alto de polifenol y conservan la astringencia, sin embargo
alrededor de las ocho semanas presenta una reduccin de polifenoles y
luego permanece estable. El cido ascrbico aumenta rpidamente
alcanzando su mximo a las cinco semanas, declina a las ocho semanas y
permanece estable hasta cosecha, pero al colocar en condiciones de
maduracin frutos cosechados con seis, ocho, once y trece semanas de
desarrollo, se encontr que con mayor tiempo se tornaban altamente cidos.
(Lakshminarayana et al 1970).

Coincidiendo con los resultados obtenidos en este estudio, ya que mostraron
que a medida que el fruto madura, los niveles de pH tanto en el exocarpio
como en el mesocarpio, disminuyen hacindose mas cidos (Tabla 4.). Al
comparar estos resultados, con los obtenidos por Lagos et al (1989), en un
estudio sobre mango de la variedad Kent, encontramos que son similares,
indicando que los valores de pH disminuyen en los frutos maduros.

Tabla 4. Valores de pH de Frutos Sanos de Mango en los diferentes Estados Fenolgicos,
en Exocarpio y en Mesocarpio.

FRUTOS SANOS
pH Exocarpio pH Mesocarpio
FRUTOS E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4
1 5,20 5,00 5,10 4,20 5,12 4,95 4,32 4,12
2 5,40 5,20 4,60 3,50 4,91 4,63 4,45 3,95
3 5,80 5,00 4,50 3,70 5,11 4,78 4,23 3,74
4 6,00 5,50 5,00 3,30 4,52 4,45 4,12 3,35
Media 5,6 5,2 4,8 3,7 4,9 4,7 4,3 3,8

57
Algunos factores como el pH juegan un papel importante en el desarrollo de
la enfermedad, ya que sus variaciones de acuerdo con la fenologa del fruto
sirve como una barrera y un mecanismo de defensa contra patgenos. De
esta manera el patgeno supera la barrera del exocarpio y las esporas
germinadas melanizan el apresorio, no solo por la reduccin del pH que se
observa en el mesocarpio (Tabla 4), sino por la alta concentracin de
compuestos antifungosos presentes en los frutos inmaduros (Prusky, et al
2001). Esta condicin de quiescencia permanece hasta la maduracin del
fruto, donde los contenidos nutricionales y su fisiologa le permiten al
patgeno activar sus mecanismos de patogenicidad.

El pH tanto del exocarpio como del mesocarpio de los frutos enfermos con
antracnosis, muestran valores mayores comparados con los frutos sanos
(Tabla 5), tal como lo describe Prusky et al (2001) en frutos de aguacate,
donde los niveles de pH aumentan por la secrecin local de amonio
corroborando que C. gloeosporioides tiene la capacidad de aumentar los
niveles de pH.

Tabla 5. Valores de pH de Frutos Enfermos de Mango en los diferentes Estados fenolgicos,
en Exocarpio y Mesocarpio en reas sanas y enfermas.

FRUTOS ENFERMOS pH EXOCARPIO FRUTOS ENFERMOS pH MESOCARPIO
SANO ENFERMO SANO ENFERMO
FRUTOS E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4 E1 E2 E3 E4
1 6,12 5,87 6,00 5,13 7,45 7,16 6,57 6,87 4,87 5,12 4,25 4,42 5,74 6,54 6,63 6,54
2 6,00 5,90 5,12 5,00 8,13 7,11 6,51 6,54 4,32 4,98 4,33 4,40 6,32 6,98 5,98 6,33
3 5,98 6,00 6,10 5,56 7,74 6,98 7,14 7,00 5,00 4,69 4,33 4,69 6,52 6,21 6,54 6,98
4 6,00 6,00 5,54 5,85 7,98 6,47 7,00 7,00 4,68 4,25 4,18 4,21 6,13 6,87 6,87 6,41
Media 6 5,9 5,8 5,4 7,83 6,9 6,8 6,9 4,72 4,76 4,27 4,43 6,18 6,65 6,50 6,56

58
Con los resultados obtenidos tanto para el diseo factorial como en el diseo
de bloques al azar, hubo diferencia significativa mnima (Anexo 15 y 16),
entre el estado fenolgico y el rea donde se midi el pH (p<0.05) y
diferencia significativa entre el rea donde se midi el pH y el tejido
(Mesocarpio y Exocarpio). En la figura 13 A. se observa el comportamiento
de los valores de pH en frutos sanos y enfermos en reas sanas y enfermas,
tanto en exocarpio como en mesocarpio de frutos enfermos.

Los resultados muestran que el pH de frutos enfermos es superior a 6.0, y el
valor mnimo para que se active la secrecin de pectinasas y por ende la
degradacin de la cutcula, es de mnimo 5.1 (Yakoby et al 1999) situacin
que puede estar influyendo en la actividad del microorganismo. Tambin se
puede observar que los valores de pH del exocarpio en reas sanas de frutos
enfermos, se ve alterada por la presencia de C. gloeosporioides aumentando
el valor de pH con respecto al de un fruto completamente sano sin haber
diferencia estadsticamente significativa (p>0.05); en el mesocarpio esta
tendencia no se ve tan marcada. Las variaciones en los valores del pH en
reas sanas con respecto a enfermas, indican que el patgeno necesita
alterar el pH para poder superar barreras fisiolgicas impuestas por el
hospedero (Prusky, et al. 2001).

