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TEMA 6: TCNICAS CROMATOGRFICAS



1. Introduccin
2. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
3. Consideraciones generales sobre la cromatografa de elucin
4. Anlisis qumico con mtodos cromatogrficos
5. Cromatografa de gases
6. Cromatografa de lquidos

1. INTRODUCCIN
La mayora de los mtodos de anlisis son en los casos ms favorables selectivos,
pero no especficos. Por ello, cuando se trata de muestras complejas la separacin del
analito de de las posibles interferencias es una etapa esencial. An mejor sera la
posibilidad de determinar varios analitos despus de una separacin previa.
Uno de los mejores mtodos para conseguir esa separacin, y posiblemente, el ms
utilizado es la cromatografa. Este conjunto de tcnicas permite la separacin de
componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. La cromatografa en
sus orgenes era exclusivamente una tcnica de separacin que se transform en
tcnica de anlisis cuando se acopl con un dispositivo para monitorizar las especies
qumicas que se iban separando. As, la cromatografa se ha convertido en un mtodo
analtico de primer orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos
presentes en muestras lquidas o gaseosas (para muestras slidas se requiere una
etapa de disolucin o extraccin).
En cromatografa, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de
desplazamiento cuando son arrastrados por una fase mvil a travs de un lecho
cromatogrfico que contiene a una fase estacionaria (slida o liquda).
La muestra se disuelve en la fase movil y se hace pasar a travs de la fase
estacionaria (inmiscible con la mvil) que se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie plana. Las dos fases se eligen de tal modo que los componentes de la
muestra se distribuyen de modo distinto entre las dos fases. Aquellos que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de
fase mvil, mientras que los que se retiene dbilmente avanzan con ms rapidez.




2. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS
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Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse segn diferentes criterios:
atendiendo al modo como las fases se ponen en contacto y atendiendo a fundamento
del proceso de separacin. En este ltimo caso en definitiva se trata de la naturaleza
de las fases y del tipo de interacciones que tienen lugar entre lso solutos y las fases
utilizadas.
Clasificacin atendiendo al fundamento de la separacin (naturaleza de las fases
y tipo de interacciones):

A. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS (fase mvil lquida)
Fase estacionaria slida: se trata de slidos finamente divididos (con gran superficie
especfica)
- Cromatografa de adsorcin: la fase estacionaria slida retiene a los solutos por un
doble efecto de adsrocin fsica y qumica. Las interacciones implicadas son del tipo
de furezas de van der Waals.
- Cromatografa de cambio inico: el slido retiene a los solutos gracias a
atracciones electrostticas. La fase estacionaria slida lleva en la superficie cargas
electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por
iones de la fase mvil.
- Cromatografa de exclusin: la fase estacionaria es un material poroso, que retiene
a las molculas en funcin de su tamao. en ocasiones se denomina tambin
cromatografa de filtracin sobre geles o de permeabilidad en geles (GPC).

Fase estacionaria lquida:
- Cromatografa de reparto: la fase estacionaria es un lquidos inmovilizados sobre
un material inerte slido que slo acta de soporte.
- Cromatografa de afinidad o de fases enlazadas: la fase estacionaria es
generalmente un polmero de tipo lquido inmovilizado sobre un slido inerte por
enlaces covalentes.
En ambos casos la separacin se debe a equilibrios de distribucin de los solutos
entre las fases mvil y estacionaria controlados por la diferente solubilidad de los
mismos en las distintas fases.

B. CROMATOGRAFA DE GASES (fase mvil gaseosa)
- cromatografa de adsorcin (o cromatografa gas-slido) la fase estacionaria es un
slido finamente dividido, que retiene a los solutos por adsorcin
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- cromatografa de particin o reparto la fase estacionaria es un lquido retenido por
impregnacin o por enlace sobre un slido inerte. Se basa en equilibrios de
distribucin.
C. CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS (la fase mvil es un fluido
supercrtico)
Un fluido supercrtico es un fluido calentado a t y P superiores a las crticas. Posee
algunas caractersticas propias de un gas y algunas propias de un lquido. la fase
estacionaria puede ser lquida o slida.

Clasificacin atendiendo al modo se lleva a cabo la separacin (cmo se ponen en
contacto las fases):
Cromatografa en columna: la fase estacionaria se introduce en un tobo estrecho a
travs del cual se hace pasar la fase mvil. Esta se desplaza por capilaridad, gravedad
o presin. Pueden emplearse fases mviles lquidas, gaseosa o fluidos supercrticos.
Cromatografa plana: la fase estacionaria se coloca en un soporte plano. En
cromatografa plana el flujo de fase mvil se consigue por capilaridad o por capilaridad
y gravedad. Slo pueden emplearse lquidos como fases mviles. Existen:
- cromatografia en papel: la fase estacionaria esta constituida por el agua retenida
en la celulosa. tambin existen papeles cambiadores de iones.
- cromatografa en capa fina: la fase estacionaria es un slido adsorbente
finamente dividido o un lquido inmovilizado sobre un slido colocado sobre una placa
plana.
En este tema nos centraremos en la cromatografa en columna y consideraremos
nicamente cromatografa de lquidos y de gases.

3. CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE LA CROMATOGRAFA EN
COLUMNA
Consideremos la separacin de dos sustancias A y B en una columna por
cromatografa de elucin. La elucin implica el transporte de una especie a travs de
una columna por adicin sucesiva de fase mvil (eluyente). Sucesivas adiciones de
fase mvil hacen descender las molculas de analito por la columna en una serie de
transferencias entre la fase mvil y la fase estacionaria. Si al final de la columna se
coloca un dispositivo que responda a los cambios de composicin de la fase mvil, es
decir, a la presencia de los distintos solutos (detector) se puede registrar un
cromatograma, grfico que representa la respuesta del detector en funcin del tiempo
de elucin (o volumen de eluyente aadido). La lnea base del cromatograma
corresponde a la seal del detector en ausencia de compuestos eluidos, la aparicin
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de un pico representa la elucin de un componente de la muestra. la separacin se
completa cuando el cromatograma presenta tantos picos como compuestos formaban
parte de la mezcla objeto de anlisis.
Un constituyente se caracteriza por su tiempo de retencin t
R
, que representa el
tiempo transcurrido entre el instante de la introduccin de la muestra en la columna y
el momento en que dicho constituyente alcanza el mximo de seal en el detector.
Tambin se emplea el llamado tiempo de retencin reducido o ajustado, que es la
diferencia entre el tiempo de retencin de un constituyente y el tiempo muerto. El
tiempo muerto (t
m
) se define como el tiempo necesario para que un constituyente no
retenido (o la fase mvil) llegue al detector.
Se habla tambin en cromatografa del factor de retencin (k) de un componente, que
se define como:
m
m
t
t t
k
R

=
cuanto mayor sea el tiempo que un componente es retenido en la columna mayor es
su factor de retencin.
Muy frecuentemente se considera un trmino denominado coeficiente de reparto o
coeficiente de distribucin (K):
m
s
C
C
K =
Donde Cs y Cm son las concentraciones del componente considerado en la fase
estacionaria y movil, respectivamente. Coeficientes de distribucin grandes favorecen
una buena separacin entre distintos componentes pero incrementan el tiempo
necesario para la elucin, lo que provoca un ensanchamiento de la banda del
componente. Se debe por lo tanto buscar una solucin de compromiso.
Desde el descubrimiento de la cromatografa se han propuesto diferentes teoras para
conseguir una explicacin del modelo cromatogrfico. Una de las ms conocidas es la
teora de platos. Aunque se trata de un modelo antiguo, hoy considerado obsoleto,
permite describir de forma sencilla las separaciones. Consiste en considerar la
separacin cromatogrfica como una serie de equilibrios sucesivos de distribucin
entre las fases mvil y estacionaria a medida que el soluto avanza por la columna.
Estos equilibrios sucesivos se basan en el concepto de plato terico, segn el cual se
puede imaginar la columna dividida de longitud L dividida en N segmentos en cada
uno de los cuales se establece un equilibrio. As aunque la cromatografa es un
proceso continuo este modelo es un enfoque esttico, que reproduce la migracin del
soluto en la columna mediante el encadenamiento de una serie de etapas estticas. El
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trmino plato terico proviene de la teora de platos descrita para la destilacin, y
aunque no tiene ningn significado fsico real se ha aceptado y conservado
universalmente.
La eficacia de una columna para separar solutos depende del nmero de platos
tericos. A mayor nmero de platos tericos mejor es la separacin. Para una columna
de longitud dada, la eficacia de la separacin ser tanto mejor cuanto menor sea la
altura equivalente de plato terico (H):
H =L/N
En las expresiones consideradas hasta el momento solo se ha tenido en cuenta la
naturaleza del componente y de las fases mvil y estacionaria para alcanzar los
equilibrios sucesivos. Sin embargo, la fase mvil se desplaza a travs de la fase
estacionaria con cierta velocidad. Por tanto, el movimiento del soluto no puede ser
completamente descrito en trminos de equilibrio, pues estaramos suponiendo que el
equilibrio se alcanza infinitamente rpido. Evidentemente, la velocidad de la fase mvil
debe tener una incidencia en el avance de los solutos, su dispersin y por tanto en la
eficacia de la separacin.
La primera ecuacin cintica que describi la influencia de la fase mvil en la eficacia
de la columna es la ecuacin de van Deemter, quien la desarroll para columnas
empaquetadas en cromatografa de gases. Posteriormente se han propuesto
ecuaciones para otros tipos de columnas (capilares) y para cromatografa lquida. Aqu
nos referiremos exclusivamente a la ecuacin de van Deemter. Esta ecuacin
relaciona la altura equivalente de plato terico (H) con la velocidad lineal media de
caudal de la fase movil (v):
v C
v
B
A H + + =
A, B y C son constantes caractersticas de cada columna. Se comprueba que existe
un caudal ptimo para cada columna, correspondiente al mnimo de la curva
representativa de esta ecuacin. La explicacin de este comportamiento se obtiene
considerando los distintos mecanismos que contribuyen al aumento de la altura
equivalente de plato terico. Podemos imaginar estos factores como aquellos que
provocan el ensanchamiento de la banda de un constituyente que se mueve a travs
de la fase estacionaria arrastrado por la fase mvil. Todos aquellos fenmenos que
contribuyen al ensanchamiento de banda disminuyen la eficacia de la separacin.
Estos fenmenos responsables del ensanchamiento de zona son:
- Difusin longitudinal: el soluto tiende a difundir hacia los bordes de la zona,
ensanchando la banda. Cuanto menor es el caudal de fase mvil mayor es el
ensanchamiento por difusin. (Trmino B/v).
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- Transferencia de masa entre las fases: es responsable del trmino Cv, ya que
el soluto requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases mvil y
estacionaria, cuando el caudal es demasiado rpido no puede alcanzarse el
equilibrio.
- Difusin turbulenta. Est relacionado con el perfil de caudal de la fase mvil a
travs de la fase estacionaria. El tamao de las partculas de relleno, su
distribucin por tamaos y su regularidad son el origen de la formacin de
caminos preferentes. Por tanto, el soluto puede recorrer mltiples trayectorias
de distinta longitud aleatoriamente. Este trmino (A) es independiente de la
velocidad de la fase mvil.
As la eficacia mxima de separacin se obtiene cuando la altura equivalente de plato
terico (H) es mnima. Para velocidades menores que la ptima la difusin longitudinal
causa un ensanchamiento de la banda y con ello un incremento de H. Para
velocidades mayores que la ptima la dificultad para alcanzar el equilibrio entre las
fases hace que la banda se extienda. Para un tipo dado de fase estacionaria cuanto
menor es el tamao de partcula mejor es la eficacia de la separacin, ya que el soluto
debe recorrer menores distancias para alcanzar el equilibrio. El problema es que
cuanto menores son las partculas de relleno mayor resistencia se opone al flujo de
fase mvil por lo que hay que trabajar con alta presin.

