A Clonagem Posicional

Monograas SBG
A clonagem posicional uma abordagem para

o estudo do genoma funcional
Ana Lcia Brunialti Godard
2008, dos autores
Direitos reservados desta edio
Sociedade Brasileira de Gentica
Diagramao, reviso, capa e projeto grfco
cubo multimidia
Editora SBG
Sociedade Brasileira de Gentica
Ribeiro Preto, SP
Godard, Ana Lcia Brunialti
A clonagem posicional - uma abordagem para
o estudo do genoma funcional. / Ana Lcia Brunialti
Godard - Ribeiro Preto: SBG, 2008.
151p.
ISBN - 978-85-89265-04-1
I. Autor. II. Ttulo.
Sumrio
INTRODUO ............................................................................................ 11
A anlise da funo gnica atravs da estratgia descendente ................ 12
A anlise da funo gnica pela estratgia ascendente ........................... 13
MODELO ANIMAL ..................................................................................... 14
Vantagens de se utilizar o camundongo como modelo animal .................. 15
O genoma murino..................................................................................... 17
Para onde vamos agora? ............................................................................ 20
A MUTAO PROGRESSIVE MOTOR NEURONOPATHY (pmn) ................. 24
Descrio clnica ...................................................................................... 24
Dados anatomopatolgicos ....................................................................... 24
Msculos e nervos perifricos .............................................................. 24
Medula Espinal .................................................................................... 25
O PRINCPIO GERAL DA CLONAGEM POSICIONAL .................................. 28
O mapeamento gentico ........................................................................... 30
O mapeamento da mutao sobre um cromossomo particular............. 30
A construo de um mapa gentico de alta densidade e de alta resoluo
ao redor do gene mutado .................................................................... 31
Microssatlites X SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) .................. 38
O mapeamento fsico ................................................................................ 39
A eletroforese em campo pulsado ........................................................ 40
Os PAC, YAC e BAC ............................................................................ 41
Salto e caminhada sobre o cromossomo: chromosome jumping e chromoso-
me walking .......................................................................................... 42
Isolamento das seqncias codicadoras .................................................. 43
Conservao ao longo da evoluo: Zooblots ...................................... 44
A anlise de Northern blot ................................................................... 44
A amplicao de xons ou Exon trapping ........................................... 45
A captura do DNA por afinidade ou DNA affinity capture ou DNA
selection .............................................................................. 45
A sondagem de biblioteca de cDNA .................................................... 46
Os mtodos baseados na anlise das ilhas CpG ................................... 47
O sequenciamento genmico .............................................................. 49
As outras tcnicas ................................................................................ 49
A identicao direta do cDNA candidato ................................................ 50
Isolamento de um mensageiro completo ................................................... 51
A identicao do bom candidato ............................................................ 52
A clonagem posicional nos tempos atuais ................................................. 53
ESTUDO DE CASO ...................................................................................... 56
Mapeamento gentico do lcus pmn ........................................................ 56
Localizao cromossmica da mutao pmn (BRUNIALTI et al., 1995) 56
Mapa gentico humano ....................................................................... 58
Construo de um contig contendo o lcus pmn ...................................... 58
Isolamento e caracterizao preliminar dos YAC que contm D13Mit215,
D13Mit305, D13Mit115, Gli11 e Gli20 ................................................. 59
Isolamento e caracterizao preliminar dos BAC contendo os marcadores
D13Mit215, Gli11, Gli20 e D13Mit115 .................................................. 60
Mapa fsico ao redor do lcus pmn ........................................................... 61
Isolamento e caracterizao dos xons a partir do DNA do contig ............ 63
As EST ...................................................................................................... 64
A MUTAO pmn: UM MODELO DE NEUROPATIAHUMANA .................. 66
pmn: um modelo potencial para a patologia neuromuscular humana ........ 66
pmn: uma mutao de efeitos independentes ...................................... 66
pmn no o lcus homlogo ao lcus responsvel pela amiotroa espinal
do tipo Werdnig Hoffmann humana .................................................... 66
pmn: um bom modelo anlogo s amiotroas espinais ............................. 67
pmn, onde est o mal? ......................................................................... 68
A etapa seguinte ....................................................................................... 69
Podemos denir o perl de um gene candidato? ....................................... 70
FINAL DA HISTRIA .................................................................................... 72
MATERIAL E MTODOS UTILIZADOS NO ESTUDO DA MUTAO pmn .. 73
Origem dos alelos mutantes e das linhagens utilizadas .............................. 73
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do mapa gentico .....74
Cruzamentos realizados ....................................................................... 74
Extrao do DNA ................................................................................ 74
Reao em cadeia da polimerase (PCR) ............................................... 75
Iniciadores .................................................................................... 75
Condies de amplicao ........................................................... 75
Anlise dos produtos de PCR ......................................................... 76
Anlise do polimorsmo dos microssatlites pela SSCP ................. 76
Anlise dos resultados ................................................................... 77
A coleo de DNA do EUCIB ................................................................... 77
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do mapa fsico .... 77
Preparao do DNA de levedura em blocos de agarose (adaptado de
BIRREN at al., 1993) ....................................................................77
Eletroferese e campo pulsado e hibridizao........................................ 78
Isolamento das extremidades dos cromossomos articiais de levedura pela
PCR-inversa (adaptado de ARVEILER; PORTEUS, 1991) ........................ 79
Mapa de restrio do contig de YAC .................................................... 80
Preparao do DNA genmico a partir do BAC ................................... 81
Isolamento e caracterizao das seqncias codicadoras ........................ 82
RT-PCR ................................................................................................ 82
Amplicao dos xons ...................................................................... 83
O vetor pSPL3 ............................................................................... 83
Transfeco das clulas COS-7 ...................................................... 84
Isolamento do RNA citoplasmtico ................................................ 84
Amplicao e clonagem dos xons capturados ............................ 84
Sequenciamento ....................................................................................... 86
Mtodos .............................................................................................. 86
Anlise das seqncias ........................................................................ 86
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................. 87
ANEXO I- FIGURAS ................................................................................... 107
ANEXO II- TABELAS ................................................................................... 148
Lista de Figuras
Figura 1: As estratgias da clonagem ........................................................... 107
Figura 2: Mutao alcaptonria (aku). ......................................................... 108
Figura 3: Animal modelo da fenilcetonria (PKU) humana. ......................... 109
Figura 4: Relaes evolutivas entre os modelos mais utilizados em laboratrio. ..110
Figura 5: Oxford Grid. .................................................................................. 111
Figura 6: A mutao pmn ............................................................................112
Figura 7: Cortes histolgicos. ........................................................................113
Figura 8: Nervo frnico. ..............................................................................114
Figura 9: Fentipo obeso. ............................................................................115
Figura 10: Principio da clonagem posicional. ................................................116
Figura 11: Tipos de cruzamentos utilizados nos projetos de mapeamento. ....117
Figura 12: Estratgias do mapeamento. ........................................................118
Figura 13: rvore flogentica da ordem muridae. ........................................119
Figura 14: Ilustrao do principio de RFLP (Polimorfsmo de Comprimento de
Fragmentos de Restrio. .......................................................................... 120
Figura 15: Meios microssatlites e sua deteco. ...........................................121
Figura 16: SSCP - Alelos e sua deteco. .................................................... 122
Figura 17: Mapa comparativo das regies de ortologia entre o cromossomo 13 murino
( direita) e os segmentos cromossmicos 1, 3, 5, 6, 7, 9 e 10 humanos. ............123
Figura 18: Princpio da clonagem em YAC. ...................................................124
Figura 19: Construo do vetor BAC. .......................................................... 125
Figura 20: Ilustrao da tcnica do salto no cromossomo. ............................126
Figura 21: A marcha sobre o cromossomo. ...................................................127
Figura 22: Princpio da amplifcao dos xons internos ou xon-Trapping. ...128
Figura 23: Captura de cDNA por afnidade ................................................. 130
Figura 24: Principio da RACE. ......................................................................131
Figura 25: Identifcao da mutao. ..........................................................132
Figura 26: Hapltipo. .................................................................................. 134
Figura 27: Cruzamento intra-especifco. ........................................................135
Figura 28: Mutao Extra-toe e o estoque balanceado. ............................ 136
Figura 29: Localizao precisa dos marcadores microssatlites no cromossomo 13
murino. ........................................................................................................137
Figura 30: Mapa gentico parcal da regio cromossmica de interesse. ....... 138
Figura 31: Anlise pela eletroforese em campo pulsado dos YAC Y902.2, Y903.1 e
Y13.115. ...................................................................................................... 139
Figura 32: Organizao dos YAC. ................................................................ 140
Figura 33: Anlise por Southern blot da extremidade esquerda do clone Y902.2. .... 141
Figura 34: Mapa de restrio do contig de YAC que cobre a regio pmn. .... 142
Figura 35: Localizao dos xons e das ESTs. ............................................... 143
Figura 36: Anlise pela PCR das EST humanas E7 (A006127) e E2 (WL9635). ... 144
Figura 37: Isolamento das extremidades do YAC atravs da PCR inversa. ..... 145
Figura 38: Principio da amplifcao dos xons internos ou xon-Trapping. .. 146
Figura 39: O vetor de expresso pSPL3. .......................................................147
Lista de Tabelas
Tabela 1...................................................................................................... 148
Tabela 2...................................................................................................... 149
Tabela 3...................................................................................................... 149
Tabela 4...................................................................................................... 150
Tabela 5...................................................................................................... 150
Tabela 6...................................................................................................... 150
Tabela 7...................................................................................................... 150
Tabela 8.......................................................................................................151
APRESENTAO
Tese de Doutorado apresentada no Programa
de Ps-Graduao em Gentica Humana da
Universidade Pierre e Marie Curie Paris VI
Frana, sob a orientao do Dr. Jean-Louis
Gunet.
11
INTRODUO
Para que um dia se possa conhecer a funo da totalidade
dos genes que compem o genoma humano e dos mamferos, os
geneticistas modernos possuem, de forma geral, duas estratgias
(Figura 1).
A primeira, a qual podemos chamar de estratgia
descendente, consiste em recuperar as seqncias codicadoras
de um gene, seja pelo seqenciamento direto do DNA, seja
pelas seqncias codicadoras do produto de transcrio. Em
seguida, uma vez identicadas, tais seqncias so modicadas
de maneira a inativar a funo do gene correspondente. Essa
estratgia consiste na induo de uma mutao, que, em geral,
acarreta o aparecimento de um alelo nulo no-funcional de uma
seqncia codicadora desconhecida e, por meio do estudo dos
efeitos provocados por essa mutao, poderemos compreender,
enm, a funo desse gene.
A segunda estratgia, dita ascendente, consiste, ao
contrrio da primeira, em analisarem-se as conseqncias de
uma alterao que apareceu de forma espontnea para podermos
chegar ao gene responsvel. Essa estratgia tambm chamada
de gentica inversa ou clonagem posicional. Ela possibilita
um estudo aprofundado de uma mutao qualquer, visto que
podemos obter sua localizao gentica, e, como trabalhamos
com um fentipo anormal, podemos efetuar anlises detalhadas
sobre vrios aspectos que nos conduzem ao gene responsvel.
Justica tal estratgia a possibilidade de se obter um animal de
laboratrio com uma mutao que apresente fortes semelhanas
aos de uma doena humana geneticamente determinada.
Esse animal passa, ento, a ser considerado um modelo dessa
sndrome humana e, com o estudo dele, poderemos adquirir
rapidamente informaes preciosas e transponveis ao homem.
Essas duas estratgias so teoricamente opostas, mas,
como veremos mais adiante, elas acabam se complementando.
12
Introduo
A anlise da funo gnica atravs da estratgia
descendente
O seqenciamento sistemtico do genoma, o qual j
foi realizado para vrios microorganismos, culminando com o
genoma humano em 2001 (VENTER et al., 2001; LANDER et
al., 2001) e com o dos camundongos em 2002 (WATERSTON
et al., 2002), representa um empreendimento facilmente
automatizvel e apresenta a vantagem de nos levar diretamente
ao conhecimento profundo e ntimo da estrutura genmica do
organismo estudado. Infelizmente, essa estratgia extremamente
cara para um organismo de grande complexidade como o
homem, por exemplo, no qual a proporo de seqncias
codicadores innitamente minoritria em relao s demais.
A construo de bibliotecas de cDNA a partir de
molculas de RNA mensageiro transcritas num tecido ou rgo
em particular representa uma vantagem considervel em relao
ao seqenciamento direto, mas ela no permite a identicao
de todos os genes. Ns sabemos que, em mdia, 20% dos
genes transcritos num dado tecido aparecem na forma de
mRNA em populaes minoritrias e, portanto, de difcil acesso.
Sabemos, igualmente, que vrios genes so transcritos durante
um perodo de tempo muito curto e que o isolamento desses
genes numa biblioteca de cDNA completamente aleatrio.
Enm, no podemos nos esquecer dos genes constitutivos
(ou genes de manuteno), transcritos o tempo todo, os quais
acabam atrapalhando o isolamento dos outros genes. Porm,
mesmo com todos esses inconvenientes, vrios programas
para a identicao e o seqenciamento destas seqncias
codicadoras foram lanados e ns observamos que, desde
1997, mais de 16.500 EST (Expressed Sequence Tag) foram
localizadas no genoma humano e, entre elas, apenas 2.600 j
eram conhecidas.
Uma vez identicadas essas seqncias transcritas, podem
elas ser mapeadas, servindo de marcadores moleculares, a m
de se densicar um mapa gentico, e, enm, no isolamento do
13
Introduo
cDNA completo. A partir deste, as vias esto abertas a todas as
manipulaes para se conhecer a funo do gene por meio da
sua invalidao.