En la figura 13 B-C. se observa que el pH aumenta a medida que el fruto se
enferma y que dependiendo del estado de desarrollo del fruto, existe una
interaccin entre el valor del pH y el rea donde se realiza la evaluacin; es
decir que en frutos sanos los valores de pH del exocarpio y mesocarpio son
diferentes (p<0.05) y cuando el fruto est enfermo los valores de pH
cambian, siendo iguales en mesocarpio y exocarpio (p>0.05). En reas
sanas de frutos enfermos los valores de pH se comportan igual que en frutos
sanos.
59

B
A

A
60

Figura 13. Efecto de Antracnosis sobre el pH. A, Te: tejido enfermo, ts: tejido sano. Ts-fe:
tejido sano en fruto enfermo, exo: exocarpio y meso: mesocarpio. B, efecto sobre el pH en
mesocarpio y exocarpio. C, efecto sobre tejido tomado en el fruto. Te: tejido enfermo, ts-fe:
tejido sano en fruto enfermo y ts: tejido sano.

Con lo resultados obtenidos en este estudio se puede decir que a medida
que el fruto se desarrolla los valores de pH disminuyen dificultando la
penetracin del patgeno durante la maduracin del fruto; por lo tanto se
sugiere que los sntomas observados en los estados fenolgicos E3 y E4 son
el resultado de infecciones quiescentes que se formaron cuando el fruto se
encontraba en los estados fenolgicos E1 y E2.

C

61
La baja presencia de infecciones quiescentes en estados de desarrollo
avanzado del fruto, puede atribuirse a factores como, uso de fungicidas
sistmicos que pueden afectar al hongo, y el lavado natural del inculo por
encontrarse expuesto mayor tiempo a condiciones de campo. Adems como
en frutos maduros los niveles de pH son bajos, el patgeno no puede iniciar
la enfermedad y su actividad se ve limitada a las infecciones quiescentes o
latentes que persistieron a las condiciones adversas.

62
7. CONCLUSIONES

La incidencia de infecciones quiescentes en frutos de mango variedad
hilacha fue mayor en estados de desarrollo iniciales, y el periodo de
incubacin de las infecciones quiescentes fue en los estados E1 y E2 de 10
das y en los estados E3 y E4 fue de 15 das.

El color de las colonias obtenidas de los aislamientos en PDA fue de un
aspecto caracterstico reportados para el gnero Colletotrichum.

Los sistemas tradicionales de clasificacin con base en las caractersticas
morfolgicas, deben complementarse con otras pruebas para poder
determinar la especie dentro del gnero.

Las pruebas de la proteasa, sensibilidad al benomyl y crecimiento en medio
selectivo para Colletotrichum sp. permitieron establecer que los aislamientos
obtenidos de las infecciones quiescentes en los diferentes estados
fenolgicos correspondieron a la especie C. gloeosporioides.

Mediante las pruebas de patogenicidad se comprob que los 20 aislamientos
fueron patognicos en frutos de mango variedad hilacha y su presencia se
determin mediante la observacin de la expresin de sntomas sobre los
frutos.

A medida que el fruto se va desarrollando se disminuyen los niveles de pH,
dificultando la penetracin del patgeno, razn por la cual se observa una
abundante presencia de infecciones quiescentes en frutos pocos
desarrollados, comparados con frutos de fenologa avanzada.

63
El efecto que ejerce C. gloeosporioides sobre el pH es un factor de
patogenicidad que debe ser tenido en cuenta a la hora de realizar un control
y manejo sobre la antracnosis.

64
8. RECOMENDACIONES

Se debe investigar la incidencia de infecciones quiescentes sobre otros
tejidos o estructuras de la planta para saber si el microorganismo sobrevive
de forma quiescente ocasionando infecciones tempranas en frutos. Tambin
se debe evaluar durante los doce meses del ao para observar el tiempo en
donde ocurren los mayores porcentajes de enfermedad.

Realizar investigaciones relacionadas con el pH, ya que puede ser un factor
de patogenicidad importante para el control de la antracnosis.

Realizar investigaciones donde se conozcan las propiedades qumicas y
nutricionales de los frutos de mango a medida que se desarrollan, para
identificar factores que puedan controlar el desarrollo de infecciones por
parte de C. gloeosporioides.

65
9. REFERENCIAS

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73
ANEXOS

ANEXO 1. Preparacin del AGAR AGUA

Agar-Agar 15g
Agua Destilada 1000 ml

Esterilizar a 121C a 15 lb por 15 minutos

74

ANEXO 2. Preparacin de agar PDA

*Infusin de Papa 200g
Dextrosa 10g
Agar-Agar 20g

Ajustar el pH a 5.6
*Infusin de papa: preparada a partir de 200g de papa por litro.

75

ANEXO 3. Protocolo de Cmaras Hmedas

1. Objetivo
Crear condiciones favorables de humedad para el rpido desarrollo de
hongos que pueden estar involucrados en la produccin de sntomas de
enfermedad, pero cuya presencia no es detectada en el momento de la
primera observacin.