La resolucin cromatogrfica constituye una medida cuantitativa de la capacidad de
una columna para separar dos analitos. La resolucin se calcula a partir del
cromatograma como:

( ) ( ) [ ]
B A
A R B R
B A B A
s
w w
t t
w w
Z
w w
Z
R
+

=
+

=
+

=
2 2
2 2


Cuanto mayor sea R
s
mejor separados estarn los picos cromatogrficos de los
componentes A y B. La resolucin de una columna aumenta al aumentar el nmero d
platos tericos de la misma y por lo tanto al aumentar la longitud.



Existen dos modalidades de trabajo en cromatografa de elucin:
Isocrtica: las condiciones cromatogrficas permanecen constantes durante la
separacin.
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En gradiente: las caractersticas de la elucin se van modificando durante la
separacin. Con ello puede conseguirse una mejor resolucin de mezclas complejas.


4. ANLISIS QUMICO CON MTODOS CROMATOGRFICOS
La cromatografa es actualmente el principal mtodo utilizado para la separacin de
mezclas de especies qumicas estrechamente relacionadas entre si. Se puede
emplear para identificacin cualitativa y determinacin cuantitativa de las especies
separadas.
Anlisis cualitativo: el parmetro que puede usarse con fines cualitativos en
cromatografa es el tiempo de retencin. Este es caracterstico de cada componente
en cada sistema cromatogrfico. Se trata sin embargo de una informacin pobre si se
compara con otras tcnicas de identificacin (ej: espectroscpicas). nicamente con el
tiempo de retencin resulta difcil asegurar la presencia de un componente en una
mezcla, aunque si se puede afirmar la ausencia. La identificacin requiere siempre el
uso de patrones en las mismas condiciones cromatogrficas.
Anlisis cuantitativo: se basa en la comparacin del area o altura de pico del
componente de inters con la de estndares de esta sustancia de concentracin
conocida, admitiendo que existe una relacin lineal entre el area o altura de pico y la
concentracin en un determinado intervalo de concentraciones. En los anlisis
basados en altura de pico se requiere que la anchura de los picos no sufra
modificacin durante el tiempo necesario para obtener los cromatogramas de la
muestra y los estndares para obtener resultados exactos. Por ello suele usarse
mucho ms el anlisis basado en rea de pico, parmetro independiente de los
efectos de ensanchamiento.
El mtodo ms sencillo de la calibracin consiste en el uso de patrones externos. Se
obtienen los cromatogramas de disoluciones patrn de distinta concentracin y se
representa el rea de pico en funcin de la concentracin para construir la curva de
calibrado. Esto debe corresponder a una recta que pasa por el origen. Por
interpolacin se obtiene la concentracin de ese constituyente en la muestra.
Cuando se utiliza este mtodo en cromatografa la fuente de error ms frecuente es la
irreproducibilidad en la inyeccin de un volumen muy pequeo en la cabeza de la
columna. En equipos dotados de muestreadores automticos esto no supone un
problema. Pero si la inyeccin de muestra se hace manualmente si. En este caso
pueden conseguirse mejores resultados si se emplea el mtodo del estndar interno.
En este procedimiento se aade a la muestra y a cada disolucin patrn una cantidad
exactamente medida de otra sustancia a la que se denomina estndar interno. Como
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parmetro cuantitativo se emplea ahora la relacin entre el area de pico del
componente de inters y el area de pico del estndar interno. De este modo se
compensan variaciones en el volumen de muestra inyectado. Entre los requisitos que
debe cumplir el estndar interno es que su pico cromatogrfico se encuentre bien
resuelto respecto a los que constituyen la muestra y que no debe encontrarse
inicialmente en la muestra.


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5. CROMATOGRAFA DE GASES
1. Introduccin
2. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases.
3. Anlisis cuantitativo empleando cromatografa de gases
4. Preparacin de muestras ambientales para cromatografa de gases
5. Aplicaciones ms relevantes en medio ambiente

5.1. Introduccin
En cromatografa de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de la
columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil gaseosa.
La fase mvil en cromatografa de gases es un gas inerte, es decir, no interacciona
con las molculas de analito, slo las transporta a travs de la fase estacionaria.

La fase estacionaria en cromatografa de gases puede ser un slido (cromatografa
gas-slido), producindose entonces la retencin de las molculas de analito por
adsorcin. Este tipo de cromatografa es poco frecuente. Lo ms habitual es que la
fase estacionaria sea un lquido (cromatografa gas-lquido). En este caso la fase mvil
es un lquido no voltil inmovilizado sobre la superficie de un slido inerte. Se trata
entonces de una croamtograa de particin. Los analitos se distribuyen entre las fases
mvil (gaseosa) y estacionaria (lquida).

5.2. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases.
Un cromatgrafo de gases consta de sistema de suministro de fase mvil, sistema de
inyeccin de muestra, columna cromatogrfica situada en horno termostatizado y
detector.