A anlise da funo gnica pela estratgia ascendente
Como j foi mencionado anteriormente, essa estratgia
consiste na identicao de genes a partir de mutaes
espontneas ou induzidas que so identicadas por seus efeitos
fenotpicos. Essa estratgia, a qual tambm podemos chamar
de gentica inversa ou de clonagem posicional, demanda
um grande nmero de cruzamentos envolvendo os animais
portadores das mutaes para os estudos. Primeiramente,
comeamos com o estudo de ligao ou mapeamento gentico
da patologia de alta densidade e preciso; em seguida,
estabelecemos um mapa fsico da regio mapeada. Tal estratgia
s permite a identicao de um nmero minoritrio de genes
que, quando mutados, levam ao aparecimento de um fentipo
facilmente observado ab tero. Em compensao, ela oferece a
vantagem de partir de um fentipo que pode ser analisado sob
vrios aspectos anatmico, histolgico, siolgico, molecular,
etc , para podermos chegar ao gene responsvel.
Essa estratgia particularmente justicada quando
possumos uma mutao observada no animal de laboratrio,
na qual os efeitos patolgicos apresentam analogias com
aqueles observados numa doena gentica humana, pois, nesse
caso, o animal considerado um modelo potencial para a
patologia humana. O estudo e a clonagem do gene no animal,
sendo mais rpidos, nos permitiriam, ento conhecer facilmente
o gene responsvel pela doena no homem (exemplos nas
Tabelas 1 e 2).
14
MODELO ANIMAL
Como foi citado anteriormente, a estratgia da clonagem
posicional particularmente interessante quando temos um
modelo animal de uma patologia humana. Entretanto, antes de
considerarmos um organismo como um modelo, devemos
saber o que exatamente um animal modelo.
Modelos animais so preparaes experimentais
desenvolvidas em determinada espcie com o propsito de
se estudarem fenmenos que ocorrem em uma outra espcie
(MCKINNEY, 1984). Estes so vlidos se apresentarem as
mesmas estruturas envolvidas no comportamento ou na
patologia humana em estudo (KAPLAN, 1973). Geralmente,
os modelos animais aparecem como resultado de mutaes,
espontneas ou induzidas, que levam a uma alterao fenotpica
em decorrncia de um produto protico no-funcional ou
ausente. Uma grande coleo de mutaes foi obtida ao longo
da histria da gentica de camundongos, cobrindo alteraes
em quase todas as classes fenotpicas. Entre elas, podemos citar
mutaes produzindo obesidade, malformaes no sistema
auditivo, perda de plos e mudana de sua estrutura, nanismo,
anemia, desordens metablicas e imunolgicas com nveis de
severidade variveis, entre outras (GODARD; GUNET, 1999).
Uma grande quantidade desses mutantes apresenta fentipos
que se assemelham fortemente queles observados em certas
doenas humanas, podendo essas homologias se estender ao
nvel molecular (GODARD; GUNET, 1999). A importncia
desses modelos reside na possibilidade de se proporcionar
uma melhor compreenso das patologias humanas, servindo
como ferramentas para se tentar elucidar as vias bioqumicas
e siolgicas envolvidas nas doenas e possibilitando uma
identicao de alvos que permitam o desenvolvimento de
drogas teraputicas (MOORE, 1999).
Muitos modelos j foram obtidos em vrios laboratrios.
Entre eles, podemos citar a descoberta do modelo murino,
que apresenta caractersticas fenotpicas bastante semelhantes
15
Modelo Animal
s da alcaptonria humana (Figura 2), o que permitiu o
mapeamento da mutao homloga (simbolizada por aku) no
cromossomo 16 de camundongo e, por ortologia, a localizao
marcadores humanos no cromossomo 3 ligados ao gene do
cido homogentsico oxidase. Um segundo modelo aquele
que apresenta uma distroa muscular ligada ao cromossomo X
decorrente de uma mutao espontnea no gene mdx, levando
os animais a apresentar nveis elevados de creatina cinase e
piruvato cinase no plasma. O lcus mdx se mostrou homlogo
ao gene que codica a distrona. No homem, mutaes nesse
gene podem levar Distroa Muscular de Duchenne ou Becker.
Esses mutantes foram de extrema importncia porque permitiram
a demonstrao de que a falta de distrona no era a principal
causa da doena humana. Outro exemplo o modelo que
apresenta a Sndrome da Hiperfenilalaninemia (HPH) (Figura 3)
associada com a mutao hph1, que leva a uma ausncia de
guanosina trifosfato ciclohidrolase (GTP-CH). Esse mutante
considerado o modelo da fenilcetonria humana (PKU). Vrios
alelos deletrios no lcus da fenilalanina hidroxilase (Pah)
responsveis por levar a sndromes com diferentes nveis de
gravidade foram isolados em camundongos. Estes possibilitaram
pela primeira vez uma explicao molecular para o fenmeno
de expressividade varivel na fenilcetonria humana. O mutante
Clock, isolado por Vitaterna em 1994, permitiu um estudo inicial
sobre um ritmo circadiano especco envolvido na atividade
locomotora, resultando no isolamento do gene candidato Clock,
por clonagem posicional.
Vantagens de se utilizar o camundongo como modelo
animal
Entre todos os organismos modelos conhecidos
atualmente, o camundongo o escolhido por apresentar vrias
caractersticas peculiares que o colocam frente em relao
a outros modelos animais. A primeira dessas caractersticas
diz respeito ao fato de o camundongo possuir um tempo de
gerao curto (um lhote recm-nascido pode se tornar um
adulto em idade reprodutiva em 11 semanas) e bastante
16
Modelo Animal
prolco. As fmeas podem carregar muitos embries por
gestao, e a possvel morte de algum deles no compromete
o desenvolvimento dos outros e no pe m gravidez. Em
laboratrio, fcil a manipulao e criao dessa espcie,
alm de ser possvel realizao de cruzamentos controlados
com o intuito de promover endogamia como, por exemplo,
cruzamentos do tipo irmos versus irms. Isso leva, ao longo
das geraes, ao aparecimento de populaes extremamente
homogneas do ponto de vista gentico, isto , os animais so
como clones e so virtualmente homozigotos para todos os loci,
caracterizando as linhagens isognicas (GUNET, 1998).
Como mencionado por Silver (1995), o perodo de
divergncia evolutiva entre o homem e o camundongo, h
cerca de 60 milhes de anos, o mais recente em relao aos
outros modelos animais disponveis, como Xenopus, Drosophila
melanogaster e C. elegans (Figura 4). Assim, a enorme homologia
existente tanto no nvel genotpico quanto no fenotpico
(siologia, patologia, vias metablicas) entre as duas espcies
justica fortemente a escolha desta em relao s outras para
o isolamento de modelos. O DNA codicador do camundongo
possui uma homologia em relao ao do humano que pode
variar de 70 a 90% (STRACHAN; REED, 2002), maximizando
as chances de se encontrarem genes ortlogos (mesmo gene
em diferentes espcies) nas duas espcies. A relao entre os
loci ortlogos do camundongo e os do homem pode ser mais
bem visualizada pelo Oxford Grid (Figura 5), desenvolvido
inicialmente por John Edwards em 1991 (LYON, 2002) e que
atualizado diariamente. Em consulta realizada no MGI em 04
de agosto de 2003, mais de 9.800 regies de homologia entre
o camundongo e o homem estavam disponveis no banco de
dados. E esse nmero continua crescendo.
Depois do homem, o camundongo o mamfero que
possui o genoma mais bem estudado e conhecido, devido
grande quantidade de marcadores genticos e de mutaes
j isoladas e da possibilidade de se obterem proles viveis e
frteis a partir de cruzamentos interespeccos, permitindo a
17
Modelo Animal
observao da segregao de polimorsmos de vrias classes
(GUNET, 1998).
O genoma murino
Em 2002 foi publicado o sequenciamento completo
do genoma de camundongos (WATERSTON et al., 2002). A
comparao dos mapas gentico das duas espcies indica que
mais de 90% dos dois genomas podem ser posicionados em
regies conservadas de sintenia, nas quais a ordem dos genes foi
conservada em ambas as espcies. J ao nvel do nucleotdeo,
aproximadamente 40% do genoma humano pode ser alinhado
ao genoma do camundongo.
Um esboo da seqncia genmica do camundongo,
representando 96% do genoma da eucromatina j est
disponvel (Tabela 3). Atravs da anlise destas seqncias
podemos constatar que os genes, como esperado dos estudos
precedentes, representam somente uma parcela pequena dos
genomas de mamferos. No camundongo, o nmero de genes
codicadores de protenas foi estimado entre 30.000 40.000,
mesmo nmero que no homem. A anlise da seqncia indica
que h uma correlao positiva entre a densidade de genes e
o contedo (G+C), com 75-80% dos genes que residem nas
regies do genoma ricas em (G+C). O catlogo dos genes
murino contm 29.201 transcritos preditos que correspondem
a 22.011 genes que contm aproximadamente 213.562 xons
distintos. Muitos genes detectados no genoma do camundongo
so novos e no foram identicados previamente. H tambm
9.785 transcritos preditos que no correspondem a cDNAs
conhecidos.
Aproximadamente 99% de genes do camundongo tm
um homlogo no genoma humano e para 80% destes genes,
a correspondncia no genoma humano encontra-se em um
intervalo conservado de sintenia. Isto indica que os genes
ortlogos provavelmente descendem de um gene ancestral
comum. No existe gene predito ortlogo humano em menos
18
Modelo Animal
de 1% (118 genes) dos genes preditos no camundongo. Alguns
destes genes foram perdidos simplesmente porque foram
deletados em um genoma ou no outro. Tambm possvel que
as evidncias nas quais as predies dos genes foram baseadas
estejam incorretas.
Os genomas dos mamferos tambm codicam muitos
RNAs que no so traduzidos em protenas. Estes incluem
RNAs envolvidos no processamento do mRNA e na traduo
(rRNAs e tRNAs). Recentemente foi descoberto RNAs envolvidos
no regulamento da expresso gnica e em outras funes (tais
como micro RNAs) e muitos novos RNAs cujas identicaes
computacionais so difceis.
Aproximadamente 37% do genoma do camundongo
(comparado a 46% do genoma humano) consiste em repeties
intercalares resultante das inseres de elementos de transposio
(transpsons) e estes talvez sejam a principal causa da diferena
no tamanho dos dois genomas (2,5 Gbp para o camundongo
contra 2,9 Gbp para o homem). Entretanto, o camundongo
tem as mesmas quatro classes de elementos de transposio
que o homem: i) elemento nuclear intercalar longo (LINE); ii)
elemento intercalar nuclear curto (SINE); iii) retrotranspson
viral com repeties terminais longas (LTRs); e iv) transposns
de DNA.
Como na maioria das espcies de mamferos, o genoma
do camundongo tambm possu seqncia de repeties simples
(SSRs), consistindo em curtas repeties em tandem perfeitas ou
quase perfeitas. Estes SSRs tm sido particularmente importantes
na gerao de marcadores genticos utilizados nos estudos de
ligao, pois oferecem um polimorsmo de cumprimento e so
facilmente amplicados pela PCR. Neste sentido, o camundongo
parece representar uma exceo dentre os mamferos, pois
tem 2/3 mais SSRs que o homem. Entre estes SSR, os seis di
-, tri- e tetrmeros (AG, AAG, AGG, AAAG, AAGG, AGGG),
cpias com ao menos 20 bp so dez vezes mais comuns no
camundongo do que no genoma humano. Alm disso, nas
19
Modelo Animal
SSRs que possuem numa ta um intervalo rico em purina e na
outra ta um intervalo rico em pirimidina muito mais comum
e extenso no camundongo do que no homem.
Os polimorsmos de nucleotdeos nicos (SNPs) tambm
so comuns no camundongo ao longo das diferentes linhagens
e estes SNPs so observados tanto nas regies codicadoras
como fora delas. A densidade mdia de SNPs entre a linhagem
C57BL/6 e a linhagem BALB/c ou C3H/He est na escala 1 a
cada 500-700 pares de bases, porm a distribuio de SNPs
no uniforme nas linhagens de laboratrio. Nestas podemos
observar regies ricas em SNPs (40 SNPs para 10 Kb) enquanto
outras extremamente pobres em SNPs (0,5 SNP para 10 KB).
80% de protenas do camundongo parecem ter ortlogos
estritos de 1:1 no genoma humano. O restante pertence s
famlias dos genes que foram submetidos expanso diferencial
em um dos dois genomas. Como exemplo dessa expanso,
podemos citar a famlia dos genes dos receptores de olfato,
onde as diferenas no nmero e na seqncia podem explicar
os diferentes graus de deteco dos odores existentes entre os
camundongos e os seres humanos. Um outro exemplo, a
famlia do gene do citocromo P450, envolvida no metabolismo
de compostos xenobiticos. No geral, as famlias de genes so
signicativamente mais expandidas no camundongo do que no
homem.
As comparaes de 95 regies reguladoras bem
conhecidas no genoma do camundongo permitiu estabelecer
que a distribuio desses elementos era: 10% nos ntrons, 85%
na vizinhana imediata (< 2 kb) dos promotores e 5% mais
distais dos promotores. Aproximadamente 19% sobrepem-se
a uma ilha CpG. A extenso da conservao destas regies
consideravelmente mais baixa do que em regies codicadoras,
mas ainda muito mais alta do que a taxa mdia atravs do genoma.
Nestas regies, o contedo (G+C) tambm substancialmente
mais elevado do que para o genoma como um todo.
20
Modelo Animal
O sequenciamento de outras linhagens de camundongos,
que so comumente utilizadas pelas pesquisadores, tambm
ser realizado em breve, bem como a anotao progressiva
desses genomas. Estas etapas so de extrema importncia e, sem
dvida alguma, nos ajudar na anlise das doenas complexas
ou aqueles determinadas por vrios genes (QTLs).
Para onde vamos agora?
O futuro da genmica e da gentica do camundongo na
era ps sequenciamento pode ser facilmente vislumbrada pelos
cientistas. O acesso livre e irrestrito s seqncias depositadas
nos bancos de dados e a contnua melhora na qualidade dessas
seqncias proporcionam a realizao de comparaes inter-
especcas. Por exemplo, podemos comparar as seqncias
no codicadoras conservadas (SCCs) entre vrias espcies, tais
como, camundongo, rato, chipanz, homem e bovino e cruz-las
com a expresso de genes em diferentes tecidos (transcriptoma).
As informaes que podero surgir dessas comparaes, sero
teis no entendimento da regulao gnica.