2. Alcance:
Este procedimiento se aplica para obtener crecimiento tanto vegetativo como
reproductivo de los microorganismos para su posterior anlisis

3. Materiales y Equipos:
Material vegetal
Hipoclorito 1%
Alcohol antisptico 1%
Bistur
Portaobjeto estril
Cinta scotch
Toalla de papel
Cajas de petri
Recipiente plstico desinfectado
Agua estril
Parafilm
Cuarto de crecimiento

76
4. Contenido
Seleccionar y tomar los frutos a estudiar, esterilizar los frutos con hipoclorito
al 1% durante 30 a 60 segundos; lavarlos tres veces con agua destilada
estril; sumergirlos en alcohol durante 30 a 60 segundos y lavarlos tres veces
con agua destilada estril para eliminar el exceso de hipoclorito y secar el
material vegetal sobre toalla de papel. Se recomienda escoger tejido que no
est demasiado daado o con lesiones muy avanzadas para evitar la
presencia de saprfitos.
Agregar al recipiente 600ml de agua destilada estril y colocar una toalla de
papel de modo tal que no quede en contacto directo con el agua para evitar
pudriciones de tejido.
Colocar el material vegetal sobre la toalla y tapar la cmara sellndola con
vinipel para permeabilizar la cmara.
Incubar en un cuarto de crecimiento esterila 25+/- 2 C.
Al completar el 3 y 5 da de incubacin, abrir la caja y observar la presencia o
ausencia y tamao de la lesin para pruebas de patogenicidad.

77

ANEXO 4. Protocolo Monospricos.

1. Objetivos
Obtener aislamientos puros generados a partir de una sola espora de
determinado hongo con el fin de garantizar la pureza y estabilidad gentica
de las colecciones.

2. Alcance
Va dirigido a todo el personal que labora en el laboratorio de fitopatologa

3. Documentos relacionados
Preparacin de agar agua

4. Materiales y mtodos

- Agua estril
- Tubos tapa rosca con 1 ml de agua estril
- Tubos tapa rosca secos, estriles
- Agar agua
- Pipetas automticas de 0.5 a 10 l, 40 a 200 l y de 100 a1000 l
- Puntas estriles
- Cmara de Nuebauer
- Laminillas
- Vrtex
- Microscopio
- Asas
- Mecheros

78

5. Procedimiento
A partir del cultivo inicial con el asa estril tomar un inoculo.
Suspenderlo en 1 ml de agua estril.
Agitarlo en el vrtex.
A la cmara de Nuebauer colocarle una laminilla.
Tomar 10 ul de la suspensin y ponerlo entre la cmara y la laminilla.
Realizar el conteo de esporas en los cuadrantes a, b, c y d.
Realizar el clculo para obtener una espora en 1 mL de agua con la siguiente
formula:

N Esporas
_________________ X 160.000 =esporas / ml

64

N Esporas
_________________ X 160 =esporas / l

64

Para obtener una suspensin de 1 espora / ml o 1 espora / l, se aplica la
frmula siguiente:
V1 C1 =V2 C2
Donde:
C1 =Concentracin inicial (conocida en el conteo)
V1 =Volumen final (desconocido)
C2 =Concentracin final deseada (segn el estudio a realizar)
V2 =Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inculo)

Con los datos que se obtengan con la primera, se calcula la cantidad de agua
que se debe agregar al volumen necesario de suspensin de esporas
preparada, para obtener una concentracin de 1 espora por ml o por l.
79

Ej. V1 x C1 = V2 x C2
10 esporas 1mL 1mL

= 0.1 mL X 1.000 = 100 UL completar con 900 UL de agua, para obtener
1 espora en 1 mL.

Realizar crculos en al caja de agar agua.
Sembrar en cada pozo 2 l de la suspensin final
Dejar a 25 C por 24 horas
Al completar las 24 horas se realiza la lectura en el microscopio. Observando
si hay germinacin de las esporas.
Retirar con el asa estril la espora que germino y colocarla en agar PDA.

80
ANEXO 5. Medio para evaluar la reaccin de la proteasa producida por
Colletotrichum acutatum.

KH2PO4 1.0 g
KCL 0.5 g
CaCl2.2H2O 0.2 g
Glucosa 10.0 g
Agar-Agar 12.0 g
Agua Destilada 975 ml
*Leche Desnaturalizada 15% 25 ml

Ajustar el pH al 5.4 con cido clorhdrico y posteriormente autoclavar a
121C, 20 min y 15 lb de presin.

*Preparar una solucin de leche al 15% (Pesar 15 g de leche
desnaturalizada y diluirlo en 100 ml de agua), someter a agitacin y tomar
el volumen requerido para completar el litro (25 ml).

Recomendacin: El volumen de agua (975 ml) debe estar bajo agitacin
constante y luego comenzar a agregar cada compuesto en el orden
establecido.