1. Suministro de fase mvil (gas portador).
Los gases ms usados son helio, argon, nitrgeno e hidrgeno. El gas suele venir
determinado por el tipo de detector que se va a emplear. Con ele suministro de gas
portados van asociados reguladores de presin, manmetros y medidores de flujo.
2. Sistema de inyeccin de muestra. Para que la separacin sea eficaz es
necesario un sistema que permita la introduccin de una muestra de tamao adecuado
de forma rpida. La introduccin de muestras grandes o demasiado lentamente
provoca la aparicin de bandas anchas lo que se traduce en una resolucin pobre. El
mtodo ms sencillo de introduccin de la muestra es el empleo de una microjeringa.
La muestra se inyecta a travs de un tapn de goma (septum) en una cmara de
vaporizacin situada en la cabeza de la columna (figura). La temperatura de esta
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cmara est unos 50 grados centgrados por encima de la temperatura de
volatilizacin del componente menos voltil de la muestra. El volumen de muestra
inyectado es de unos pocos microlitros. Las columnas denominadas capilares
necesitan mucha menor cantidad de muestra, por ello suele usarse un divisor de
muestra, que permite pasar a la columna slo una pequa fraccin del volumen
inyectado desechando el resto. Este sistema de inyeccin manual tiene como principal
inconveniente la poca reproducibilidad de la inyeccin. Esto puede mejorarse con
inyectores automticos.
3. Columna cromatogrfica situada en horno termostatizado. En ella se va a
producir la separacin de los analitos.existen dos tipos de columnas, la columnas
empaquetadas (o de relleno) y las capilares (o tubulares abiertas). Las empaquetadas
son columnas rellenas con un soporte slido de grano muy fino que bien actua como
fase estacionaria o est recubierto de una fina capa de fase estacionaria lquida no
voltil. El soporte ideal son pequeas partculas esfericas de tamao uniforme y gran
superficie especfica. El material debe ser inerte y resistente a elevadas temperaturas.
El soporte ms usado es la tierra de diatomeas, consistente en los esqueletos de slice
de algas microscpicas. Estas columnas poseen dimetros de 3-6 mm y longitud de 1-
5 metros.
Las columnas tubulares abiertas o capilares son ms estrechas (0.2-0.5 mm) y
suelen ser mucho ms largas (10-100 m). La pared interior de la columna se recubre
con una pelcula de la fase estacionaria, (slida o lquida) con un espesor de unas
pocas micras. De este modo al no existir la oposicin del relleno al paso del gas
pueden hacerse ms largas. Estas columnas poseen una menor AEPT que las
columnas empaquetadas, pues el termino A de la ecuacin de van Deemter, asociado
a la multitud de trayectorias posibles desaparece. La cantidad de muestra necesaria
para estas columnas es menor que para las empaquetadas. Todo ello se traduce en
que las columnas capilares poseen mucha mejor resolucin, mayor sensibilidad y
necesitan menor tiempo de anlisis. Por ello prcticamente han reemplazado por
completo a las empaquetadas.

Las FASES ESTACIONARIAS en cromatografa de gases juegan un papel decisivo,
puesto que la fase mvil es inerte. Estas son en su mayoria lquidas como ya se ha
comentado y deben cumplir una serie de requisitos:
- baja volatilidad: su temperatura de ebullicin debe estar al menos 100 grados
por encima de la temperatura mxima de trabajo
- deben ser estables a temperaturas elevadas
- deben ser qumicamente inertes (no reaccionar)
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Existe una gran variedad de fases estacionarias lquidas. La seleccin de una u otra
suele hacerse empricamente. Debe buscarse que la fase estacionaria disuelva los
componentes de la mezcla separar de forma diferente, que no queden muy retenido ni
tampoco demasiado poco. En general suele seguirse el principio de que lo semejante
disuelve a lo semejante. As, se utilizan fases estacionarias polares para separar
compuestos polares, dichas fases suelen tener grupos tipo CN, -CO, -NH. Las fases
estacionarias apolares se emplean para separar compuestos apolares.
Adems del empleo de lquidos no voltiles como fases estacionarias, es cada vez
ms frecuente el uso de fases enlazadas. Se trata de molculas unidas
covalentemente al soporte slido para minimizar la prdida de fase lquida de la
columna.
La columna cromatogrfica se encuentra en el interior de un horno termostatizado, ya
que la temperatura es una variable crucial en las separaciones por cromatografa de
gases. La temperatura afecta al equilibrio de distribucin de los analitos entre la fase
mvil y estacionaria. Cuando se aumenta la temperatura de la columna se acelera la
elucin. La temperatura ptima reflejar un equilibrio entre la consecucin de la
resolucin necesaria y la velocidad de la separacin. Puede trabajarse a temperatura
constante (isotrmicamente) o con programacin de temperaturas (en gradiente o
rampa de temperatura). Esta ltima modalidad permite separar grupos de compuestos
con volatilidad muy variada en periodos de tiempo ms breves.
4. Detectores. El detector es el sistema encargado de poner de manifiesto la
presencia de solutos que salen de la columna cromatogrfica. Se han usado muchos
detectores. Las caractersticas de un detector ideal en cromatografa de gases son:
- adecuada sensibilidad
- buena estabilidad y reproducibilidad
- respuesta lineal en un intervalo amplio de concentracin
- amplio intervalo de temperatura de trabajo
- tiempo de respuesta corto

En ocasiones interesa que el detector responda de forma semejante a todos (o
muchos) los compuestos, estos detectores se denominan universales. En otros caso
interesan detectores selectivos, que responde a determinadas familias de compuestos.

Comentaremos algunos de los detectores ms habituales:

a) Detector de ionizacin de llama (FID). La respuesta el detector se debe a la
combustin de los compuestos orgnicos en una llama de aire-hidrgeno. Los
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compuestos orgnicos al quemarse producen iones y electrones, que pueden conducir
la corriente electrica. Se mide la intensidad de corriente entre dos electrodos situados
a los lados de la llama. Es uno de los detectores ms utilizados, debido a su respuesta
casi universal a los compuestos orgnicos. Solo los gases no combustibles, como
CO
2
, SO
2
, oxidos de nitrgeno N
2
O, NO, NO
2
, NH
3
no producen respuesta en este
detector. Este detector posee elevada sensibilidad (10
-13
g/s), amplio intervalo lineal de
respuesta (10
7
) y bajo ruido de fondo. Se trata de un detector destructivo.
b) Detector de conductividad trmica. Este detector responde a cualquier soluto
cuya conductividad trmica sea diferente de la del gas portador. Este trmino se
refiere a la capacidad de una sustancia de transportar calor de una regin caliente a
una fria. El funcionamiento se basa en la disminucin de la conductividad del gas
portador cuando un soluto sale de la columna. Se suele usar he generalmente por su
elevada conductividad termica. Se emplea un filamento calentado elctricamente cuya
resistencia depende del calor disipado. Se necesita una referencia, un gas que no
pasa por la columna. Este dtector sensible que el anterior y suele emplearse para
aquellas especies que no producen respuesta en el FID, puesto que responde a
cualquier compuesto cuya conductividad trmica sea diferente a la del gas portador.
Es un detector no destructivo, por lo que puede emplearse en serie con otros y as
mejorar la cantidad de informacin obtenida.