Na era ps-sequenciamento, as mutaes sero teis e
podero contribuir de forma eciente na anotao dos genes
pela comparao da alterao no DNA que gerou a mutao e
seu respectivo fentipo. De outra forma, atravs do isolamento
do gene que causou o fentipo alterado estaremos entendendo
a funo deste, ou seja, estaremos estudando e tendo acesso
s funes dos genes que compem o genoma atravs de suas
disfunes.
Existe um abismo entre os mutantes disponveis e a
quantidade total de fentipos essenciais para podermos explorar
totalmente o camundongo como um organismo modelo e, assim,
dissecarmos as funes primrias da totalidade dos genes que
compem nosso genoma (GUNET, 2006). Ao examinarmos
cuidadosamente os camundongos portadores de mutaes
neurolgicas encontramos apenas cinco mutantes [wasted
(wst), progressive motor neuropathy (pmn), neuromuscular
21
Modelo Animal
degeneration (nmd), wobbler (wr) e motor neurone degeneration
2 (mnd2)] que so modelos potenciais de doenas dos
neurnios motores (LUDOLPH, 1996). Esses cinco mutantes
obviamente representam uma pequena frao do nmero de
genes envolvidos nas funes neuronais e motoras. Por outro
lado, nenhum destes mutantes foi identicado como modelo
homlogo de doenas humanas e, as para as duas mutaes no
homem que afetam os nuernios motores, no foi encontrado
modelo murino (BRUNIALTI et al.,1995).
Da mesma forma muitas mutaes dos camundongos
que conduzem surdez vem sendo identicadas no homem,
estas so associadas com o sacudir a cabea e movimento
circular. Com essas mutaes pde-se entender muito sobre
o desenvolvimento do ouvido interno humano, mas nenhuma
mutao em camundongo foi identicada levando perda
progressiva da audio, o que uma caracterstica comum em
certas pessoas idosas (STEEL et al., 1997).
A expanso da coleo de camundongos mutantes se faz
necessria para identicar e descrever de novos genes e para
uma melhor compreenso da ao destes genes no metabolismo
geral, permitindo um maior domnio na compreenso da
funo gnica em mamferos (WELLS & BROWN, 2000).
O domnio de tcnicas moleculares que criam mutaes
(ENU, animais knock-in e knockout e mutantes condicionais),
aliado existncia das mutaes espontneas, acelerou o
andamento de estudos sobre o fentipo, isto , como o impacto
genotpico de diferentes mutaes atua na funo normal de
genes crticos. Mesmo com os inmeros mutantes j isolados e
descritos, o termo gap (buraco) fenotpico bem empregado
para expor um estado de carncia de animais mutantes, o que
leva ao sub-aproveitamento do camundongo como organismo
modelo. Para maximizar as potencialidades do camundongo
como modelo, ainda necessrio isolar mais mutantes para
os loci j conhecidos e tambm gerar mutaes em loci ainda
desconhecidos (BROWN & PETERS, 1996).
22
Modelo Animal
Apostando nesta estratgia, muitos laboratrios se
interessam pela abordagem fenotpica, isolando mutantes
induzidos pela ao alquilante do mutgeno ENU (etil-nitroso-
uria). Este agente mutagnico possui um radical etil transfervel
a oxignios ou nitrognios presentes nas bases nitrogenadas do
DNA (NOVEROSKE et al., 2000). Os stios de alquilao esto
presentes em todas as bases do DNA e foram identicados tanto
in vivo quanto in vitro. Estes stios incluem os resduos N1, N3
e N7 da adenina; O6, N3 e N7 da guanina; O2, O4 e N3 da
timina e O2 e N3 da citosina. A base transformada, ento, passa
a mimetizar uma outra base durante a replicao da dupla-ta
de DNA, fazendo com que a mutao se xe no genoma aps
dois ciclos de replicao celular, j que o mecanismo impede
a ao eciente do sistema de reparo celular. O ENU gera
mutaes de ponto (alm de pequenas delees e inseres)
em todo o genoma. Comparativamente s outras drogas
mutagnicas, como, por exemplo, clorambucil, ENU apresenta
a maior taxa de mutao, da ordem de 1,5-6 x 10
-3
. De todas
as mutaes induzidas por ENU e que foram seqenciadas,
foram detectadas mutaes de sentido trocado (64%), mutaes
sem sentido (10%) e erros de splicing (26%) (JUSTICE et al.,
2000). Os animais tratados com ENU (geralmente machos, pois
toleram bem o tratamento e geram uma grande quantidade de
espermatognias mutantes) so cruzados para observao dos
mutantes na prole, que sero posteriormente caracterizados
fenotpica e geneticamente. Sendo o ENU um alquilante que
age aleatoriamente no genoma, conseqentemente pode induzir
mutaes em qualquer ponto de determinado gene, permitindo
a avaliao de todo um espectro de alteraes na seqncia
(BEIER, 2000).
Muitos projetos buscaram recuperar alelos mutantes
especcos induzidos por ENU no genoma murino. Em um deles,
metade da ninhada obtida dos casais onde o macho foi tratado
com ENU apresentou mutaes recessivas que segregavam
de forma mendeliana (KASARKIS et al., 1998). Em outro, foi
utilizado um sistema de sensibilizao da prole com injees
de fenilalanina para evidenciar mutantes em genes na via
23
Modelo Animal
metablica da fenilalanina (SYMULA et al., 1997). Um terceiro
projeto conseguiu com a administrao de ENU obter uma srie
allica para o locus quaking (qk), essencial na mielinizao
axonal e importante em processos embriognicos iniciais (COX
et al, 1998). Ainda, outro projeto teve como interesse principal
isolar fentipos oculares mutantes e anormalidades na viso
causadas por mutaes induzidas por ENU, sendo que 25
linhagens murinas mutantes puderam ser isoladas (THAUNG
et al., 2002). Dentre estas mutaes, algumas foram mapeadas
em regies do genoma que no possuem genes candidatos,
indicando a presena de novos genes. Projetos em larga escala
tambm foram realizados por vrios laboratrios que tm como
especialidade gerar mutantes. Analisando 26.000 tratados com
ENU, Nolan e colaboradores (NOLAN et al., 2000) puderam
isolar 500 mutaes novas envolvendo problemas nos
membros, malformaes caudais e craniofaciais. Outro grupo
isolou mutaes dominantes e recessivas aps anlise de 14.000
animais da prole de intercruzamentos e retrocruzamentos
envolvendo animais tratados com ENU, o que possibilitou a
identicao de 182 novas mutaes em diversos fentipos (de
ANGELIS et al., 2000).
Apenas cerca de 5% dos estimados 30.000-40.000
genes que compe o genoma murino possuem mutaes
isoladas, a maioria destas sendo mutaes dirigidas por
processo de recombinao homloga em clulas tronco
embrionrias (PERKINS, 2002). A abordagem fenotpica que
utiliza ENU como agente mutagnico aposta no isolamento de
alelos mutantes de interesse e no estabelecimento de linhagens
mutantes modelo para doenas humanas. Hoje, virtualmente
todos os projetos de induo de mutaes com agentes
qumicos utilizam preferencialmente ENU aos outros compostos
(WILLIAMS, 2003). A enorme coleo de mutaes j isoladas,
mapeadas e estudadas, aliada ao potencial j demonstrado do
camundongo como organismo modelo, vem permitindo aos
especialistas vasculhar cada detalhe gentico envolvido nos
processos metablicos de vertebrados. Certamente, este maior
entendimento da funo gnica vem do estudo de mutantes
(Soewarto et al., 2000).
24
A MUTAO PROGRESSIVE MOTOR NEURONOPATHY
(pmn)
Descrio clnica
A mutao progressive motor neuronopathy (pmn) foi
observada pela primeira vez pelo pesquisador Dr. Schmalbruch,
em 1988, no Instituto de Panum, em Copenhagem, numa criao
de camundongos com um background gentico desconhecido
(NMRI) (SCHMALBRUCH; SKOVGAARD JENSEN, 1990). Desde
sua descoberta, essa mutao considerada o modelo animal
de uma amiotroa espinal humana (SCHMALBRUCH et al.,
1991).
Essa patologia transmitida de modo autossmico
recessivo. Os animais homozigotos pmn/pmn so identicados
entre 15 a 18 dias aps o nascimento por meio de uma
locomoo incerta e pelo comeo de uma atroa muscular dos
membros posteriores e da cintura plvica. Quando levantamos
os animais doentes pela cauda, estes no tm o refexo de
esticarem as patas traseiras como o fazem os animais normais
(Figura 6). Aps alguns dias de evoluo da doena, os msculos
das patas anteriores cam igualmente atroados e os animais
morrem entre a 6 e a 7 semana de vida, provavelmente de
uma paralisia respiratria (relacionada ao problema envolvendo
o diafragma descrito logo em seguida) ou, em alguns casos,
por desnutrio, pois so incapazes de se locomoverem at o
local da rao. Quando os sinais clnicos de fraqueza muscular
posterior esto claramente visveis, os animais mutantes tm um
peso inferior a 40% do normal. Entretanto, nunca foi observada
tremedeira ou cimbra durante a evoluo da doena.
Dados anatomopatolgicos
Msculos e nervos perifricos
Os msculos dos membros posteriores dos camundongos
homozigotos (pmn/pmn) com idade de cinco semanas mostram
25
A Mutao Progressive Motor Neuronopathy (pmn)
uma atroa neuronal dos grupos de bras angulares (Figura 7a). A
presena de bra hipertroada rara. Os msculos dos membros
anteriores desses camundongos apresentam pouqussimas
bras atroadas. As junes neuromusculares esto cobertas de
terminaes axonais degeneradas ou por clulas de Schawnn
isoladas (Figura 7b; c). Os axnios terminais esto inchados e
as vesculas das sinapses no esto presentes. O nervo citico
mostra sinais de degenerao axonal (Figura 7d).
Nos animais mutantes com 5 a 6 semanas de idade, o
nmero de axnios mielinizados no nervo bular comum
inferior a 30% com relao aos animais normais.
Algumas anomalias podem ser visualizadas no nervo
frnico desde a quarta semana aps o nascimento dos animais
mutantes. Nesses animais, esse nervo mais no e encontrado
um grande nmero de axnios degenerados (Figura 8a, b).
A perda das bras no nervo frnico sugere que o
diafragma tambm sofra de tal perda desde a quarta semana, o
que causaria a morte dos animais por parada respiratria.
Medula Espinal
Nos animais mutantes, tanto a medula espinal cervical
como a lombar parecem normais. O nmero e a repartio das
clulas na corno ventral tambm so normais. Tambm no
foi observada nenhuma degenerao acompanhada ou no de
uma proliferao de clulas gliais.
Durante a quinta semana de vida, uma pequena
quantidade de axnios degenerados pode ser visualizada na
regio supercial do funculo ventral e, no decorrer da sexta
semana, quando, ento, os animais esto na fase terminal da
doena, observam-se bras degeneradas no fascculo grcil e
no fascculo prprio lateral e fascculo prprio dorsal.
No crebro dos animais mutantes no foi observada
nenhuma anomalia, exceto pelo seu peso, que 30% inferior
ao peso do crebro de um animal normal.
26
Resumidamente, podemos dizer que essa doena,
primeiramente, apresenta uma fraqueza muscular dos membros
posteriores e da cintura plvica; o dcit do nmero de bras no
nervo bular comum chega a 30% na quinta semana. Entretanto,
desde a quarta semana, pode-se notar uma anomalia no nervo
frnico, provavelmente devida a sua desmielinizao (perda
de 69% em mdia de bras). Essa degenerao provavelmente
a causadora da morte dos animais, pois pode levar a uma
insucincia respiratria. No foi observada nenhuma
diminuio no nmero de bras nas razes nervosas ventrais,
nem no nmero de neurnios motores. Nenhuma vacuolizao
do corpo celular dos neurnios motores foi observada.
Em contrapartida, foi observada uma cromatlise das
clulas da corno ventral por microscopia eletrnica. A grande
bra dessa regio da medula espinal tem um tamanho inferior
ao normal, pois est desconectada dos neurnios motores e
seus alvos. A conservao na quantidade de corpos celulares
na crnea anterior sugere que a doena pmn causada por um
processo de morte retrgrada, em que os problemas se iniciam
nas terminaes nervosas e progridem ao longo do axnio em
direo ao corpo celular, sem jamais atingir esse ltimo, pois,
talvez, os animais morram antes.
Essa mutao foi utilizada para testar a ecincia de
algumas tentativas de terapia gnica. A administrao do
CNTF (ciliary neorotrophic factor), sintetizado por broblastos
geneticamente modicados e transplantados no incio da
doena, diminui a velocidade da evoluo da enfermidade,
mas no chega a par-la completamente (SAGOT et al., 1995b;
SENDTNER et al., 1992). A superexpresso do proto-oncgeno
Bcl-2 nos animais doentes no altera a evoluo da doena
nem sua gravidade; ela no impede a degenerao axonal, mas
reduz a perda neuronal no ncleo facial (SAGOT et al., 1995b).
A administrao de um fator neurotrco como o GDNF produz
efeitos similares ao Bcl-2 (SAGOT et al., 1996). Esses resultados
tendem a provar que, nessa mutao, o processo patolgico no
um problema primrio no corpo celular. A mutao levaria a
27
uma neuropatia, e no a uma axonopatia. Alm disso, os estudos
mostram que (1) os mecanismos que levam a uma axonopatia
so independentes daqueles que causam uma neuropatia; (2) os
fatores neurotrcos agem de forma diferente uns dos outros.
28
O PRINCPIO GERAL DA CLONAGEM POSICIONAL
A estratgia da clonagem posicional (COLLINS, 1992),
tambm chamada gentica inversa ou reversa (RUDDLE, 1984;
ORKIN, 1986), consiste em se isolar um gene identicado
unicamente por um fentipo mutante por meio da identicao
do menor fragmento de DNA que o contenha e, em
seguida, identicarem-se, nesse fragmento, suas seqncias
codicadoras. Para essa estratgia, a priori, no se faz necessrio
um conhecimento prvio do produto do gene procurado nem
do tecido em que ele seja expresso. Entretanto, ca claro que,
quanto menos informaes tivermos do gene procurado, mais a
tarefa da clonagem promete ser difcil e longa.