81
ANEXO 6. Protocolo Medio Suplementado con Base Benomyl.

1. Objetivo
Diferenciar especies de Colletotrichum susceptibles y tolerantes a benomyl

2. Alcance
Evaluacin de pruebas biolgicas para la identificacin de especies de
Colletotrichum sp. aislados de mango.

3. Definiciones
El benomyl es un fungicida sistmico que pertenece al grupo de los
benzimidazoles y que interfiere con la divisin nuclear de los hongos que son
sensibles a su efecto (Delp y Kloping, 1968, citado por Tabares en el 2002).
Tiene accin protectora y erradicante, es efectivo contra numerosos hongos
fitopatgenos y tambin posee propiedades acaricidas (Tabares, 2002).
Este producto es absorbido por las plantas, luego de los cual se acumula
principalmente en las venas y en las hojas. Una vez penetra en el tejido
vegetal, el benomyl es convertido a butil isocianato y carbendazim, el cual se
une a las unidades de tubulina del patgeno, lo que afecta la formacin de
microtbulos. Esto interfiere directamente con ciertas funciones celulares, ya
que afecta el aparato mittico, inhibe la divisin nuclear y el transporte
intracelular (Torres y Osorio, 2005).

4. Materiales y Equipos

- Fungicida Benomyl
- Agua destilada
- Agar PDA
82
- Autoclave
- Enlermeyer
- Cajas petri
- Tiras de pH

5. Contenido

5.1 Prepara el agar PDA
5.2 Autoclavar a 121 C y 15 Lb de presin (15 mint)
5.3 Dejar atemperar el agar PDA
5.4 Agragar el fungicida benomyl hasta obtener una concentracin de 2ug/ml
(Peres et al; 2002)
5.5 Servir en cajas petri y conservar las cajas en refrigeracin
5.6 Sembrar las cepas de Colletotrichum que se desean evaluar
5.7 Incubar durante 72 horas
5.8 Medir los halos de crecimiento y observar el color predominante de la
colonia.
5.9 Interpretacin: en base a los resultados del crecimiento de las especies
de Colletotrichum se debe determinar la susceptibilidad o la tolerancia del
fungicida, estos parmetros deben ir a la mano con las otras evaluaciones
biolgicas para identificar la especie en estudio.

83

ANEXO 7. Protocolo Medio Suplementado con Hidrxido de Cobre y
Estreptomicina

1. Objetivo
Diferenciar especies de Colletotrichum susceptibles y tolerantes a CuOH2

2. Alcance
Este procedimiento se aplica para obtener una clasificacin preliminar de
especies de Colletotrichum sp. aislados de diversos frutales.

3. Definiciones
CuOH2 es el medio selectivo para Colletotrichum, se compone de Hidroxido
de Cobre como ingrediente ativo, y del antibitico Estreptomicina. El CuOH2
es un fungisttico que acta desnaturalizando las protenas, a travs de la
reactivacin de los grupos sulfihdricos (Ware y Whitaker, 2000). Este medio
permite clasificar los diferentes aislamientos para la diferenciacin entre
estas dos especies de Colletotrichum por medio de la observacin de la
coloracin que predomina en la colonia y la taza de crecimiento (Abang, et al;
2003).

4. Materiales y Equipos
- Fungicida CuOH2
- Antibitico estreptomicina
- Agua destilada
- Agar PDA
- Autoclave enlermeyer
- Cajas de petri
- Tiras de pH
84

5. Contenido
5.1 preparar el agar PDA
5.2 autoclavar a 121C y 15Lb (15min)
5.3 dejar atemperar el agar PDA
5.4 Agregar el fungicida CuPH2 hasta obtener una concentracin de 42mg/L.
5.5 Agregar 300 mg/L de estreptomicina
5.6 Servir en cajas de petri y conservar las cajas en refrigeracin
5.7 Sembrar las cepas de Colletotrichum que se deseen evalaur
5.8 Incubar durane 72 horas
5.9 Medir los halos de crecimiento y observar el color predominante de la
colonia
5.10 Interpretacin: en base a los resultados del crecimiento de las especies
de Colletotrichum, se debe determinar la susceptibilidad o la tolerancia del
fungicida, estos parmetros deben ir a la mano con las otras evaluaciones
biolgicas para identificar la especie en estudio.

85

ANEXO 8. Incidencia de Infecciones Quiescentes en los estados fenolgicos de frutos
de Mango.

I NCI DENCI A DE LA ENFERMEDAD 99
19: 42 Wednesday, Apr i l 14, 1998

The GLM Pr ocedur e

Cl ass Level I nf or mat i on

Cl ass Level s Val ues

r ep 4 1 2 3 4

est 4 E1 E2 E3 E4

Number of obser vat i ons 16
86

I NCI DENCI A DE ENFERMEDAD 100

The GLM Pr ocedur e

Dependent Var i abl e: i n I nci denci a ( )

Sumof
Sour ce DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

Model 6 1823. 365000 303. 894167 1. 21 0. 3831

Er r or 9 2263. 455000 251. 495000

Cor r ect ed Tot al 15 4086. 820000

R- Squar e Coef f Var Root MSE i n Mean

0. 446157 22. 21092 15. 85859 71. 40000

Sour ce DF Type I SS Mean Squar e F Val ue Pr > F

r ep 3 573. 980000 191. 326667 0. 76 0. 5439
est 3 1249. 385000 416. 461667 1. 66 0. 2449

Sour ce DF Type I I I SS Mean Squar e F Val ue Pr > F

r ep 3 573. 980000 191. 326667 0. 76 0. 5439
est 3 1249. 385000 416. 461667 1. 66 0. 2449
87

I NCI DENCI A DE LA ENFERMEDAD 101

The GLM Pr ocedur e

t Test s ( LSD) f or i n

NOTE: Thi s t est cont r ol s t he t ype I compar i sonwi se er r or r at e not t he exper i ment wi se er r or r at e.