Adems de estos detectores universales, se pueden usar otros ms selctivos.
Comentaremos dos especialmente relevantes en aplicaciones medioambientales.

c) Detector de nitrogeno y fosforo (NPD). Es un detector basado en una
modificacin del FID. La presencia de iones alcalinos en una llama disminuyen las
ionizaciones de los grupos C-H y aumentan la de grupos que contienen atomos de N y
P, generando una respuesta muy selectiva para molculas que contienen estos
atomos.
d) Detector de captura electrnica: se basa en el hecho de que las especies muy
electronegativas pueden captar electrones formando iones cargados negativamente.
La produccin de electrones se consigue mediante un emisor beta. El flujo de
electrones (seal de fondo) disminuye cuando salen de la columna especies capaces
de capturar electrones. Es un detector muy sensible a molculas que contengan
atomos halgenos.

Adems pueden emplearse otros tipos de deteccin como la fotometra de llama, se
mide la emisin atmica. Util para especies con S y P. Un caso aparte son los
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acoplamientos de cromatgrafos con detectores ms potentes, que proporcionan
mucha mayor cantidad de informacin cualitativa. EJ . Con espectroscopia infrarroja.

5.3. Anlisis cuantitativo empleando cromatografa de gases
El anlisis cuantitativo emplendo cromatografa de gases se basa en la comparacin
del area o altura de los picos del analito en la muestra con el area o altura de los picos
de estandares de concentracin conocida de esta sustancia. Para la calibracin el
mtodo ms sencillo es preparar disoluciones patrn de diferente concentracin,
obtener los cromatogramas y representar altura o ara de pico. Esto debera dar una
recta que pasa por el origen. Sin embargo si se emplea este mtodo en cromatografa
de gases con inyeccin manual de la muestra, la falta de reproducibilidad de la
inyeccin de pequeos volmenes produce malos resultados. Pueden conseguirse
mejores resultados empleando el mtodo del estndar interno. Este consiste en aadir
ala muestra y a los patrones una cantidad constante de otro compuesto al que
llamamos estndar interno. Despus se emplea como parmetro para construir la
recta de calibrado la relacin de areas entre la especie de inters y el estndar interno.
De este modo se compensa la variabilidad en el volumen de muestra introducido. El
estandar interno debe elegirse de tal modo que su pico este bien separado de los
otros constituyentes de la muestra.

5.4. Preparacin de muestras ambientales para cromatografa de gases
La mayora de los mtodos para la determinacin de compuestos orgnicos en
muestras ambientales (ej: aguas) implican una etapa de extraccin de estos
compuestos previa al anlisis cromatogrfico. Ello no se debe solo a la necesidad de
preconcentrar. A pesar de que en muchos casos la sensibilidad es suficiente para
permitir el anlisis directo, la mayoria de las fases estacionarias son incompatibles con
la inyeccin de agua y compuesto no volatiles. Adems la extraccin selectiva puede
simplificar el cromatograma, especialmente en muestras biolgicas complejas.
Los procedimientos ms usados son:
- Extraccin con disolventes: si la muestra es de agua se hace una extraccin
lquido lquido con un disolvente inmiscible con agua y compatible con la fase
estacionaria. Luego debe secarse este disolvente. La muestras solidas se tratan con
disoventes apropiados para extraer selectivamente los analitos.
- Extraccin en fase slida: la muestra, generalmente de agua, se hace pasar a
traves de una columna que contiene un material adsorbente. Los analitos quedan
retenidos selectivamente y luego son eluidos con un pequeo volumen de disolvente
orgnico.
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- Cromatografa de espacio de cabeza: se utiliza para determinar los
constituyentes volatiles de muestras slidas o lquidas analizando la fase de vapor que
se encuentra en equilibrio termodinmico con la muestra en un recipiente cerrado. Un
calentamiento suave favorece el establecimiento de este equilibrio.
- Tcnica de Purga y Atrapamiento: cosnsite en extraer los componentes
volatiles de una muestra lquida, generalmente acuosa usando un gas inerte de purga.
Generalmente depus los compuesto son retenidos en un adsorbente que luego se
somete a calentamiento para liberalos en introducirlos en el cromatografo.

5.5. Aplicaciones ms relevantes en medio ambiente
La cromatografa de gases es el mtodo ms aconsejado para separar y analizar
compuestos orgnicos voltiles (punto ebullicin <250C). Compuestos de punto de
ebullicin mas alto suelen descomponer a la temperatura necesaria para eluirlos de la
columna en un tiempo razonable. En ocasiones se pueden emplear reacciones
qumicas para formar derivados voltiles.

Las aplicaciones ms relevantes en medio ambiente son:

Anlisis de plaguicidas (insecticidas, herbicidas, funguicidas..) en aguas suelos, etc.
Suelen empelarse distintos detectores segn la naturaleza de los compuestos. Es
frecuente el anlisis de pesticidas organoclorados empleando el detector de captura
electrnica. Para los compuesto con atomos de P y N se emplea el detector selectivo
NPD. Si contienen S puede usarse el fotomtrico de llama.

Anlisis de disolventes organoclorados en aguas empleando el detector de captura
electrnica.

Anlisis de compuestos orgnicos en general, para los que se emplea el detector FID.