A clonagem posicional foi utilizada pela primeira vez
por Bender e seus colaboradores para isolar o complexo
bithorax de drosla (1983). Em 1995, j possuamos 65 genes
humanos (COLLINS, 1995) e cerca de 30 genes murinos foram
isolados por meio dessa estratgia. Entre os inmeros sucessos
podemos citar, no homem, a clonagem do gene responsvel
pela doena chamada Distroa Muscular de Duchenne,
que codica a protena distrona (MONACO et al., 1986), a
clonagem do gene responsvel pela Coria de Huntington (THE
HUNTINGTONS DISEASE COLLABORATIVE RESEARCH
GROUP, 1994), a clonagem do gene de susceptibilidade ao
cncer de seio (BCRAI, MIKI et al., 1994), a do gene responsvel
pelos trs tipos de amiotroa espinal humana (LEFEBVRE et
al., 1995) e, enm, a clonagem de uma helicase responsvel
pela Sndrome de Werner (YU et al., 1996), para a qual foi
preciso seqenciarem-se mais de 650.000 pares de bases e
testarem-se inmeros genes candidatos para se chegar ao gene
responsvel. Nos camundongos, a clonagem mais sensacional
foi a do gene responsvel pela mutao obese (ob) (Figura 9),
que se tornou um modelo da obesidade humana de carter
autossmico recessivo (ZHANG et al., 1994). Outros sucessos
foram registrados, como o gene shaker-1 (sh1) (GILSON et al.,
1995) e beige (bg) (BARBOSA et al., 1996), o qual se revelou um
modelo da doena de Chediak-Higashi humana.
29
O Princpio Geral da Clonagem Posicional
A clonagem posicional de um gene acontece em trs
etapas.
Em um primeiro momento, efetuamos o mapeamento
gentico da mutao estudada, ou seja, localizamos o
cromossomo que carrega o lcus responsvel pela mutao.
Para tanto, na grande maioria das vezes, precisamos efetuar
cruzamentos especiais para alcanarmos tal objetivo. Esse
cruzamento envolve a linhagem na qual a mutao apareceu e
uma outra, a m de mobilizarmos um alto grau de polimorsmo,
essencial ao trabalho de mapeamento. Nessa fase, tentamos
encontrar os dois marcadores mais prximos do lcus mrbido
e calculamos a distncia gentica (centiMorgan, cM) que os
separa.
Desde que tenhamos conseguido restringir ao mximo o
intervalo gentico que contenha a mutao, comeamos, ento,
o que chamamos marcha sobre o cromossomo. Nessa etapa,
ns iremos construir o mapa fsico da regio cromossmica
estudada. Para tanto, fragmentos de DNA clonados so alinhados
uns aps os outros, formando o que chamamos de um contig
da regio. A caracterizao desse contig dene a construo
do mapa fsico, em que as distncias entre os marcadores sero
medidas em pares de bases de nucleotdeos. As extremidades
do contig correspondem aos dois marcadores que englobam
o lcus da mutao, denido pelo estabelecimento do mapa
gentico concludo na primeira etapa do trabalho de clonagem
posicional.
Enm, passamos fase de recuperao das seqncias
codicadoras contidas no DNA do contig. Essas seqncias so,
em seguida, caracterizadas para que possamos denir o perl
de um gene que ser, ento, nosso gene candidato. Ateno,
aqui estamos isolando a cpia normal do gene responsvel pela
mutao, o que diferente da fase de mapeamento, quando,
ento, localizamos a verso mutante do gene.
As etapas da clonagem posicional esto ilustradas na
Figura 10 e sero detalhadas a seguir.
30
O mapeamento gentico
O objetivo do mapeamento gentico denir a ordem
linear dos genes sobre os cromossomos e denir as distncias
que os separam. O mapa gentico que deve ser estabelecido na
primeira fase da clonagem posicional construdo atravs da
procura de ligao entre o lcus mutante e marcadores genticos
vizinhos previamente localizados sobre os cromossomos. Para
tanto, identicamos primeiramente o cromossomo que porta
a mutao e, em seguida, devemos anar esse mapeamento.
Nessa fase do trabalho, a descoberta de alguma anomalia
citogentica (translocao, deleo) associada doena pode
facilitar, e muito, o desenrolar da clonagem.
O mapeamento da mutao sobre um cromossomo particular
O primeiro passo para o mapeamento da mutao , como
j foi mencionado anteriormente, identicar o cromossomo
que a contenha. Atualmente, os cruzamentos realizados nos
laboratrios so altamente polimrcos e os marcadores
utilizados so, na maior parte das vezes, moleculares. Essa
primeira etapa , ento, confundida com a segunda, a qual
consiste em gerar um mapa gentico de alta resoluo em torno
do lcus mutante localizado. Na poca em que os marcadores
utilizados no mapeamento eram, eles mesmos, mutaes
identicveis unicamente por um fentipo anormal, muitas
vezes inviveis ou infrteis, precisvamos realizar inmeros
cruzamentos e gerar um enorme nmero de animais para
conseguirmos, s vezes, identicar um possvel cromossomo
interessante.
Dois tipos de cruzamento so geralmente realizados
nessa primeira etapa (GREEN, 1995): o retrocruzamento e o
intercruzamento. Os princpios desses dois cruzamentos esto
ilustrados na Figura 11.
Se considerarmos vrios marcadores quaisquer a, b, c,
d, ... , j localizados sobre o mapa gentico dos camundongos,
e m, o alelo mutante a ser localizado, o tipo de cruzamento a ser
31
estabelecido , quase sempre, imposto por razes prticas. Em
geral, cruzamos uma linhagem de camundongo homozigota para
os marcadores polimrcos com a linhagem em que a mutao
m est sendo mantida. Caso a mutao seja compatvel com a
fertilidade, ao menos em um dos dois sexos, ns utilizamos um
animal homozigoto m/m para produzir a gerao F1, depois a
F2, cruzando-se os F1 entre si.
No caso em que os animais homozigotos mutantes forem
incompatveis com a reproduo, o que acontece na maior
parte do tempo, o procedimento um pouco mais complicado:
precisamos cruzar os animais heterozigotos portadores do alelo
mutante +/m com a linhagem de camundongo homozigota
(aquela que porta os marcadores moleculares a, b, c, d, ...,
no estado homozigoto) e, em seguida, recruzar os animais F1
entre si at que o fentipo mutante reaparea na gerao F2
(animais homozigoto m/m). Evidentemente, para esse caso, no
qual no podemos contar com os animais homozigotos, muitos
cruzamentos sero realizados sem interesse cientco, pois
iro associar, aleatoriamente, um parceiro +/m com um outro
+/+ e mesmo dois parceiros +/+. Enm, o DNA dos animais F2
mutantes extrado e tipado para os marcadores moleculares
repartidos sobre todos os cromossomos. Com os mtodos
modernos disponveis para o mapeamento como, por exemplo,
a reao em cadeia da polimerase (PCR), so necessrias apenas
algumas semanas para tipar mais de 50 marcadores moleculares
distribudos de forma homognea por todo o genoma animal.
A descoberta de uma ligao ca evidenciada quando um
ou mais marcadores se encontram constantemente, ou muito
freqentemente, associados mesma fase (em unio ou em
repulsa) do fentipo mutante. Isso quer dizer que o marcador
tipado pela PCR e o alelo mutante m fazem parte do mesmo
hapltipo.
A construo de um mapa gentico de alta densidade e de alta
resoluo ao redor do gene mutado
O objetivo dessa segunda parte do mapeamento gentico
do gene de interesse determinar os dois marcadores mais
32
prximos do lcus da doena e que o enquadrem no menor
intervalo cromossmico possvel para podermos ter a certeza de
que o encurralamos. O tamanho do intervalo a ser determinado
depende da quantidade de marcadores polimrcos disponveis
na regio. A preciso com a qual essa dimenso apreciada
depende do nmero de meioses analisadas. indispensvel a
elaborao, no incio do trabalho, de um cruzamento altamente
polimrco e a anlise de um grande nmero de meioses
(vrias centenas), se quisermos estabelecer o mapeamento com
preciso. A Figura 12 mostra como proceder para identicar
os animais, ditos informativos, no caso de um retrocruzamento,
atravs da genotipagem com dois marcadores que enquadram o
intervalo gentico crtico que contm o lcus mutado.
Desde que nenhum evento de recombinao tenha sido
observado em n meioses analisadas, podemos calcular que o
limite superior do intervalo de conana r da distncia entre
dois marcadores, com o risco de primeira espcie p, dado
pela frmula:
r = 1
n
p
com:
p: rico de primeira espcie
n: nmero de meioses
r: distncia entre os marcadores
Dessa forma, podemos calcular que, para 1.000 meioses
analisadas, o fato de no obtermos recombinantes entre dois
marcadores indica que a distncia gentica que os separa
inferior a 0,3 cM, com um risco de 5%. Esta distncia de 0,3
cM corresponde a, aproximadamente, 600 kb de DNA dos
camundongos
1
.
As linhagens de camundongos utilizadas nos cruzamentos
devem ser escolhidas de forma adequada a m de se obter um
bom compromisso entre o grau de polimorsmo e a taxa de
reproduo. Os cruzamentos intraespeccos, feitos entre as
33
linhagens isognicas tradicionais, as quais foram derivadas de
uma mesma espcie selvagem Mus musculus domesticus, so
fceis de serem realizados; entretanto, o grau de polimorsmo
mobilizado relativamente baixo e, na maior parte das vezes,
no permite o estabelecimento de um mapa gentico denso.
Bonhomme e Gunet (1979 e 1982) (Figura 13) foram os
primeiros que contornaram essa situao ao mostrarem que
poderamos estabelecer cruzamentos entre camundongos de
espcies diferentes como, por exemplo, espcies Mus musculus
domesticus (linhagem de laboratrio) e Mus spretus (linhagem
selvagem). Com esse tipo de cruzamento, muito embora envolva
espcies diferentes, possvel a obteno de hbridos viveis nas
condies de laboratrio. Dada a divergncia evolutiva que as
separa, o grau de polimorsmo mobilizado alto e facilmente
identicvel (GUNET; BONHOMME, 2003)
2
. Entretanto,
os cruzamentos implicando a espcie Mus spretus tm dois
inconvenientes: o primeiro diz respeito ao fato de os animais F1
s poderem ser obtidos atravs do pai selvagem Mus spretus,
pois o cruzamento recproco muito difcil de ser realizado. O
segundo inconveniente refere-se ao fato de os animais machos
F1 serem estreis (efeito Haldane).
1. De acordo com as estimativas mais recentes, o mapa gentico dos camun-
dongos tem 1600 cM e seu genoma contm, como no homem, 3 X 10
9
pares
de bases. Ns consideramos que, em mdia, 1 cM equivale a 1,8 Mb. Essa
extrapolao deve ser vista com muito cuidado, pois, embora o evento de
recombinao seja definido como um fenmeno aleatrio, ele no ocorre de
maneira homognea por todo o genoma. Desde que a recombinao ocorra
com uma alta freqncia numa determinada regio genmica, nessa regio
as distncias genticas so maiores que as distncias fsicas. Essa situao
favorvel na clonagem posicional. No caso contrrio, a situao muito mais
complexa. Devemos notar que o homem recombina duas vezes mais que o
camundongo, e seu mapa gentico tem 2100 cM.
2. Experimentos de seqenciamento mostraram que, em mdia, uma base a
cada 30 eram diferentes entre animais da linhagem C57BL/6, derivada prin-
cipalmente da espcie Mus musculus domesticus, e animais SEG, derivados
da espcie Mus spretus. Tal densidade polimrfica permite, teoricamente,
a realizao de mapas genticos muito densos.
34
As vantagens desses cruzamentos intraespeccos e
interespeccos podem ser acumuladas utilizando-se linhagens
consmicas nas quais um nico cromossomo do tipo Mus
spretus. Nesse caso, podemos obter resultados muito prximos
aos dos cruzamentos interespeccos, eliminando as diculdades
de reproduo e conservando o alto grau de polimorsmo
(FLETCHER et al., 1991).
Quando um cruzamento for estabelecido para o
mapeamento de uma mutao, importante que possamos
identicar, sem nenhuma ambigidade, os animais homozigotos
mutantes na descendncia. Isso, infelizmente, nem sempre
o caso. Freqentemente, uma mutao pode ter efeitos
variveis em gravidade ao passo que os animais de gentipo
mutante podem ter caractersticas de animais de fentipo
normal (penetrncia incompleta) ou nveis variados de
expresso da patologia (expressividade varivel). Nesse caso,
devemos considerar unicamente os animais cujo fentipo tenha
sido estabelecido com segurana para serem utilizados no
mapeamento; entretanto, o clculo da distncia gentica ca
comprometido.
O clculo das distncias genticas, baseado na
identicao de gentipos recombinantes, necessita do
reconhecimento da origem de cada um dos alelos do marcador
testado nos animais N2 (backcross) ou F2 (intercross). Sabemos
tambm que essa identicao s possvel se existir um
polimorsmo entre as duas linhagens utilizadas no cruzamento
inicial.
Os primeiros polimorsmos moleculares identicados
foram os polimorsmos de comprimento de fragmentos de
restrio ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism;
BOSTEIN et al., 1980). Os RFLP so causados pela variao na
seqncia de DNA, de forma que um stio de restrio, talvez
ausente numa linhagem de camundongo, esteja presente numa
outra. Quando da anlise por Southern, uma sonda molecular
do gene analisado revela fragmentos de tamanhos diferentes nas
35
duas linhagens, identicando, assim, a origem de cada um dos
dois alelos (Figura 14).