Al pha 0. 05
Er r or Degr ees of Fr eedom 9
Er r or Mean Squar e 251. 495
Cr i t i cal Val ue of t 2. 26216
Least Si gni f i cant Di f f er ence 25. 367

Means wi t h t he same l et t er ar e not si gni f i cant l y di f f er ent .

t Gr oupi ng Mean N est

A 81. 13 4 E1
A
A 79. 05 4 E2
A
A 64. 75 4 E3
A
A 60. 68 4 E4
88

ANEXO 9. Pruebas de Validacin, Normalidad y comparacin de promedios en la
incidencia de infecciones quiescentes en los estados fenolgicos de frutos de mango.

I NCI DENCI A DE ENFERMEDAD 102

The UNI VARI ATE Pr ocedur e
Var i abl e: r

Moment s

N 16 SumWei ght s 16
Mean 0 SumObser vat i ons 0
St d Devi at i on 12. 284014 Var i ance 150. 897
Skewness 0. 05635386 Kur t osi s - 0. 484169
Uncor r ect ed SS 2263. 455 Cor r ect ed SS 2263. 455
Coef f Var i at i on . St d Er r or Mean 3. 0710035

Basi c St at i st i cal Measur es

Locat i on Var i abi l i t y

Mean 0. 000000 St d Devi at i on 12. 28401
Medi an 0. 212500 Var i ance 150. 89700
Mode . Range 44. 90000
I nt er quar t i l e Range 16. 58750

Test s f or Locat i on: Mu0=0

Test - St at i st i c- - - - - - p Val ue- - - - - -

St udent ' s t t 0 Pr > | t | 1. 0000
Si gn M 0 Pr >= | M| 1. 0000
Si gned Rank S - 1 Pr >= | S| 0. 9799

Test s f or Nor mal i t y

Test - - St at i st i c- - - - - - - - p Val ue- - - - - -

Shapi r o- Wi l k W 0. 985528 Pr < W 0. 9926
Kol mogor ov- Smi r nov D 0. 121483 Pr > D >0. 1500
Cr amer - von Mi ses W- Sq 0. 02133 Pr > W- Sq >0. 2500
Ander son- Dar l i ng A- Sq 0. 139598 Pr > A- Sq >0. 2500

Quant i l es ( Def i ni t i on 5)

Quant i l e Est i mat e

100%Max 21. 9500
99% 21. 9500
95% 21. 9500
90% 17. 8000
89

I NCI DENCI A DE LA ENFERMEDAD
103

Var i abl e: r



75%Q3 8. 1500
50%Medi an 0. 2125
25%Q1 - 8. 4375
10% - 15. 3000
5% - 22. 9500
1% - 22. 9500
0%Mi n - 22. 9500

Ext r eme Obser vat i ons

- - - - - Lowest - - - - - - - - - - Hi ghest - - - -

Val ue Obs Val ue Obs

- 22. 950 14 6. 075 9
- 15. 300 3 10. 225 12
- 10. 575 5 13. 300 2
- 8. 725 8 17. 800 6
- 8. 150 10 21. 950 15

St emLeaf # Boxpl ot
2 2 1 |
1 8 1 |
1 03 2 |
0 66 2 +- - - - - +
0 23 2 *- - +- - *
- 0 1 1 | |
- 0 9885 4 +- - - - - +
- 1 1 1 |
- 1 5 1 |
- 2 3 1 |
- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +
Mul t i pl y St em. Leaf by 10**+1

90

I NCI DENCI A DE LA ENFERMEDAD
104

Var i abl e: r

Nor mal Pr obabi l i t y Pl ot
22. 5+ +*++
| *+++
| *+*++
7. 5+ *+*++
| +**++
| ++**
- 7. 5+ *+*+*
| ++*+
| +++*
- 22. 5+ ++*+
+- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +
- 2 - 1 0 +1 +2

91
ANEXO 10. Caractersticas Morfolgicas de los Aislamientos.

ESTADO AISLAMIENTO COLOR CRECIMIENTO
1 Gris Radial
2 Gris oscuro Radial
3 Gris Oliva Radial
4 Blanco Radial
5 Salmn Radial
E1
6 Oliva Radial
1 Blanco Radial
2 Oliva Radial
3 Gris Oscuro Radial
4 Blanco Salmn Radial
5 Gris Radial
6 Salmn Radial
E2
7 Gris Oliva Radial
1 Gris Radial
2 Oliva Radial
E3
4 Blanco Radial
1 Oliva Radial
2 Gris Radial
4 Salmn Radial
E4
5 Blanco Radial

92
ANEXO 11. Prueba de Benomyl en 2 repeticiones.

ESTADO AISLAMIENTO
CONTROL
1 2
1
+
- -
2
+
- -
3
+
- -
4
+
- -
5
+
- -
E1
6
+
- -
1
+
- -
2
+
- -
3
+
- -
4
+
- -
5
+
- -
6
+
- -
E2
7
+
- -
1
+
- -
2
+
- -
3
+
- -
E3
4
+
- -
1
+
- -
2
+
- -
3
+
- -
4
+
- -
E4
5
+
- -

-: Sensibilidad e inhibicin del crecimiento micelial.
+: Tolerancia y crecimiento micelial.