Adems la cromatografa de gases es muy til para el anlisis de gases inorgnicos
en muestras de aire. En este caso casi sin preparacin de la muestra. Para estos
gases suele usarse cromatografa gas-slido (es uno de los escasos ejemplos). Los
slidos empleados suelen separar los gases en funcin del tamao molecular. Como
detector suele usarse el de conductividad trmica.
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6. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
1. Introduccin
2. Instrumentacin
3. Cromatografa de particin
4. Cromatografa de adsorcin
5. Cromatografa inica
6. Cromatografa de exclusin por tamaos

6.1 Introduccin
Entre las tcnicas cromatogrficas cuya fase mvil es un lquido la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC) es la ms utilizada. Esta tcnica deriva de una
evolucin de la cromatografa preparativa en columna, en la que la cromatografa se
realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500
cm. Para que el flujo de fase mvil fuese razonablemente rpido las partculas de fase
estacionaria deban ser de gran dimetro (150-200 m), lo que se traduca en una
separacin poco eficaz y, a pesar de todo, lenta. Para aumentar la eficacia de la
separacin y as incrementar la resolucin era necesario emplear fases estacionarias
con tamao de partcula mucho menor (entre 2 y 5 m), ya que la difusin de los
solutos entre las fases mvil y estacionaria se hace ms rpida. Pero ello implica la
necesidad de impulsar la fase mvil con un sistema de alta presin, nace as la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

6.2. Instrumentacin general
Un cromatgrafo de lquidos consta de una serie de elementos indispensables,
normalmente constituyendo mdulos con funciones bien definidas. La circulacin de
fase mvil entre los distintos mdulos se hace a travs de conductos tubulares. Deben
emplearse siempre dimetros de tubo muy pequeos a fin de reducir el efecto del
ensanchamiento de banda extracolumnar.
Los elementos indispensables en cualquier cromatgrafo de HPLC son: sistema de
suministro de fase mvil (con depsito de disolventes y bomba de alta presin),
sistema de inyeccin y detector continuo. Existen adems otros elementos adicionales
que pueden mejorar algunos aspectos de la separacin o la deteccin.

a) Sistema de suministro de fase mvil
Todos los equipos de HPLC incluyen un sistema de bombeo de fase mvil de alta
presin para forzar el paso de la fase mvil a travs de la columna, cuyo relleno muy
compacto, es responsable de una importante sobrepresin. Los requisitos del sistema
16
de bombeo en HPLC son muy rigurosos ya que en algunos detectores las
fluctuaciones en el flujo de fase mvil dan lugar a fluctuaciones de la seal,
produciendo un ruido de fondo que impide la observacin de seales dbiles. En
HPLC es deseable que el control y la reproducibilidad del caudal de fase mvil sean
mejores que el 0.5%. Existen diferentes tipos de bombas de alta presin con distintas
caractersticas, ventajas e inconvenientes. Las ms frecuentes son bombas de pistn.

En HPLC, para una fase estacionaria concreta, la naturaleza de la fase mvil es el
factor clave en la separacin. Puede trabajarse en dos modalidades:
Isocrtica: la composicin de la fase mvil permanece constante durante la
separacin
En gradiente: la composicin se va modificando durante la separacin. Para trabajar
en esta modalidad el cromatgrafo debe disponer de un sistema de programacin de
gradiente, que permita la mezcla reproducible de disolventes en distintas proporciones
durante la separacin cromatogrfica.

Un requisito tcnico importante es que los disolventes empleados deben carecer de
gases disueltos, ya que estos pueden provocar serios problemas por formacin de
burbujas. Es frecuente por ello la desgasificacin de los disolventes.

b) Sistema de inyeccin de muestra
La inyeccin de un volumen preciso de muestra debe hacerse a la entrada de la
columna en un corto perodo de tiempo para perturbar lo menos posible el rgimen de
circulacin de fase mvil establecido en la columna y el detector. Adems, los
volmenes empleados son pequeos, unos pocos microlitros, lo que se traduce en
muchos casos en que el factor limitante de la reproducibilidad del mtodo es la
reproducibilidad con que puede introducirse la muestra en la columna. El sistema ms
utilizado son vlvulas rotatorias de alta presin de varias vas manuales o
automatizadas. Estas vlvulas posen dos posiciones. En la posicin de llenado la
bomba y la columna estn comunicadas y la muestra se introduce a presin
atmosfrica con ayuda de una jeringa en un pequeo depsito de forma tubular
(bucle). El bucle puede escogerse de diferente volumen (5-500 L). En la posicin de
inyeccin gracias a la rotacin de la vlvula la muestra es arrastrada por el flujo de la
fase mvil e introducida en la columna.

c) Columna cromatogrfica
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Las columnas de HPLC son tubos rectos de acero que miden entre 3 y 30 cm de
longitud. Su dimetro entre 2 y 5 mm. La fase estacionaria se mantiene entre dos
discos porosos situados en los extremos de la columna.
En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas:
- Relleno pelicular: se utilizan bolitas de vidrio o polmero no porosas esfricas de
dimetro entre 30-40 m. Sobre su superficie se deposita una capa delgada de
partculas muy pequeas (2-5 m) gel de slice, almina o un cambiador inico que
actan como fase estacionaria. Si la fase estacionaria es lquida se coloca una fina
pelcula de lquido sobre las esferas no porosas.
- Partculas porosas: se trata de micropartculas porosas con tamaos entre 3-10 m
de slice, almina o cambiadores inicos, que actan como fases estacionarias.
Tambin pueden recubrirse con pelculas orgnicas lquidas retenidas por adsorcin.
Son mas fciles de empaquetar pero menos eficaces que las segundas
Adems pueden emplearse fases enlazadas, que son generalmente partculas de gel
de slice modificadas qumicamente. Estas resultan mucho ms estables que los
lquidos retenidos fsicamente.

Muchas veces para alargar la vida de la columna analtica se atizan precolumnas con
objeto de retener impurezas de la muestra que podran perjudicar la columna
croamatografica. El relleno de la precolumna es similar al de la columna analtica pero
con mayor tamao de partcula.