Os microssatlites ou seqncias simples repetitivas
(LOVE et al., 1990) correspondem a seqncias repetidas (de 10
a 40 vezes) de di, tri ou tetra nucleotdeos, sendo a seqncia
mais freqente a do tipo CA. Existem muitos microssatlites,
relativamente estveis e distribudos aleatoriamente ao longo de
todo o genoma humano e de camundongos (cada um conta com
mais de 100.000 microssatlites), exceo feita ao cromossomo
X, no qual encontramos um nmero pequeno desse tipo de
seqncia (DIETRICH et al., 1994). Os microssatlites so
muito polimrcos entre uma espcie e outra pelo seu motivo
repetido em tandem. A abundncia, a estabilidade e a repartio
desses microssatlites fazem deles uma excelente ferramenta no
mapeamento gentico: as diferenas de comprimento do nmero
de repeties so facilmente evidenciadas pela reao em cadeia
da polimerase (PCR), atravs de iniciadores correspondentes s
seqncias que fanqueiam os microssatlites (Figura 15). O
grupo de Lander (Whitehead/MIT) construiu um mapa gentico
de camundongos unicamente com os microssatlites do tipo
(CA)n repartidos sobre a totalidade de cromossomos murino.
Em junho de 1994, mais de 4.000 microssatlites j
tinham sido mapeados com uma resoluo de um marcador a
cada 0,35 cM (DIETRICH et al., 1992, DIETRICH et al., 1994).
Hoje mais de 13.000 marcadores esto disponveis com uma
resoluo de 0,1 cM, ou seja, um marcador a cada 560 Kb. Mais
de 1.200 RFLP inicialmente mapeados foram integrados a esse
mapa, que pode ser acessado no endereo eletrnico www.
genome.wi.mit.edu/cgi-bin/mouse/index.
Os minissatlites (JEFFREYS et al., 1985) ou VNTR
(nmero varivel de repeties em tandem) so formados a
partir de um grande nmero de repeties de uma seqncia
de aproximadamente 50pb, que so marcadores igualmente
polimrcos e distribudos de forma aleatria por todo o
genoma. Como so muito grandes para serem amplicados pela
PCR, so muito pouco utilizados.
36
Em 1995, McCarthy e seus colaboradores identicaram e
mapearam mais de 450 novos marcadores polimrcos, os quais
foram isolados pela amplicao (PCR) das seqncias nicas
compreendidas entre as seqncias longas repetitivas (LINE) ou
seqncias curtas repetitivas (SINE) do genoma animal. Esses
marcadores so diferentes dos microssatlites e RFLP e, dessa
forma, completaram o mapa gentico estabelecido por Lander.
A tcnica de anlise pela SSCP (polimorsmo de
conformao de DNA de ta simples) (ORITA et al., 1989) permite
a deteco de diferenas acontecendo em uma nica base nas
duas tas de DNA. Essa tcnica detecta 70 a 90% de mutaes
nos fragmentos de DNA de 200pb ou mais. A sensibilidade de
tal mtodo diminui com o aumento do tamanho do produto a
ser analisado. Essa estratgia, ilustrada na Figura 16, muito til
na deteco de polimorsmos ou de mutaes pontuais entre
um DNA mutante e um normal.
Para a gentica de camundongos existem mapas genticos
de referncia, que so regularmente atualizados e publicados
nas revistas cientcas Mammalian Genome e Mouse Genome,
bem como bases de dados acessveis via Internet: MGD (Mouse
Genome Database) www.informatics.jax.org. Todos os genes ou
marcadores localizados no mapa gentico podem ser utilizados
como fonte de marcadores polimrcos.
O estabelecimento de uma ligao gentica para uma
dada mutao permite, muitas vezes, prever sua localizao no
mapa gentico da espcie humana. Para tanto, s precisamos
consultar os mapas de homologia de sintenia j estabelecidos e
publicados (PETERS and SEARLE, 1996). Falamos de conservao
ou de homologia de sintenia quando dois (ou mais) pares de
marcadores homlogos esto presentes num mesmo segmento
cromossmico em duas (ou mais) espcies diferentes. Por
exemplo, a comparao dos mapas genticos humano e murino
indica que vrios genes localizados sobre o cromossomo 13
de camundongos se encontram nos cromossomos 1, 3, 5, 6, 7,
9, ou 10 humanos. Caso a ordem de posio dos marcadores
37
tambm seja conservada, haver, ento, conservao de
sintenia (Figura 17).
Quando uma ligao for estabelecida numa regio
pobre em marcadores podemos obter outros marcadores por
meio da tcnica de microdisseco do DNA da regio localizada,
amplic-la pela PCR com a ajuda de oligonucleotdeos
degenerados e, em seguida, clonar os produtos amplicados
(SCALENGHE et al., 1981, LUDECKE et al., 1990, TELENIUS et
al., 1992). A microdisseco foi utilizada para os camundongos,
na produo de novas sondas da regio do complexo T/t do
cromossomo 17 (ROHME et al., 1984).
Antes de concluirmos a seo que concerne ao
estabelecimento de um mapa gentico de alta densidade na
vizinhana do gene que desejamos clonar, temos de falar de
um ponto importante relativo ao princpio do estabelecimento
dos mapas genticos, os quais so graduados em unidade
de recombinao, ou seja, em centiMorgan (cM). Sabemos,
entretanto, que no existe nenhuma relao linear entre a
freqncia de recombinao, que nos indica a distncia
gentica, e a distncia fsica real entre os marcadores, a qual
estabelecida em pares de base. Em alguns casos, a freqncia
de recombinao alta e a distncia gentica equivale a uma
distncia fsica pequena. Em outros casos, a recombinao
rara e a distncia gentica corresponde a uma grande distncia
fsica. Geralmente, a freqncia de recombinao depende do
sexo no qual a meiose ocorreu (no caso dos camundongos, na
maior parte das vezes, estamos analisando a meiose do sexo
masculino) e, de qualquer maneira, ela no a mesma de um
segmento cromossmico a outro. Temos que saber igualmente
que rearranjos estruturais dos cromossomos (delees,
translocaes, inverses, etc) modicam consideravelmente
a freqncia de recombinao (HERMANN et al., 1987). Um
mapa gentico de alta densidade estabelecido numa regio de
alta freqncia de recombinao simplicar muito a tarefa
da clonagem posicional. De forma inversa, a co-segregao
de um marcador com o lcus do gene a ser clonado no
38
necessariamente um sinal de que haja uma grande proximidade
fsica.
Microssatlites X SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
A introduo dos marcadores microssatlites no incio
dos anos 90 possibilitou aumentar dramaticamente a ecincia
dos estudos genticos. O mapeamento alta resoluo passou
a ser uma realidade. O mapeamento gentico de microssatlites,
baseado na diferena (polimorsmo) do nmero de unidades
de repetio encontrada nas linhagens de camundongos,
facilmente realizado atravs da tcnica da reao em cadeia da
polimerase (PCR). Mais de 6000 microssatlites so comumente
usados no mapeamento gentico em camundongos. Estima-se
que os tamanhos gentico e fsico do genoma dos camundongos
sejam, respectivamente, 1500 cM e 3000 Mb (3X10
9
pb). Assim,
o espao mdio entre os microssatlites pode ser availado em
0,25 cM ou 500 Kb. Isto um clculo aproximado, visto que, as
distncias genticas nem sempre refetem as distncias fsicas,
pois sabemos que determinadas regies do genoma sofrem
um maior nmero de eventos de recombinao que outras.
De qualquer forma, o mapeamento atravs dos microssatlites
pode oferecer uma considervel resoluo, porm no
necessariamente a exigida para a clonagem posicional. Deve
se lembrado que, embora tenhamos 6000 microssatlites
disponveis, nem todos so polimrcos entre todas as linhagens
de camundongo. Assim, existe a necessiadade de outros tipos de
marcadores polimrcos que possam auxiliar no mapeamento
alta resoluo.
Com o sequenciamento de vrios genomas, um novo
tipo de marcador molecular fez sua apario, os SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms, para polimorsmo de nucleotdeo
nico. Como o nome indica, um SNP envolve a mudana em um
nico nucleotdeo. Geralmente uma substituio, mas tambm
pode ser uma deleo ou insero. J foram identicados mais de
4 milhes de SNPs no genoma humano e eles esto distribudos
pelo genoma, fornecendo marcadores extremamente teis para
o mapeamento alta resoluo e tambm para os estudos de
39
associao procura de loci que conferem susceptibilidade a
doenas comuns.
Para o genoma murino o nmero de SNPs disponveis
ainda bem modesto, um pouco mais de 3000 no banco de
dados do MIT, porm o potencial da existncia de SNPs entre
as linhagens isognicas enorme. Como o sequenciamento de
diversas linhagens de camundongo est sendo realizado, hoje
j temos os dados de 15 delas, podemos armar que a situao
desses marcadores vai melhorar e muito. A previso para breve
da disponibilidade de 1 milho de SNPs distribudos ao longo
de todo o genoma murino, o que signica uma densidade de
1 SNP a cada 3 Kb. Podemos, desta forma, prever que esses
marcadores iro substituir os microssatlites num futuro bem
prximo.
O mapeamento fsico
Quando dois marcadores genticos muito prximos do
gene de interesse foram isolados, o segmento de DNA situado
entre esses dois marcadores, no qual o gene em questo dever
estar contido, dever, ento, ser isolado sicamente. Para tanto,
as tcnicas de clonagem clssicas que se servem de plasmdios,
fagos lambda ou cosmdios no so adequadas. Na realidade, tais
tcnicas s permitem a manipulao de pequenos fragmentos
de DNA, algumas dezenas de Kb no mximo. Se considerarmos
que o intervalo gentico denido na etapa anterior da ordem
de 1cM, ou seja, por volta de 1.700pb nos camundongos, no
podemos ter a certeza, a priori, de que os stios de clonagem
esto repartidos de tal maneira que faam com que todo DNA
contido no segmento possa ser clonado.
O que vimos que a clonagem posicional s pde
progredir denitivamente aps a construo de ferramentas
adequadas e que, sem a eletroforese em campo pulsado, sem
o desenvolvimento dos cromossomos articiais de levedura
(YAC) e sem a descoberta dos marcadores microssatlites, essa
estratgia de clonagem no teria conhecido o sucesso de que
desfruta hoje em dia.
40
A eletroforese em campo pulsado
A eletroforese em agarose ou em poliacrilamida clssica
permite a separao de fragmentos de DNA graas ao papel
das malhas que formam o gel. Sob a ao do campo eltrico,
algumas molculas de DNA migram entre todos os poros,
enquanto que outras molculas maiores no podem migrar entre
alguns dos poros e vo levar um tempo maior para percorrer o
mesmo percurso.
As grandes molculas de DNA (de mais de 20Kb) so
maiores que todos os poros de resoluo do gel. Sob a ao
do campo eltrico, essas molculas sofrem uma modicao
estrutural de maneira a migrar em bloco nos interstcios
maiores. Esses fragmentos migram todos na mesma velocidade,
independentemente do tamanho, e no existe mais separao
alguma. A eletroforese em campo pulsado resolveu esse
problema por meio da modicao peridica da orientao do
campo eltrico. A molcula deve mudar sua conformao e se
reorientar paralelamente ao campo. Para esquematizar, podemos
dizer que uma molcula de DNA muito longa (1.000Kb) precisa
de muito tempo para se reorientar e ela tem pouco tempo para
migrar, enquanto que uma molcula menor (100Kb) necessita
de pouco tempo para se reorientar e consagra a maior parte do
seu tempo a migrar. Trs sistemas so utilizados:
OFAGE (Orthogonal-Field Alternating Gel
Eletrophoresis) (SCHUWARTZ; CANTOR, 1984): nesse caso os
eletrodos esto orientados a 90 e geram dois campos eltricos
alternados e no homogneos;
CHEF (Contour Clamped Homogenous Field) (CHU
et al., 1986): o sistema mais utilizado. Nele, os eletrodos esto
arrumados regularmente ao longo de um circuito em forma de
um hexgono. O campo eltrico uniforme para todo o gel,
mas a orientao periodicamente modicada de 120. Esse
sistema foi utilizado neste trabalho;
FIGE (Field Inversion Gel Eletrophoresis) (CARLE et
al., 1986): neste caso, o campo eltrico uniforme e invertido
de 180.
41
Uma descrio mais detalhada da eletroforese em
campo pulsado pode ser obtida no artigo Towards a molecular
description of pulse-eld gel electrophoresis, de Bustamante e
outros, publicado em 1993.
Os PAC, YAC e BAC
Os cosmdios permitem a clonagem de segmentos de
DNA de at 40Kb. O bacterifago P1, aliado ecincia de
infeco dos bacterifagos e simplicidade de manipulao dos
plasmdios, pode conter inseres de at 100Kb (STERNBERG,
1990).
Um enorme avano para o mapeamento fsico foi a
descoberta de que grandes fragmentos de DNA de at 2.000Kb
poderiam ser propagados sob a forma de cromossomos articiais
de levedura ou YAC (BURKE et al., 1987). O princpio da
clonagem est ilustrado na Figura 18. Os YAC permitem, alm
da clonagem de grandes fragmentos de DNA, a de fragmentos
de DNA os quais no tinha sido possvel isolar de E. coli. Por
exemplo, as regies de DNA do cromossomo 7 humano que no
puderam ser clonadas em E. coli (ROMMENS et al., 1989) foram
facilmente clonadas sob a forma de cromossomo articial de
levedura em Saccharomyces cerevisiae (GREEN; OLSON, 1990).
Infelizmente, os YAC apresentam um alto grau de quimerismo
(de at 60% em alguns casos), resultante da maneira como
so realizadas as clonagens. Eles so igualmente instveis e de
manipulao relativamente difcil.
O quimerismo caracterizado pela presena, num
mesmo YAC, de segmentos de DNA provenientes de
cromossomos diferentes, resultado de uma co-ligao no
momento da construo da biblioteca ou da recombinao
dos clones nas etapas posteriores (GREEN et al., 1990). Alguns
YAC so instveis e tambm podem deletar fragmentos de seus
insertos, mas essa instabilidade pode ser reduzida no momento
da construo da biblioteca pela escolha de uma linhagem de
levedura deciente em gene de recombinao (CHARTIER et
al., 1992). A manipulao dos YAC sempre necessita do recurso
42
da eletroforese em campo pulsado e difcil consegui-lo na sua
forma pura, desprovida do DNA de levedura.