93

ANEXO 12. Prueba de la proteasa en 2 repeticiones.

ESTADO AISLAMIENTO 1 2
1 - -
2 - -
3 - -
4 - -
5 - -
E1
6 - -
1 - -
2 - -
3 - -
4 - -
5 - -
6 - -
E2
7 - -
1 - -
2 - -
3 - -
E3
4 - -
1 - -
2 - -
3 - -
4 - -
E4
5 - -

C. acutatum (852) C. gloeosporioides (1022)
+ -
+ -
+ -
+ -

La respuesta positiva es una caracterstica que presenta C. acutatum.
La respuesta negativa es una caracterstica que presenta C. gloeosporioides.

94
ANEXO 13. Prueba de Medio Selectivo para Colletotrichum spp.

ESTADOS AISLAMIENTO REPETICIN DIAMETRO (cm) CLASIFICACIN
PDA COBRE COBRE Crecimiento Especie
1 2.7 3.0 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 2 2.7 2.8 Salmn FGS
C.
gloesoporioides
1 2.6 2.8 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
2 2 2.5 2.6 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.0 3.5 Gris FGG
C.
gloeosporioides
3 2 3.4 3.3 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 3.4 3.1 Gris FGG
C.
gloeosporioides
4 2 3.2 3.0 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 3.2 2.8 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
5 2 3.2 2.6 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
1 3.4 2.4 Gris SGG
C.
gloeosporioides
E1
6 2 3.4 2.3 Gris SGG
C.
gloeosporioides
1 3.3 3.6 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 2 3.1 2.7 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 2.7 3.2 Gris FGG
C.
gloeosporioides
2 2 3.4 3.4 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 3.3 3.6 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
3 2 3.3 3.0 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
1 3.0 2.6 Gris FGG
C.
gloeosporioides
4 2 2.9 2.8 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 3.4 3.2 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
5 2 3.6 3.3 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 2.9 3.4 Gris FGG
C.
gloeosporioides
6 2 2.7 3.3 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 2.9 3.1 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
E2
7 2 3.2 2.9 Oliva FGO
C.
gloeosporioides

95
1 3.2 2.6 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 2 3.3 2.8 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.2 2.9 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
2 2 3.0 3.1 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.1 2.6 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
3 2 3.0 2.8 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.2 2.6 Gris SGG
C.
gloeosporioides
E3
4 2 3.4 2.5 Gris SGG
C.
gloeosporioides
1 3.2 2.7 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 2 3.1 3.2 Gris FGG
C.
gloeosporioides
1 3.2 3.5 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
2 2 3.4 3.5 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.5 2.6 Gris SGG
C.
gloeosporioides
3 2 3.4 2.5 Gris SGG
C.
gloeosporioides
1 3.0 2.6 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
4 2 3.2 3.1 Salmn FGS
C.
gloeosporioides
1 3.5 3.4 Oliva FGO
C.
gloeosporioides
E4
5 2 3.5 3.4 Oliva FGO
C.
gloeosporioides

96

ANEXO 14. Presencia de sntomas iniciales de Antracnosis en los
tratamientos de Patogenicidad.

ESTADO AISLAMIENTO MANGO
1 4 Das
2 4 Das
3 4 Das
4 4 Das
5 7 Das
E1
6 4 Das
1 9 Das
2 4 Das
3 4 Das
4 4 Das
5 4 Das
6 4 Das
E2
7 4 Das
1 4 Das
2 4 Das
3 4 Das
E3
4 4 Das
1 4 Das
2 4 Das
3 4 Das
4 4 Das
E4
5 5 Das

97

ANEXO 15. Efecto de la Enfermedad sobre el pH en reas sanas y enfermas de frutos
enfermos y en frutos sanos.

EFECTO DE LA ENFERMEDAD SOBRE EL pH 83

The GLM Pr ocedur e

Cl ass Level I nf or mat i on

Cl ass Level s Val ues

est 4 e1 e2 e3 e4

enf 3 t e t s t s_f e

t ej 2 exo meso

Number of obser vat i ons 96
98

EFECTO DE LA ENFERMEDAD SOBRE EL pH
84

The GLM Pr ocedur e

Dependent Var i abl e: pH

Sumof
Sour ce DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

Model 23 93. 45663333 4. 06333188 48. 04 <. 0001

Er r or 72 6. 09015000 0. 08458542

Cor r ect ed Tot al 95 99. 54678333

R- Squar e Coef f Var Root MSE ph Mean

0. 938821 5. 341744 0. 290836 5. 444583

Sour ce DF Type I SS Mean Squar e F Val ue Pr > F

est 3 4. 55715833 1. 51905278 17. 96 <. 0001
enf 2 64. 71193958 32. 35596979 382. 52 <. 0001
est *enf 6 9. 62831042 1. 60471840 18. 97 <. 0001
t ej 1 8. 49660000 8. 49660000 100. 45 <. 0001
est *t ej 3 0. 44172500 0. 14724167 1. 74 0. 1663
enf *t ej 2 4. 80166875 2. 40083437 28. 38 <. 0001
est *enf *t ej 6 0. 81923125 0. 13653854 1. 61 0. 1556