En HPLC no suele ser necesario un control estricto de la temperatura de la colunma,
aunque si resulta aconsejable controlarla en un intervalo de unos pocas dcimas de
grado para obtener resultados ms reproducibles.

d) Detector
Un detector ideal en HPLC debe ser sensible a pequeas concentraciones de analito,
dar una respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo
que dura el cromatograma. Adems, en caso de que se utilice gradiente debe ser
insensible a los cambios de composicin de la fase mvil. Es tambin importante que
la celda de flujo del detector tenga un volumen mnimo para no provocar
ensanchamiento de las bandas. La mayora de los detectores empleados responden a
alguna propiedad caracterstica de los compuestos a analizar aunque existen tambin
detectores que responden a la variacin de una propiedad de la fase mvil debido a la
presencia de solutos.
Algunos de los detectores ms usados son:
18
Detectores espectrofotomtricos. Miden la absorbancia a una o varias longitudes de
onda en el ultravioleta o en el visible. La fase mvil no debe ser muy absorbente. Es
muy frecuente emplear deteccin en UV a 254 nm donde absorben gran cantidad de
compuestos orgnicos. En instrumentos ms verstiles pueden seleccionarse otras
longitudes de onda e incluso registrar espectros completos. Este detector puede
emplearse con gradiente si se utilizan disolventes no absorbentes.

Detectores de fluorescencia: miden la emisin fluorescente por parte de los analitos.
Es un detector muy sensible, pero aplicable solo a compuestos fluorescentes. Su
campo de aplicacin puede ampliarse mediante reacciones de formacin de
compuestos fluorescentes que se realizan en el propio sistema cromatografico
mediante un reactor situado antes o despus de la columna de separacin.

Detectores electroqumicos: se basan en mtodos electroanalticos como la
amperometra, coulombimetra, voltamperometra. Detectan compuestos
electroactivos, es decir, susceptibles de sufrir reacciones de oxidacin o reduccin.
Tambin puede emplearse medidas de conductividad elctrica.

Detectores refractomtricos: se basan los cambios del ndice de refraccin de la
fase mvil por la presencia de un soluto. En general su funcionamiento se basa en lo
que sucede cuando un haz luminoso pasa a travs de una celda que est dividida en
dos compartimientos, uno de los cuales contiene el disolvente empleado como fase
mvil y el otro el efluente de la columna. Cuando no se esta eluynedo ningn soluto el
ndice de refraccin de los lquidos contenidos en los dos compartimientos es igual y el
haz no sufre ningn desplazamiento. Sin embargo, cuando algn componente es
eluido la diferencia entre los ndices de refraccin hace que el haz de luz se desplace,
provocando un cambio en la seal proporcional a la concentracin de soluto. Se trata
de un detector universal. Es menos sensible que los detectores espectrofotomtricos y
adems se ve muy afectado por los cambios de temperatura y no puede utilizarse en
gradiente.

Otros detectores ms complejos pueden proporcionar informacin ms especfica que
permita la identificacin inequvoca de compuestos, proporcionando mucha ms
informacin cualitativa que el tiempo de retencin.

6.3. Cromatografa de particin
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Se trata probablemente del tipo ms usado de cromatografa lquida de alta resolucin.
En ella se considera tanto el uso de fases lquidas retenidas sobre un soporte slido
como el de fases enlazadas unidas qumicamente al soporte slido.
La separacin de los solutos se basa en la diferente solubilidad entre las fases mvil y
estacionaria. En general la fase estacionaria debe tener polaridad semejante a la de
los analitos y la fase mvil se escoge de diferente polaridad (aunque no tan diferente
que el tiempo de retencin sea excesivamente largo).

Suele hablarse de dos tipos de cromatografa de particin:
Cromatografa en fase normal: emplea fases estacionarias polares y la mvil es poco
polar.
Cromatografa en fase inversa: la fase estacionaria es apolar y la fase mvil polar. En
ella los compuestos polares son eluidos ms rpido que los apolares, al contrario que
en cromatografa en fase normal. Actualmente es la ms utilizada.

La fase estacionaria ms usada es gel de slice (polar) modificado para variar su
caractersticas, reteniendo lquidos o fases enlazadas de diferente polaridad.

Una vez fijada la fase estacionaria las caractersticas de la fase mvil son el factor
clave de la separacin cromatogrfica. Las fases mviles se caracterizan por los su
capacidad de desplazamiento y selectividad. En fase normal los disolventes polares
eluyen ms rpidamente (tienen mayor capacidad de desplazamiento) mientras que en
fase inversa es al revs. La selectividad se basa en las interacciones especficas entre
el soluto y la fase mvil. Puede emplearse elucin isocrtica o en gradiente.

La aplicacin tpica de la cromatografa de reparto es la separacin y determinacin de
compuestos orgnicos. En medio ambiente son especialmente destacables las
determinaciones de residuos de plaguicidas (herbicidas, fungicidas e insecticidas),
fenoles, e hidrocarburos (PCBs, PAHs, etc).

Un tipo particular de cromatragrafa de reparto en fase inversa es la cromatografa de
pares inicos. Se emplea para la separacin y determinacin de especies inicas
voluminosas. La fase mvil est formada por una disolucin acuosa que contiene
cierta proporcin de un disolvente orgnico miscible (ej: acetonitrilo o metanol) y un
compuesto inico que aporta un contrain de carga opuesta a los analitos. Este in se
combina con los analitos formando un par inico, que es una especie neutra que
puede interaccionar y ser retenida por la fase estacionaria apolar. Suele emplearse
20
para la determinacin de iones grandes, como los surfactantes. Tambin ha ofrecido
buenos resultados para iones como nitrato (NO
3
-
) y clorato (ClO
3
-
).

