Seminario Biotecnolgico

Alumnos: Nur Essus - Claudio Jara Claudio Padilla Paulina Ulloa

Profesor: Abel Vsquez
Fecha entrega: 16 de Junio del 2014
PAPER: Expresin, purificacin e inmunodeteccin de un fragmento recombinante
(residuos 179-281) de la protena G desde el virus de la rabia, cepa ERA.

1) Objetivo del paper:
En este paper se quiso clonar, expresar y purificar el fragmento rGERA179-281,
perteneciente a la protena G del virus de la rabia, todo esto en una E. coli. El fin de realizar
dichas operaciones fue para probar la inmunoreactividad con los anticuerpos presentes en la
inmunoglobulina teraputica humana de la rabia.
2) Anlisis de la metodologa:
Cepas bacterianas, plasmidios, medio y qumicos.
La bacteria E.coli DH5 utilizada junto al plasmidio pSG5r gpT434 para el clonamiento
son de carcter tradicional para este tipo de procedimiento; en cambio el plasmidio para la
expresin, el cual es un Plasmid pET-14b, es el punto importante de esta seccin. Debido a
que este plasmidio tiene dos caractersticas relevantes para la expresin, una regin
codificante de resistencia a la ampicilina lo cual ayuda a un mejor proceso. Y una secuencia
codificante para un Tag de hexa-istidina, la cual otorga una importante ventaja para
separacin y purificacin con la utilizacin de una cromatografa de afinidad como la
Chelating Sepharose Fast Flow

Amplificacin
Se amplific una parte del gen G por PCR para obtener una forma truncada de la protena
G, que carece de los dominios transmembrana y citoplasmtico, con el fin de obtener una
forma carente de carcter infectivo. Los primers utilizados fueron diseados a partir de la
secuencia de aminocido de la protena junto a la utilizacin de una BamHI y Ndel como
enzimas de restriccin para garantizar los cortes apropiados en la secuencia del plasmido de
expresin
Construccin del vector de expresin y purificacin:
La construccin del vector pGeRA179-128 se basa en la incorporacin de los fragmentos
obtenidos del PCR en forma truncada en un plasmidio pET-14b, en cual es digerido con las
enzimas posteriormente mencionadas; este procedimiento incluye dos grandes detalles para
su posterior expresin y purificacin, los cuales son la digestin con las mismas enzimas de
restriccin para asegurar que el MCS otorguen el espacio necesario para la unin, y la
incorporacin de una secuencia de codificacin de aminocidos que contienen 6 histidinas.
Estos detalles aseguran una mejor incorporacin de la secuencia en el plasmidio lo cual fue
comprobado posteriormente con el PCR de colonia y una purificacin ms sencilla gracias
a las histidinas agregadas.
Expresin y purificacin rGERA179-281:
Inoculacin de E.coli en Luria-Bertani (LB) que contiene ampicilina y cloranfenicol, se
basa principalmente en la caracterstica que el vector contiene una resistencia ara este
antibitico, proporcionando una viabilidad, luego se cultivaron para su desarrollo hasta
obtener una biomasa consistente de una densidad ptica de 0,6-0,8 a 600 nn, posteriormente
se le adiciono el inductor ITPG para una sobre produccin de protenas en las bacterias.
Las clulas cultivadas se centrifugaron y se le adiciono un Buffer de lisis desnaturate, con
el fin de lisar las clulas para obtener la protena de inters, la cual se encuentra en cuerpos
de inclusin, los cuales se destruyen con sonicacion, finalmente se centrifugaron para
separar los residuos y el sobrenadante se llev a una columna de afinidad, la cual se puede
utilizar para separar gracias a las histidinas secretadas en las protenas. Por ltimo es
necesario realizar una prueba de pureza con el mtodo de SDS-PAGE


Caracterizacin de rGERA179-281
El anlisis de la protena obtenida en el experimento es de relativa importancia, debido a
que se debe conocer la identidad y la cualidad del a protena obtenida. Es por esto que el
anlisis del SDS-PAGE realizado es de vital importancia debido a que se puede observar
que la protena obtenida es de aproximadamente 14kDa , lo cual se acerca notablemente al
valor teorico de 13,8kDa. La identidad de esta protena y su secuencia se determin atreves
de MALDI para su anlisis en comparacin de la similitud con diversos tipos de virus de
rabias similares;
Inmunodeteccion.
Para comprobar la reactividad de esta protena se utiliz un ensayo de inmunobloteo, en el
cual se combin esta protena junto a anticuerpos de vacunas para la HRIG. Este anlisis es
de importancia debido a que los resultados obtenidos muestran cmo reacciona el Wester-
Blot del anticuerpo frente a la protena identificndola como una protena de virus.

Competicin de la neutralizacin de la actividad de HRIG.
Competicin de la actividad neutralizante de HRIG. Luego de comprobar la reactividad y la
identificacin por parte de anticuerpos HRIG, se comprob la competencia de la actividad
neutralizante de estos. Este experimento en el cual se utilizaron diversas cantidades de
protena rGera179-281 se puede observar la reduccin significativa de la actividad de la
protena. Estos resultados obtenidos alientan posteriores estudios acerca de los detalles de
la neutralizacin del virus y desarrollos de posteriores mtodos de diagnsticos para la
deteccin.





3) Conclusin paper
En conclusin podemos destacar que en este estudio se obtuvieron como producto
final cuerpos de inclusin que contienen la glicoprotena en cuestin. La ventaja de
obtener el producto en cuerpos de inclusin es la facilidad con la que se pueden separar,
y esto conlleva a la obtencin del producto con un coste de purificacin reducido.
La estrategia utilizada para poder purificar en un solo paso, fue agregar fragmentos
de hexa-histidina para que reaccione con la fase estacionaria de la columna de afinidad
(Chelating Sepharose Fast Flow), as al eluir se obtiene la protena purificada sin
necesidad de solubilizar la protena.