Sour ce DF Type I I I SS Mean Squar e F Val ue Pr > F

est 3 4. 55715833 1. 51905278 17. 96 <. 0001
enf 2 64. 71193958 32. 35596979 382. 52 <. 0001
est *enf 6 9. 62831042 1. 60471840 18. 97 <. 0001
t ej 1 8. 49660000 8. 49660000 100. 45 <. 0001
est *t ej 3 0. 44172500 0. 14724167 1. 74 0. 1663
enf *t ej 2 4. 80166875 2. 40083437 28. 38 <. 0001
est *enf *t ej 6 0. 81923125 0. 13653854 1. 61 0. 1556
99

85

19: 42 Wednesday, Apr i l 14,
1998

The GLM Pr ocedur e

t Test s ( LSD) f or ph

NOTE: Thi s t est cont r ol s t he t ype I compar i son wi se er r or r at e not t he exper i ment wi se er r or
r at e.

Al pha 0. 05


t Gr oupi ng Mean N est

A 5. 69333 24 e2
A
A 5. 57667 24 e1

B 5. 39208 24 e3

C 5. 11625 24 e4
100

86

The GLM Pr ocedur e


NOTE: Thi s t est cont r ol s t he t ype I compar i sonwi se er r or r at e not t he exper i ment wi se er r or r at e.

Al pha 0. 05


t Gr oupi ng Mean N enf

A 6. 56375 32 t e

B 5. 15281 32 t s_f e

C 4. 61719 32 t s
101

87

The GLM Pr ocedur e


NOTE: Thi s t est cont r ol s t he t ype I compar i son wi se er r or r at e not t he exper i ment wi se er r or
r at e.

Al pha 0. 05


t Gr oupi ng Mean N t ej

A 5. 74208 48 exo

B 5. 14708 48 meso
102

88

The GLM Pr ocedur e
Least Squar es Means

LSMEAN
est enf ph LSMEAN Number

e1 t e 6. 10125000 1
e1 t s 5. 25750000 2
e1 t s_f e 5. 37125000 3
e2 t e 6. 79000000 4
e2 t s 4. 93875000 5
e2 t s_f e 5. 35125000 6
e3 t e 6. 65500000 7
e3 t s 4. 54000000 8
e3 t s_f e 4. 98125000 9
e4 t e 6. 70875000 10
e4 t s 3. 73250000 11
e4 t s_f e 4. 90750000 12

Least Squar es Means f or ef f ect est *enf
Pr > | t | f or H0: LSMean( i ) =LSMean( j )

Dependent Var i abl e: ph

i / j 1 2 3 4 5 6

1 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
2 <. 0001 0. 4366 <. 0001 0. 0316 0. 5212
3 <. 0001 0. 4366 <. 0001 0. 0040 0. 8910
4 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
5 <. 0001 0. 0316 0. 0040 <. 0001 0. 0059
6 <. 0001 0. 5212 0. 8910 <. 0001 0. 0059
7 0. 0003 <. 0001 <. 0001 0. 3563 <. 0001 <. 0001
8 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 0. 0077 <. 0001
9 <. 0001 0. 0615 0. 0091 <. 0001 0. 7709 0. 0131
10 <. 0001 <. 0001 <. 0001 0. 5781 <. 0001 <. 0001
11 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
12 <. 0001 0. 0187 0. 0021 <. 0001 0. 8305 0. 0032



i / j 7 8 9 10 11 12

1 0. 0003 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
2 <. 0001 <. 0001 0. 0615 <. 0001 <. 0001 0. 0187
3 <. 0001 <. 0001 0. 0091 <. 0001 <. 0001 0. 0021
103

89

The GLM Pr ocedur e



i / j 7 8 9 10 11 12

4 0. 3563 <. 0001 <. 0001 0. 5781 <. 0001 <. 0001
5 <. 0001 0. 0077 0. 7709 <. 0001 <. 0001 0. 8305
6 <. 0001 <. 0001 0. 0131 <. 0001 <. 0001 0. 0032
7 <. 0001 <. 0001 0. 7127 <. 0001 <. 0001
8 <. 0001 0. 0034 <. 0001 <. 0001 0. 0137
9 <. 0001 0. 0034 <. 0001 <. 0001 0. 6136
10 0. 7127 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
11 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
12 <. 0001 0. 0137 0. 6136 <. 0001 <. 0001
104

90

The GLM Pr ocedur e

est *enf Ef f ect Sl i ced by est f or ph

Sumof
est DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

e1 2 3. 354008 1. 677004 19. 83 <. 0001
e2 2 15. 112758 7. 556379 89. 33 <. 0001
e3 2 19. 918308 9. 959154 117. 74 <. 0001
e4 2 35. 955175 17. 977587 212. 54 <. 0001

NOTE: To ensur e over al l pr ot ect i on l evel , onl y pr obabi l i t i es associ at ed wi t h pr e- pl anned
compar i sons shoul d be used.
105