Os BAC (Bacterial Articial Chromosomes; SHIZUYA et
al., 1992) (Figura 19) permitem a clonagem de fragmentos que
podem chegar at 350kb. Os fragmentos so propagados na
bactria E. coli, dentro de um vetor de clonagem derivado do
fator F. O vetor est presente em pequeno nmero de cpias
nas clulas hospedeiras, o que de certa forma confere uma
relativa estabilidade aos insertos. Na realidade, a porcentagem
de clones quimricos no ultrapassa 5%. Podemos armar que
esse sistema uma alternativa interessante ao do YAC, para
aplicaes que requerem a clonagem de grandes fragmentos
de DNA.
Vrias bibliotecas de PAC, YAC e BAC humanas e dos
camundongos esto atualmente disponveis comercialmente. Os
clones de interesse podem ser isolados dessas bibliotecas por
meio da PCR e hibridizao atravs dos marcadores moleculares
utilizados no mapeamento gentico.
Salto e caminhada sobre o cromossomo: chromosome jumping
e chromosome walking
O jumping, ou salto sobre o cromossomo (COLLINS;
WEISSMAN, 1984, POUTSKA; LEHRACH, 1986), consiste na
obteno da justaposio, dentro de um mesmo clone, de
duas seqncias de DNA situadas nas extremidades de um
grande fragmento de restrio. O princpio dessa tcnica est
apresentado na Figura 20. Essa tcnica, que pouco utilizada
depois do desenvolvimento dos cromossomos articiais de
levedura, permite efetuar vrias centenas de Kb.
O walking, ou a marcha sobre o cromossomo, consiste
em construir um conjunto de clones contnuos, ou contig. As
extremidades do primeiro clone so utilizadas para isolar o
clone seguinte, e assim por diante (Figura 21). A marcha sobre
o cromossomo foi aplicada pela primeira vez por Steinmetz
(STEINMETZ et al., 1982), que clonou um grande fragmento de
43
DNA na regio do complexo major de histocompatibilidade
na forma de cosmdios superpostos. Quando no temos
informaes sucientes, preciso, ento, marchar nas duas
direes, a partir do primeiro clone isolado, at encontrarmos
uma informao (recombinao ou rearranjo cromossmico),
permitindo, assim, saber se o gene de interesse foi alcanado
ou no. O desenvolvimento do YAC permite a construo de
contigs que se estendem por grandes regies. Por exemplo: um
contig de 8Mb foi reunido na regio Xq24-q28 do cromossomo
X humano (LiITTLE et al., 1992). Um outro foi construdo e cobre
a totalidade da regio 21q humana (CHUMAKOV et al., 1992).
Em 1995, Lander e sua equipe no MIT comearam a construo
de contigs de YAC que cobririam integralmente o genoma de
camundongos (DIETRICH et al., 1995). Esse mapa fsico, bem
como o realizado com o BAC, est disponvel no endereo
eletrnico www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/mouse/index.
Quando o mapa gentico sucientemente denso, ns
podemos, ao menos em teoria, utilizar os marcadores que
fanqueiam o gene que desejamos clonar para isolar os clones
de YAC e tentar organizar um contig da regio. Fica claro que,
nessa etapa do trabalho, temos todo interesse em isolar o maior
nmero possvel de YAC e, se possvel, a partir de bibliotecas
diferentes, garantir uma melhor cobertura da regio.
Isolamento das seqncias codifcadoras
A identicao das seqncias codicadoras contidas
no DNA do contig constitui uma das principais diculdades da
clonagem posicional. As seqncias codicadoras representam
apenas uma pequena frao da totalidade do genoma: 5 a
10%. Alm disso, as seqncias codicadoras esto dispersas
e separadas por ntrons de tamanhos variveis. Um exemplo
extremo disso , sem dvida, o da distrona que se estende
sobre 2,3Mb com um RNA mensageiro de 14Kb compreendido
dentro de 79 xons (ROBERTS et al., 1992). Vrios mtodos
foram desenvolvidos todos possuem vantagens e desvantagens,
nenhum totalmente ecaz e, na prtica, convm realizar uma
44
combinao de alguns deles para se obter o gene procurado
(BRENNAN; HOCHGESCHWENDER, 1995).
Conservao ao longo da evoluo: Zooblots
A tcnica do zooblot (MONACO et al., 1986) consiste
em hibridizar um fragmento do DNA candidato ao DNA de
diferentes espcies por meio da tcnica de Southern blot.
Se no DNA candidato existem seqncias codicadoras,
podemos observar, quase sempre, uma reao cruzada entre
as diferentes espcies representadas no zooblot. Tal fato pode
ser explicado, pois a seqncia dos xons diverge muito
menos que as seqncias dos ntrons ao longo da evoluo.
Essa tcnica no permite isolar seqncias codicadoras, mas
pode ser usada para se saber se o DNA que estamos analisando
possui ou no tais seqncias. Esse DNA pode ser utilizado,
em seguida, no isolamento de mais seqncias a partir de
uma biblioteca de cDNA ou mesmo servir de ingrediente para
outras tcnicas. A anlise em zooblot de cosmdios inteiros teve
um papel importantssimo no gene que causa a brose cstica
humana (ROMMENS et al., 1989) e no gene da obesidade nos
camundongos (ZHANG et al., 1994).
A anlise de Northern blot
A hibridizao das seqncias candidatas com os RNA
mensageiros sobre um ltro permite determinar o tamanho do
mensageiro procurado. As sondas moleculares utilizadas na
hibridizao podem ser cDNA, xons, mas tambm os cosmdios
(ZHANG et al., 1992) ou mesmo os YAC inteiros (MARSHALL
et al., 1993). Nesse ltimo caso, podemos determinar o nmero
de mensageiros presentes na regio cromossmica estudada
e o tamanho deles. Tais mensageiros podem ser provenientes
de vrios genes diferentes ou corresponderem a um nico. A
deteco de vrios mensageiros codicados por um mesmo gene
pode ter-se originado do fenmeno chamado recomposio
alternativa (splicing alternativo), dos stios de poliadenilao
diferentes ou mesmo da utilizao de diferentes promotores. A
tcnica apresenta baixa sensibilidade, pois muito dependente
45
do grau de expresso gnica. Entretanto, a utilizao de RNA
poliadenilado, enriquecido em RNA mensageiros, permite o
aumento da sensibilidade.
A amplifcao de xons ou Exon trapping
A tcnica de amplicao de xons foi proposta por Duyk
em 1990 e Buckler em 1991. Ela foi aplicada com sucesso em
vrios casos, por exemplo, no isolamento dos genes shaker-1
(GIBSON et al., 1995) e Bcg (VIDAL et al., 1993) nos camundongos
e do gene responsvel pela Coria de Huntington humana (The
Huntingtons Disease Collaborative Research Group, 1994). Essa
tcnica permite isolar xons presentes nos fragmentos de DNA
genmico clonados (cosmdio, YAC, BAC) graas presena do
stio doador e aceptor de splicing funcionais. O princpio do
exon trapping est ilustrado na Figura 22.
A amplicao dos xons independente do nvel de
expresso dos genes procurados ou do tecido no qual eles so
expressos, uma vez que trabalhamos unicamente com material
genmico. A tcnica relativamente eciente se no contarmos
com o problema do splicing crptico (splicing de seqncias
reconhecidas como xons, mas que, na realidade, no o so).
Os genes que no possuem xons, raros nos eucariotos, no
podero ser isolados via tal mtodo. Podemos citar o exemplo
do gene SRY, que possui um nico xon (GOODFELLOW;
LOVELL-BADGE, 1993).
Caso as seqncias isoladas no dem resultados quando
da hibridizao em Northern blot, uma RT-PCR baseada
na reao de transcrio inversa do RNA, seguida de uma
amplicao com oligonucleotdeos especcos para cada uma
das seqncias estudadas, permite vericar se estas so ou no
verdadeiros xons (KAWASAKI, 1990).
A captura do DNA por afnidade ou DNA affnity capture ou
DNA selection
Tcnica desenvolvida por Lovett e Parimoo em 1991
e, em seguida, adaptada por em Tagle 1993, permite isolar
46
os cDNA codicados por grandes fragmentos de DNA tais
como os YAC, cosmdios, BAC ou fagos. O mtodo consiste na
hibridizao do DNA genmico biotinilado (YAC, etc) com os
cDNA em soluo. Em seguida, capturam-se os complexos DNA
genmico-cDNA com a ajuda de bilhas magnticas cobertas de
estreptovidina (Figura 23). Construmos, assim, uma biblioteca
de cDNA enriquecida de seqncias codicadoras provenientes
do YAC ou cosmdio utilizado no incio. O enriquecimento
pode ser aumentado em at 100.000 vezes, efetuando-se vrias
rodadas sucessivas de seleo.
O sucesso dessa estratgia depende da relativa
abundncia de cDNA na biblioteca utilizada para a seleo. A
tcnica pode tambm conduzir ao isolamento de cDNA vindo
de outras regies do genoma, caso exista um pseudogene no
fragmento de DNA genmico analisado. Outros problemas
podem ser encontrados e dizem respeito ao vis criado pela
PCR, que prefere a amplicao de fragmentos de pequenos
tamanhos (ou cDNA pequenos) e a diculdade de eliminar
completamente as seqncias repetitivas do DNA genmico
inicial. Essas seqncias podem ser eliminadas pela desnaturao
e re-hibridizao do DNA genmico inicial na presena de DNA
enriquecido em seqncias repetitivas. A diculdade reside na
escolha do tempo ideal de incubao que permita a renaturao
unicamente das seqncias repetitivas, e no das seqncias
nicas. Se, aps a incubao, ainda existir seqncia repetitiva
no DNA genmico, possvel que um cDNA contendo tais
seqncias seja isolado, pois esses elementos repetitivos
constituem uma certa proporo de cDNA (at 10%). Embora
apresente todas essas diculdades, a tcnica de captura de
cDNA contribuiu para a construo de mapas transcricionais de
vrias regies cromossmicas (KORN et al., 1992).
A sondagem de biblioteca de cDNA
A utilizao de YAC inteiro para sondar bibliotecas de
cDNA foi descrita pela primeira vez por Wallace, em 1990,
47
quando da identicao do gene causador da neurobromatose
do tipo I. Em 1993, Geragthy e seus colaboradores, utilizando
essa mesma estratgia, isolaram seqncias de cDNA do
cromossomo X humano a partir de YAC de 480kb. Essa tcnica,
mesmo permitindo isolar diretamente cDNA (em comparao
com aquela de captura e amplicao dos exons), apresenta
inmeros inconvenientes: devido complexidade da sonda,
as hibridizaes inespeccas so comuns, o que diculta o
reconhecimento dos sinais positivos; tambm muito difcil
marcar um YAC inteiro com uma atividade especca durante um
tempo sucientemente longo que permita sua recuperao aps
hibridizao. A taxa de falsos positivos , portanto, muito alta
e est estimada em 40%. As seqncias repetitivas so difceis
de ser eliminadas completamente da sonda e podem conduzir
ao isolamento de seqncias repetitivas transcritas(GERAGTHY
et al., 1993). Podemos concluir, ento, que falta sensibilidade a
essa tcnica.
A sondagem de bibliotecas de cDNA atravs dos cosmdios
inteiros oferece menos problemas, pois a sonda utilizada j no
to complexa (ZHANG et al., 1992). Enm, qualquer que
seja a sonda utilizada, a ecincia da sondagem depende da
representao dos genes procurados e, conseqentemente, do
grau de expresso destes.
Os mtodos baseados na anlise das ilhas CpG
As ilhas CpG (ou HTF para HpaII Tiny Fragments) so
denidas como segmentos de DNA de 500pb a 2Kb que tm
uma porcentagem de guanina + citosina (G+C) superior a 50% e
uma grande quantidade de duplos CpG no metilados, enquanto
que o restante do genoma caracterizado por uma porcentagem
G+C menor (mdia de 40%) e pela metilao da citosina em 5
da maior parte dos duplos CpG (LINDSAY e BIRD, 1987). Um
estudo publicado por Larsen em 1992 (LARSEN et al., 1992a)
mostrou que, entre 375 genes repertoriados no GenBank, todos
os genes com expresso constitutiva (housekeeping function)
e em mdia 40% dos genes com expresso tissular especca
contm uma ilha CpG. Essa ilhas, geralmente, cobrem a regio do
48
promotor do gene e de 1 a 3 xons. Raramente esto localizadas
na poro 3 ou no interior mesmo das seqncias transcritas.
Num estudo similar, Antequera e Bird (1993) estimaram que dos
22.000 genes constitutivos, 55,9% dos genes humanos e 46,9%
dos genes de camundongos esto associados a essas ilhas
CpG e que mais de 40% dos 60.000 genes tecidos especcos
estariam no mesmo caso. Craig e Bickmore (1994) mostraram
que tais ilhas no estariam repartidas de maneira homognea ao
longo do genoma, mas que estariam concentradas em domnios
cromossmicos particulares, no nvel das bandas R, onde se
encontram os genes que so expressos.
Todos esses dados reunidos indicam que as ilhas CpG
so bons marcadores para se identicarem genes. Visto
que essas ilhas so formadas por uma alta densidade de
dinucleotdios CpG no metilados, elas podem ser detectadas
por enzimas de restrio sensveis metilao e que contenham
o dinucleotdio CpG nos seus stios de reconhecimento. Na
Tabela 4 so mostradas as enzimas de restrio mais utilizadas
na deteco das ilhas CpG (de acordo com Bickmore e Bird,
1992). O grupamento de vrios stios reconhecidos por essas
enzimas numa curta regio de DNA (alguns Kb) um indicativo
da presena de uma ilha, que, na prtica, identicada pela
construo de um mapa de restrio da regio estudada e
analisada pela eletroforese em campo pulsado. A presena de
uma ilha CpG prxima da sonda molecular detectada pelo fato
de essa sonda reconhecer fragmentos de mesmo tamanho aps
digesto do DNA genmico por diferentes enzimas de restrio,
em particular as citadas na Tabela 4. Duplas digestes utilizando
uma combinao dessas enzimas permitem conrmar se tais
stios esto agrupados no genoma (o tamanho dos fragmentos
detectados deve ser o mesmo para as digestes simples ou
duplas). A localizao das ilhas CpG foi til na clonagem do
gene brachyury (T) (HERRMANN et al., 1990) e na do gene da
brose cstica (CFTR) (ROMMENS et al., 1989). Essas ilhas podem
facilmente ser clonadas a partir de um YAC ou cosmdio (ELVIN
et al., 1992; VALDES et al., 1994) e utilizadas, em seguida, para
sondar bibliotecas de cDNA.