6.4. Cromatografa de adsorcin
En la cromatografa de adsorcin el relleno slido de la columna acta como fase
estacionaria. Las fases estacionarias tpicas son slice y almina ambas polares.
Como la fase estacionaria es polar suelen emplearse fases mviles apolares o
moderadamente polares. Para seleccionar la fase mvil suele considerarse no slo la
polaridad sino tambin la fuerza eluyente, que es un parmetro relacionado con la
energa de adsorcin del disolvente por unidad de superficie (parmetro que tambin
depende del adsorbente). Las fases tpicas son hexano, isooctano y diclorometano. La
seleccin es emprica y es frecuente el empleo de mezclas. Esta cromatografa es
menos usada que la de reparto.

6.5. Cromatografa inica
En cromatografa inica se emplean cambiadores de iones como fases estacionarias.
Los cambiadores de iones son redes tridimensionales de macromolculas con ciertas
cargas electrostticas fijas por unidad estructural. Pueden tomar iones de una
disolucin electroltica y ceder otros de la misma carga en cantidad equivalente. Por lo
tanto, los procesos de intercambio inico se basan en los equilibrios de intercambio
entre los iones de una disolucin y los iones del mismo signo que se encuentran
retenidos sobre la superficie de un slido insoluble de elevada masa molecular
(cambiador de iones):
(R
-
A
+
)
s
+(B
+
)
aq
(R
-
B
+
)
s
+(A
+
)
aq
Cambiador de cationes
(R
+
A
-
)
s
+(B
+
)
aq
(R
+
B
-
)
s
+(A
-
)
aq
Cambiador de aniones

Se trata de un equilibrio heterogneo. La constante que rige este equilibrio se llama
coeficiente de selectividad y se suele representar como E
A
B
. Cuanto mayor es el valor
de E
A
B
tanto mayor ser la afinidad de B por el cambiador inico comparada con la de
A. Para facilitar la comparacin entre distintos iones suele usarse E
H
catin
y E
OH
anin
.
En
general los iones de mayor carga y menor radio hidratado son ms fuertemente
retenidos.

Los rellenos de cambio inico empleados como fases estacionarias suelen ser
polmeros activados introduciendo en su estructura grupos funcionales cargados,
generalmente cidos o bsicos. Son frecuentes por ejemplo los cambiadores con
grupos -SO
3
-
, -COO
-
, -NR
4
+
.
21
La fase mvil en cromatografa de cambio inico suele ser una disolucin acuosa (con
cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua) que
contiene especies inicas en forma, generalmente, de disolucin reguladora del pH
(variable clave en la elucin). Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por
los sitios activos de la fase estacionaria. Por ello, la fuerza eluyente y la selectividad
de la fase mvil dependen del tipo y concentracin de iones aadidos.

La cromatografa inica tard en desarrollarse debido a la falta de un buen sistema de
deteccin. La eleccin evidente es un detector conductimtrico. El problema surge
debido a la elevada concentracin inica de necesaria para eluir a la mayora de los
iones en un tiempo razonable. Ello hace que la conductividad de la propia fase mvil
sea muy elevada haciendo muy difcil la deteccin de pequeas concentraciones de
analito. Este problema se resolvi mediante un sistema supresor de conductividad
colocado a la salida de la columna cromatogrfica. Los primeros sistemas supresores
utilizados fueron columnas de intercambio inico que convierten los iones del
disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras.
As, por ejemplo, cuando se separan cationes es frecuente emplear una disolucin de
HCl como eluyente. La columna supresora es aninica y contiene ines OH
-
. Al paso
de la fase mvil por la columna supresora los Cl
-
son intercambiados por iones OH
-
.
De este modo se ha sustituido el HCl muy conductor por H
2
O poco conductora. En la
separacin de iones es frecuente usar HCO
3
Na y CO
3
Na
2
en la fase mvil. La columna
supresora es en este caso catinica. De este modo el Na
+
es sustituido por H
+

formndose un electrolito dbil como H
2
CO
3
.
El inconveniente de este sistema es la necesidad de regenerar peridicamente la
columna supresora. Ms recientemente se han desarrollado otros sistemas supresores
(supresores de membrana) que operan en modo continuo. El eluyente y la disolucin
regeneradora fluyen en direcciones opuestas a ambos lados de unas membranas
semipermeables cambiadoras de iones. Tambin, se han descrito sistemas en lo que
no se emplea sistema supresor, sino una columna cromatografica con un cambiador
inico de baja capacidad lo que permite emplear como fase mvil disoluciones con
pequea concentracin de iones.
Adems del detector conductimtrico pueden emplearse otros detectores, como la
deteccin absorciomtrica en UV-visible. Para ello es necesario que los analitos
absorban radiacin ultravioleta o visible. Si esto no ocurre puede emplearse una fase
mvil que contenga alguna especie absorbente detectndose los solutos
indirectamente por la disminucin de la absorcin de la fase mvil.

22
La cromatografa inica tiene importantes aplicaciones en anlisis de aguas. La
determinacin de cationes funciona bien para alcalinos y alcalinoterros. Para otros
cationes la diferencia en los coeficientes de selectividad no es suficiente para permitir
la separacin directa y son necesarios otros mtodos como la formacin de especies
que si presenten ms diferencia. En cambio, para la determinacin de aniones en
aguas resulta uno de los mejores mtodos posibles. Con cromatografa inica pueden
determinarse los iones ms habituales de forma mucho ms rpida que empleando
mtodos individuales de anlisis para cada uno.

6.6. Cromatografa de exclusin por tamaos
Se denomina tambin cromatografa en geles permeables, de filtracin en geles o de
exclusin molecular. Los rellenos estn constituidos por pequas partculas
polimricas que contienen una red de poros en la que pueden difundir las molculas
de soluto y disolvente. La base de la separacin es la capacidad del soluto para
penetrar en los poros de la fase estacionaria. Las molculas con un tamao
significativamente menor que el de los poros atraviesan la columna entera sin ser
retenidos. Los solutos demasiado grandes como para penetrar en los poros tampoco
resultan retenidos. En cambio las molculas de tamao intermedio se separan en
funcin de su tamao. Este tipo de cromatografa se aplica para la separacin de
especies de elevado peso molecular (polmeros y biomolculas como las protenas).