The GLM Pr ocedur e

est enf ph LSMEAN

e1 t e 6. 10125000
e1 t s 5. 25750000
e1 t s_f e 5. 37125000
e2 t e 6. 79000000
e2 t s 4. 93875000
e2 t s_f e 5. 35125000
e3 t e 6. 65500000
e3 t s 4. 54000000
e3 t s_f e 4. 98125000
e4 t e 6. 70875000
e4 t s 3. 73250000
e4 t s_f e 4. 90750000
106


The GLM Pr ocedur e

est *enf Ef f ect Sl i ced by enf f or ph

Sumof
enf DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

t e 3 2. 355575 0. 785192 9. 28 <. 0001
t s 3 10. 416259 3. 472086 41. 05 <. 0001
t s_f e 3 1. 413634 0. 471211 5. 57 0. 0017
107


The GLM Pr ocedur e

LSMEAN
enf t ej ph LSMEAN Number

t e exo 6. 65312500 1
t e meso 6. 47437500 2
t s exo 4. 81250000 3
t s meso 4. 42187500 4
t s_f e exo 5. 76062500 5
t s_f e meso 4. 54500000 6

Least Squar es Means f or ef f ect enf *t ej


i / j 1 2 3 4 5 6

1 0. 0864 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
2 0. 0864 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
3 <. 0001 <. 0001 0. 0003 <. 0001 0. 0113
4 <. 0001 <. 0001 0. 0003 <. 0001 0. 2351
5 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001 <. 0001
6 <. 0001 <. 0001 0. 0113 0. 2351 <. 0001
108


The GLM Pr ocedur e

enf *t ej Ef f ect Sl i ced by enf f or ph

Sumof
enf DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

t e 1 0. 255613 0. 255613 3. 02 0. 0864
t s 1 1. 220703 1. 220703 14. 43 0. 0003
t s_f e 1 11. 821953 11. 821953 139. 76 <. 0001

NOTE: To ensur e over al l pr ot ect i on l evel , onl y pr obabi l i t i es associ at ed wi t h pr e- pl anned
compar i sons shoul d be used.
109


The GLM Pr ocedur e

enf t ej ph LSMEAN

t e exo 6. 65312500
t e meso 6. 47437500
t s exo 4. 81250000
t s meso 4. 42187500
t s_f e exo 5. 76062500
t s_f e meso 4. 54500000
110


The GLM Pr ocedur e

enf *t ej Ef f ect Sl i ced by t ej f or ph

Sumof
t ej DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F

exo 2 27. 111454 13. 555727 160. 26 <. 0001
meso 2 42. 402154 21. 201077 250. 65 <. 0001
111

ANEXO 16. Pruebas de Validacin, Normalidad y comparacin de promedios en el
efecto de la enfermedad sobre el pH.

EFECTO DE LA ENFEMEDAD SOBRE pH
97

Var i abl e: r

Moment s

N 96 SumWei ght s 96
Mean 0 SumObser vat i ons 0
St d Devi at i on 0. 25319329 Var i ance 0. 06410684
Skewness - 0. 2383586 Kur t osi s - 0. 566571
Uncor r ect ed SS 6. 09015 Cor r ect ed SS 6. 09015
Coef f Var i at i on . St d Er r or Mean 0. 02584143

Basi c St at i st i cal Measur es

Locat i on Var i abi l i t y

Mean 0. 00000 St d Devi at i on 0. 25319
Medi an - 0. 00750 Var i ance 0. 06411
Mode - 0. 17500 Range 1. 09500
I nt er quar t i l e Range 0. 37000

NOTE: The mode di spl ayed i s t he smal l est of 8 modes wi t h a count of 2.

Test s f or Locat i on: Mu0=0

Test - St at i st i c- - - - - - p Val ue- - - - - -

St udent ' s t t 0 Pr > | t | 1. 0000
Si gn M - 1 Pr >= | M| 0. 9188
Si gned Rank S 52 Pr >= | S| 0. 8504

Test s f or Nor mal i t y

Test - - St at i st i c- - - - - - - - p Val ue- - - - - -

Shapi r o- Wi l k W 0. 981149 Pr < W 0. 1830
Kol mogor ov- Smi r nov D 0. 077977 Pr > D >0. 1500
Cr amer - von Mi ses W- Sq 0. 069137 Pr > W- Sq >0. 2500
Ander son- Dar l i ng A- Sq 0. 480666 Pr > A- Sq 0. 2340



100%Max 0. 5250
99% 0. 5250
112

98

Var i abl e: r



95% 0. 4000
90% 0. 3300
75%Q3 0. 1950
50%Medi an - 0. 0075
25%Q1 - 0. 1750
10% - 0. 3950
5% - 0. 4400
1% - 0. 5700
0%Mi n - 0. 5700

Ext r eme Obser vat i ons

- - - - - Lowest - - - - - - - - Hi ghest - - - -

Val ue Obs Val ue Obs

- 0. 570 66 0. 400 4
- 0. 525 62 0. 410 67
- 0. 510 48 0. 415 87
- 0. 460 36 0. 465 92
- 0. 440 80 0. 525 73

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