49
O sequenciamento genmico
Ao longo dos ltimos anos, as tcnicas de sequenciamento
foram consideravelmente melhoradas e, sobretudo,
automatizadas, graas ao desenvolvimento de seqenciadores
automticos (SMITH et al., 1986). Paralelamente a esse progresso,
os programas de comparao de seqncias e os que permitem
identicar seqncias codicadoras num segmento de DNA
annimo tambm foram aperfeioados. Uberbacher e Mural
(1991) desenvolveram o programa GRAIL, que possibilita a
identicao de xons a partir de uma seqncia de DNA com
uma delidade de 80% e com baixa taxa de falsos positivos.
O programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1990) permite comparar
rapidamente uma seqncia s bases de dados clssicas como,
por exemplo, GenBank, EMBL, etc. Os dados contidos em tais
bancos so cada vez mais numerosos, graas, principalmente,
ao Projeto Genoma Humano, que busca o sequenciamento da
totalidade do genoma, e tambm ao sequenciamento em larga
escala de cDNA (VENTER et al., 2001; LANDER et al., 2001).
Uma boa introduo a esses programas pode ser encontrada no
Guide to Human Genome Computing (1994). Uma ilustrao
da utilizao dessas tcnicas apresentada por Seto (1994) no
estudo dos receptores de linfcitos T humanos.
As outras tcnicas
Citaremos a tcnica desenvolvida por Lui e seus
colaboradores (1989) a qual permite isolar os genes humanos
transcritos numa linhagem celular hbrida hmster-homem
(contendo um nico cromossomo humano) e as tcnicas
baseadas na recombinao homloga entre o DNA analisado
e uma biblioteca de cDNA (KURNIT; SEED, 1990). Entretanto,
essas tcnicas, relativamente fastidiosas, no obtiveram sucessos
em vrios projetos de clonagem posicional.
O que nos aparece, em denitivo, que a procura de xons
e o sequenciamento direto so as duas tcnicas mais utilizadas
na clonagem posicional de um gene; porm, logo que levamos
em conta as dimenses considerveis do genoma humano ou
50
do camundongo, tais tcnicas se tornam extremamente pesadas,
fastidiosas e, sobretudo longas. O ideal seria podermos dispor
de uma espcie relativamente prxima dos mamferos, mas
que possusse um genoma compacto, sem (ou com poucos e
pequenos) ntrons. A levedura (14Mb), a bactria Escherichia
coli (4.7Mb) ou a drosla (165Mb) so espcies muito distantes
do ponto de vista logentico para serem utilizadas, mesmo se
vrias seqncias forem conservadas em todos esses genomas.
Entretanto, um genoma desse tipo existe no peixe tetrodontide
Fugu rubripes (BRENNER et al., 1993). O sequenciamento
sistemtico dos 400Mb do genoma deste peixe mostrou que
90% deste correspondem a seqncias nicas e que seu
repertrio em genes muito anlogo ao humano. Trower e seus
colaboradores, em 1996, encontraram uma conservao de
sintenia entre o genoma do Fugu e uma regio do cromossomo
14 humano (14q24.3) que est associada Doena de Alzheimer
(lcus AD3). O estudo do genoma do Fugu pode, ento, ajudar
na clonagem posicional dos genes de mamferos. A partir do
momento em que conhecemos um ntron procedente de um
grande genoma, poderemos utiliz-lo como sonda para a
clonagem das suas regies vizinhas no Fugu e retornar, em
seguida, ao genoma estudado.
A identifcao direta do cDNA candidato
Nestes ltimos anos assistimos a uma revoluo no
que diz respeito gentica humana: um consrcio de cinco
laboratrios ingleses, americanos e franceses (Gnethon) que
interpuseram o mapeamento de dezenas de milhares de cDNA,
identicadas por sua etiquetas, s chamadas EST (Expressed
Sequence Tag). A primeira verso do Gene Map do genoma
humano que foi estabelecido pelo consrcio internacional das
EST apareceu em 1996 (SCHULER et al., 1996), incluindo mais
de 16.000 genes mapeados com relao a 1.000 marcadores
genticos polimrcos (Todos esses dados podem ser acessados
no endereo www.ncbi.nlm.nih.gov/SCIENCE96/).
O mapeamento dessas milhares de seqncias no
homem pode, evidentemente, servir clonagem de mutaes
51
nos camundongos, pois sabido que 80% dos cromossomos
humanos tm uma homologia conhecida, com um segmento
cromossmico murino. O mapeamento preciso das EST no
homem oferece, levando-se em conta o jogo das homologias, um
grande nmero de candidaturas para os genes a serem clonados
no camundongo. bem provvel que essa estratgia seja muito
explorada para a clonagem das mutaes dos camundongos
que tenham sido localizadas com preciso.
Isolamento de um mensageiro completo
A maior parte das tcnicas descritas at agora no permite
isolar um mensageiro completo, e a soluo mais evidente para
solucionar esse problema busc-lo em bibliotecas de cDNA.
Vrias bibliotecas desse tipo esto disponveis comercialmente
e, em geral, so de boa qualidade. Entretanto, o trabalho de
procura de uma seqncia completa de cDNA muito cansativo
e necessita da presena de sondas de alta qualidade. A utilizao
de sondas obtidas atravs da amplicao de xons delicada,
pois essas sondas so, geralmente, pequenas podendo gerar
muitos falsos positivos. A sondagem dessas bibliotecas pela
tcnica de PCR (ALFANDARI; DARRIBRE, 1994; AMARACADI;
KING, 1994) uma alternativa sondagem por hibridizao.
O isolamento da extremidade 5 dos mensageiros pela
sondagem de bibliotecas de cDNA sempre causa problemas. Tais
clones so, na realidade, muito pouco representados por causa
da diculdade encontrada pela transcriptase reversa de copiar
na ntegra o mensageiro at 5. Uma estratgia complementar
sondagem de bibliotecas de cDNA a tcnica chamada RACE
(Rapid Amplication of cDNA Ends, FROHMAN et al., 1988),
que amplica uma seqncia de RNA compreendida entre uma
pequena seqncia j conhecida (por exemplo, um xon) e a
extremidade, seja 5 ou 3, do RNA correspondente. O princpio
da tcnica de RACE est ilustrado na Figura 24. O RACE
normalmente mais rpido que a sondagem de bibliotecas de
cDNA que podem necessitar de meses de trabalho antes que se
consiga isolar um mensageiro completo. Entretanto, a tcnica do
52
RACE pouco eciente para se isolar a poro 5 dos grandes
mensageiros.
A conexo entre xons pela RT-PCR permite igualmente
isolar fragmentos de mensageiros sem ser preciso passar pela
sondagem de cDNA. Aps a retro-transcrio do mRNA, o
cDNA amplicado pelos oligonucleotdeos especcos dos
dois xons conhecidos. Se eles pertencem ao mesmo transcrito
e se os oligonucleotdeos foram denidos na boa orientao,
todos os xons localizados entre esses dois sero amplicados.
A identifcao do bom candidato
Uma primeira seleo pode ser feita considerando-se
que o gene candidato deve apresentar um perl de expresso
compatvel com o fentipo. Ns podemos efetivamente
pensar que um gene no qual o efeito esteja se manifestando
essencialmente no sistema nervoso central deva, a priori,
corresponder a um mensageiro transcrito principalmente no
crebro. Entretanto, preciso que seja identicada uma mutao
associada ao fentipo na seqncia candidata. Uma deleo na
seqncia transcrita descoberta no animal mutante e ausente
no controle permite validar facilmente o gene em questo como
um bom candidato. Foi o que ocorreu com a clonagem do
gene Brachyury (HERRMANN et al., 1990) e com a do gene da
distrona (MONACO et al., 1986). Infelizmente, as mutaes
so, na maior parte das vezes, mais discretas e, portanto, mais
difceis de ser detectadas. Pode agir-se, por exemplo, a partir
de mutaes que afetem a recomposio dos xons (detectvel
pelo Northern blot), como para a -talassemia (VIDAUD et
al., 1989), de mutaes pontuais que levem mudana de um
aminocido por outro (mutao de sentido trocado), como,
por exemplo, no caso do gene Bcg (VIDAL et al., 1993), ou
ainda, como no caso da mutao spastic (spa), pode ocorrer
a intercalao de uma seqncia do tipo LINE dentro de um
ntron que altera o stio de recomposio ou que crie outros
alternativos (KINGSMORE et al., 1994). Vrias so as mutaes
que s foram descobertas pelo seqenciamento completo
53
do gene, caso em que a mutao se traduz pela substituio
de um aminocido por outro. Aqui a questo saber se essa
substituio realmente responsvel pelo fentipo ou se no se
trata de apenas um polimorsmo associado. As presunes so
um pouco reforadas quando a verso normal do cromossomo
onde a mutao apareceu acessvel, pois, nesse caso, existe
uma referncia precisa. As presunes so ainda mais reforadas
se j existirem vrios alelos mutantes e que cada um mostre
uma alterao diferente na seqncia. Foi assim que Balling e
colaboradores em 1996 mostraram que o lcus undulated (un -
Cromossomo 2), identicado por trs alelos, era na realidade o
gene Pax1 (WALLIN et al., 1996).
Se o gene estudado s for conhecido por duas formas
allicas, uma normal e outra patolgica, a prova de que o
gene candidato isolado o bom no pode ser obtida seno
por dois meios: reproduzindo-se a mutao pela inativao
do gene in vivo (camundongo Knock-out) ou, ao contrrio,
corrigindo-se os efeitos da mutao nos camundongos pela
adio de um transgene correspondente a uma cpia normal
do gene (complementao transgnica). A construo desses
camundongos representa uma tarefa pesada, sobretudo quando
se trabalha com grandes genes (cf. FRAZER et al., 1995), e
raramente foi realizada na prtica.
A clonagem posicional nos tempos atuais
Para aqueles organismos cujos genomas foram
seqenciados, a clonagem posicional mudou muito. Porm, para
aqueles que ainda no possuem seus genomas completamente
seqenciados e disponveis, o princpio da clonagem posicional
permanece o mesmo.
Para os genomas seqenciados, as mutaes so
identicadas por uma combinao de mapeamento e
sequenciamento (Figura 25) (KILE & HILTON, 2005). Para o
mapeamento nada mudou, mesmo com o sequenciamento
completo do genoma murino. Assim, o objetivo principal desta
54
etapa continua sendo o de identicar marcadores polimrcos
com localizao cromossmica conhecida que estejam ligados
ao lcus responsvel pelo fentipo alterado estudado.
O mapeamento, assim como antes do sequenciamento,
pode ser dividido e dois grandes nveis: o mapeamento a baixa
resoluo, no qual a mutao localizada no interior de um
grande intervalo cromossmico; e o mapeamento de alta
resoluo, onde o tamanho do intervalo reduzido de forma
que o sequenciamento direto dos genes contidos neste intervalo
possa ser iniciado. O nmero de meioses, para ambos os nveis,
tambm no mudou, ou seja, para o mapeamento baixa
resoluo 20 a 100 animais so necessrios para a genotipagem
com 40 a 100 marcadores distribudos ao longo de todo o
genoma. Para o estgio seguinte, de 100 a 1000 meioses so
necessrias e analis-se todos os marcadores polimrcos
existentes no interior do intervalo cromossmico denido no 1
nvel do mapeamento.
Durante o processo de mapeamento, o intervalo
cromossmico candidato vai sendo denido e detalhado a
ponto de permitir o incio de sequenciamento. No existe
regras estritas que denem quando comear esta nova etapa
da clonagem. A deciso deve ser tomada levando-se em conta
vrios fatores: o quo pequeno o intervalo cromossmico e a
possibilidade de diminu-lo ainda mais, possibilidade esta que
est vinculada a existncia ou no de marcadores polimrcos
na regio; a densidade gnica na regio, esta pode ser avaliada
diretamente no banco de dados do genoma murino (Ensembl:
http://www.ensembl.org/index.html); o custo e disponibilidade
para o sequenciamento comparado ao custo de se gerar e analisar
mais animais. Na prtica, o renamento do intervalo gentico
denido geralmente acompanhado pelo sequenciamento.
Assim que a deciso de sequenciar estabelecida,
a questo passa a ser O que sequenciar?. Levando-se em
conta que, a grande maioria das mutaes pontuais clonadas
no camundongo, foram identicadas nas regies codicadoras
55
dos genes ou nas junes xons-ntrons, certamente o incio do
sequenciamento deve ser focado nessas regies. A disponibilidade
da seqncia completa do genoma murino nos bancos de dados
facilita a identicao dos xons dos diferentes genes contidos
no intervalo. Estes xons podem ser amplicados e isolados
a partir do DNA genmico e sequenciados diretamente. Em
seguida, caso no seja encontrado mutaes nessas regies
prioritrias, deve-se pensar em sequenciar os ntrons, as regies
3 e 5 no traduzidas, a regio promotora e, por m, as regies
intergnicas.
A escolha do gene a ser sequenciado deve ser sempre
combinada com o mapeamento alta resoluo. Por qual gene
comear uma outra questo. Deve-se investigar detalhadamente
a mutao estudada do ponto de vista siopatolgico. A escolha
do gene candidato posicional pode ser infuenciada pelos dados
clnicos da mutao como, por exemplo, processos bioqumicos
afetados, tecidos afetados, mutao com fentipo semelhante
existentes na mesma regio cromossmica mapeada e as
homologias inter-espcies, principalmente entre o homem e o
camundongo.
A identicao da mutao ou do gene mutado no
intervalo cromossmico no signica, necessariamente, que esta
seja a mutao primria que levou a apario da doena. Em
muitos casos, evidncias indiretas so necessrias para provar
tal hiptese. Por exemplo, traar um paralelo entre o fentipo
observado quando o gene do camundongo est mutado e
os fentipos quando o gene ortlogo est mutado em outros
organismos como no rato, homem, drosla, etc; ou mesmo a
similaridade fenotpica, no prprio camundongo, quando outros
genes cujas funes so conhecidas e que participam da mesma
via biolgica do gene candidato em questo. Outra evidncia
inclui o estudo da expresso ou atividade do gene mutado nos
tecidos afetados na patologia. Por outro lado, a evidncia direta
da causa do fentipo mutado requerida. Assim podemos falar
da gerao de animais mutantes transgnicos que recuperam o
fentipo normal ou a gerao de animais mutantes nocautes de
gene identicado.
56
ESTUDO DE CASO
Mapeamento gentico do lcus pmn
Localizao cromossmica da mutao pmn (BRUNIALTI et al.,
1995)
Um estudo recente utilizou metodologia da clonagem
posicional para o mapeamento gentico do lcus pmn em
camundongos. Neste estudo 63 animais N2 homozigotos pmn/
pmn foram obtidos a partir das 12 fmeas F1 interespeccas +/
pmn foram cruzadas com os machos +/pmn do estoque original,
tiveram seu DNA extrado de acordo com a metodologia de
AUSUBEL ET AL. (AUSUBEl et al., 1993) e forma analisados por
um painel de microssatlites.
Foram selecionados 37 marcadores moleculares do tipo
microssatlites distribudos sobre a totalidade dos cromossomos
murinos e que revelaram um polimorsmo entre as linhagens que
foram utilizadas no cruzamento interespecco (AITMAN et al.,
1991; CORNALL et al., 1991; DIETRICH et al., 1992; HEARNE et
al., 1991; LOVE et al., 1990; MONTAGUTELLI et al., 1991). Esses
marcadores foram utilizados na tipagem, pela PCR, dos 63 DNA
dos animais pmn/pmn, e a anlise da segregao dos hapltipos
foi realizada atravs do programa GeneLink (Montagutelli et al.,
1990). Desse modo, foi observado observar um desequilbrio de
ligao entre o lcus pmn e vrios marcadores situados sobre
o cromossomo 13 de camundongo (D13Mit80, D13Mit215,
D13Mit115, D13Mit3, D13Mit16, D13Mit154 e D13Mit61). Os
marcadores mais prximos do lcus pmn foram D13Mit215 e
D13Mit115. A ordem mais provvel desses loci do cromossomo
13 : D13Mit80, D13Mit215, pmn, D13Mit115, D13Mit3,
D13Mit16, D13Mit154 e D13Mit61.Uma anlise detalhada dos
hapltipos est apresentada na Figura 26.
Para conrmar essa localizao cromossmica do lcus
pmn, dois outros cruzamentos foram estabelecidos utilizando
marcadores fenotpicos facilmente reconhecidos (Figura 27).
57
Estudo de Caso
Foram construdos dois estoques balanceados Xt +/+ pmn
e pe +/+ pmn cujos resultados foram:
de 641 animais nascidos do cruzamento entre animais
do tipo Xt +/+ pmn (o que representa 1.282 meioses) no foi
encontrado nenhum recombinante (Figura 27). Nessas condies
estimou-se que a distncia gentica mxima entre o lcus pmn
e os marcadores Extra-toe (Xt) certamente inferior a 1 cM, com
um risco de 5%. A mutao Extra-toe equivale a uma deleo
da regio 5 do gene Gli3 (zinc nger gene Gli3) (VORTKAMP
et al., 1992) e, no homem, corresponde sndrome de Greig
cefalopolisindactilia. O estoque balanceado Xt +/+pmn de
extrema importncia, pois permite diagnosticar o fentipo do
animal desde o nascimento. Observando-se minuciosamente
os recm-nascidos, possvel distinguir os camundongos que
iro desenvolver o fentipo pmn daqueles que permanecero
normais: estes possuem um dedo extranumerrio sendo do tipo
Extra-toe (Xt/+) (Figura 28);
dos 212 animais produzidos a partir do cruzamento
entre os animais pe +/+ pmn (424 meioses) foram encontrados
10 recombinantes, ou seja, animais do tipo pe pmn/pe pmn
que apresentam, ao mesmo tempo, os fentipos pmn e uma
colorao clara da pelagem. Esse resultado colocou pmn a 42
cM do lcus pe.
O prximo passo, seguindo a estratgia da clonagem
posicional, foi o de densicar o mapa gentico vizinho ao lcus
pmn. Densicar o mapa gentico consiste na localizao do
maior nmero possvel de marcadores genticos vizinhos ao
lcus pmn e, para que essas distncias genticas possam ser
calculadas com grande preciso, preciso analisar o maior
nmero possvel de meioses.
Para tanto, um conjunto de DNA originados do
retrocruzamento chamado EUCIB, implicando as linhagens
de camundongos C57BL/6 e SEG/Pas (BREEN et al., 1994), foi
utilizado. Atravs deste painel de DNA foi possvel localizar com
preciso o gene Gli3 utilizando-se para este m o fragmento
58
Estudo de Caso
molecular do gene Gli3, chamado Gli20 (VORTKAMP et
al., 1992), o qual revelou-se polimrco (RFLP) entre as duas
linhagens utilizadas no EUCIB. Com este mesmo painel de
DNA procedeu-se a localizao de 30 marcadores existentes
no cromossomo 13 na regio de mapeamento do lcus pmn
(Figura 29).
Mapa gentico humano
Da comparao do mapa gentico humano com o dos
camundongos observa-se grupos de homologia de sintenia
entre o cromossomo 13 animal e os cromossomos 1, 3, 5, 6, 7,
9 e 10 humanos (Figura 17).
A mutao pmn foi descrita como o modelo animal da
amiotroa espinal do tipo I (Werdnig-Hoffmann), a expresso
aguda da SMA (SCHMALBRUCH et al., 1991) e que foi localizada
no cromossomo 5q11.2-q13.3 humano (BRZUSTOWICZ et al.,
1990; MELKI et al., 1990). Com o intuito de conrmar tal hiptese
foi isolado um fragmento de DNA animal possuindo 95% de
homologia com o gene humano causador da SMA e chamado
SMN (Survival Motor Neuron) (LEFEBVRE et al., 1995; VIOLLET
et al., 1997). Atravs desse fragmento realizou-se a SSCP com
os DNA dos animais pmn/pmn do primeiro cruzamento, tendo
encontrado 11 recombinantes sobre 55 animais testados. Esse
resultado separou o lcus pmn do lcus Smn de 20 cM e colocou
este numa regio mais distal, homloga regio 5q13 humana.
Conclui-se que pmn no era o modelo animal de SMA, pois este
recombina com o lcus Smn causador da doena.
A Figura 30 representa o mapa gentico da regio
cromossmica contendo pmn, no qual observa-se que pmn
est localizado numa regio cromossmica compreendida entre
0 a 1 cM (intervalo de conana de 95%) do lcus Xt (Gli3).
Tais distncias so compatveis com a construo de um contig
cobrindo a regio.
Construo de um contig contendo o lcus pmn
Dando prosseguimento clonagem posicional do
lcus pmn, a etapa seguinte consistiu no isolamento da regio
59
Estudo de Caso
cromossmica contendo o lcus pmn na forma de um conjunto
de clones contguos tambm chamado do contig.
Num primeiro momento os cromossomos articiais de
levedura (YAC) foram utilizados, estes podem conter grandes
fragmentos clonados (de mais de centenas de Kb). O mapa
gentico da regio onde se localiza pmn indicava cinco
marcadores particularmente interessantes: os microssatlites
D13Mit215, D13Mit305 e D13Mit115 e as sondas moleculares
Gli11 e Gli20, que correspondem respectivamente s
extremidades 5 e 3 do gene Gli3 (Xt). Esses marcadores foram
usados na seleo dos YAC.
Mais adiante, tambm foi estabelecido o contig de
cromossomos articiais de bactrias (BAC).
Isolamento e caracterizao preliminar dos YAC que contm
D13Mit215, D13Mit305, D13Mit115, Gli11 e Gli20
Os YAC selecionados a partir dos marcadores Gli11 e
Gli20 foram isolados da biblioteca do Imperial Cncer Research
Fund; os selecionados a partir dos outros marcadores foram
isolados no Gnthon, que possui as bibliotecas oriundas do
MIT/ Princeton (KUSUMI et al., 1993), que cobre 4 vezes o
genoma animal; ICFR (LARIN et al., 1991), que cobre 3 vezes o
genoma de camundongos; St. Marys Hospital (CHARTIER et al.,
1992), que cobre 3,5 vezes o genoma de camundongos.
Essas bibliotecas esto organizadas em pools e superpools
de YAC, podendo ser explorados pela PCR. Desse trabalho foi
possvel isolar 28 clones.
Para a determinao do tamanho dos fragmentos contidos
em cada YAC isolado o DNA de alto peso molecular desses
clones foi preparado em blocos de agarose e os cromossomos
de levedura foram separados pela eletroforese em campo
pulsado. O DNA, assim preparado, foi transferido sobre uma
membrana de Nylon N
+
e hibridizado com uma sonda radioativa
correspondente ao gene URA3 da levedura. O tamanho dos
60
Estudo de Caso
fragmentos dos YAC foi determinado pela comparao com
os tamanhos dos cromossomos endgenos de levedura. (Um
exemplo de hibridizao pode ser visto na Figura 31 e na
Tabela 5 esto representados os resultados obtidos.) Essa etapa
possibilitou a vericao de quais clones eram estveis, ou seja,
aqueles que nos deram como resultado da hibridizao duas
bandas, uma que corresponde ao gene URA3 endgeno, e
outra correspondente ao YAC. Da mesma forma, foi testada a
presena dos marcadores D13Mit215, D13Mit305 e D13Mit115,
utilizamos o mtodo da PCR com uma alquota de cada cultura
diluda 100 vezes. J para os clones isolados a partir das sondas
moleculares Gli11 e Gli20 uma membrana foi preparada e
hibridizada com essas sondas.
Dentre os clones estveis, foram identicados aqueles
que continham ao menos dois marcadores que serviram no
isolamento destes e foi estado a presena de todos os marcadores
microssatlites que haviam sido mapeado na regio do lcus
pmn.
Os marcadores INHBA (PANG et al., 1992) e GCK para o
gene da glucocinase (SANTOSH et al., 1992), que correspondem
aos iniciadores que amplicam o DNA humano e que esto
localizados no cromossomo 7 humano (na regio homloga ao
cromossomo 13 animal, ao redor do lcus pmn), tambm foram
utilizados nessa etapa da clonagem posicional. Os resultados
dessa etapa esto representados na Figura 32.
Dessa fase clonclui-se que o YAC Y902.2 revelou ser
o clone mais interessante, pois ele continha trs marcadores
moleculares - Gli11, Gli20 e GCK - e sabendo-se que pmn est
a uma distncia inferior a 1 cM (risco de 5%) do lcus Xt (gene
Gli3), o que representa, em mdia, 1.800 Kb.
Isolamento e caracterizao preliminar dos BAC contendo os
marcadores D13Mit215, Gli11, Gli20 e D13Mit115
Esses marcadores serviram no isolamento dos BAC
de uma biblioteca construda a partir do DNA genmico de
61
Estudo de Caso
camundongo. Desde processo resultou o isolamento de 3 BAC
a partir do marcador Gli11, 7 clones com o marcador Gli20, um
nico com o marcador D13Mit215 e um outro com o marcador
D13Mit115.
O DNA desses clones foi extrado de acordo com o
protocolo estabelecido no Research Genetics (descrito em
Material e Mtodos), em seguida, foi vericada a presena dos
marcadores que foram utilizados para o isolamento atravs de
hibridizaes com os marcadores Gli11 e Gli20 e pela PCR com
os demais marcadores. Esses clones foram utilizados na procura
de seqncias codicadoras que se encontram nessa regio
(Tabela 6).
Mapa fsico ao redor do lcus pmn
A etapa seguinte da clonagem posicional consiste na
construo de um mapa de restrio do contig, que deve
evidenciar possveis rearranjos ocorridos com os insertos
contidos nos YAC (inseres, delees), permitindo localizar
os genes candidatos na regio de interesse. Ela tambm serve
como referncia para a construo do mapa fsico da regio
genmica correspondente.
Esse mapa foi construdo com 3 YAC Y902.2, Y903.1
e Y13.305.2 , permitindo a deteco de todos os rearranjos
neles existentes, sendo que seria pouco provvel que trs clones
independentes apresentassem as mesmas anomalias.
As enzimas de restrio que cortam raramente o genoma
e que esto associadas s ilhas CpG (veja explicao na
Introduo) foram utilizadas na construo de tal mapa. Todos
os stios de restrio foram identicados para as enzimas BssHII,
EagI, MluI, NotI, NruI, SacII e SmaI.
Foram realizadas digestes parciais pelas enzimas citadas
acima com o DNA do YAC preparados em blocos de agarose.
Os fragmentos foram, em seguida, separados por eletroforese
62
Estudo de Caso
em campo pulsado. O DNA foi transferido para uma membrana
de Nylon N
+
e esta foi hibridizada sucessivamente com:
1. um fragmento do pBR322, que corresponde ao
brao direito do pYAC4;
2. um fragmento do pBR322, correspondendo ao
brao do pYAC4.
Tal procedimento permitiu determinar a posio de cada
stio de restrio com relao extremidade direita ou esquerda
do vetor pYAC4 (mtodo adaptado de SMITH; BIRNSTEIL,
1976).
A extremidade esquerda do inserto contido no clone
Y202.2 foi isolado atravs da tcnica de PCR inversa RsaI.
O fragmento de 500 pb foi seqenciado e denominado
extremidade 11, este foi utilizado na construo do mapa de
restrio do contig. Esse fragmento, presente nos YAC Y902.2,
Y903.1 e Y13.305.2 (Figura 33), corresponde a uma EST de
camundongo isolada de uma biblioteca de cDNA construda a
partir de um tecido de corao hipertroado.
Os fragmentos de DNA Gli20 e Gli11, que correspondem
ao gene Gli3, foram igualmente utilizados na construo
do mapa de restrio do contig e suas localizaes foram
determinadas atravs de hibridizaes sobre as membranas de
nylon construdas para este m. A comparao do resultado de
hibridizao para cada um dos fragmentos permitiu a localizao
precisa dos marcadores e conduziu ao estabelecimento do mapa
de restrio do contig, representado na Figura 34.
As pores quimricas dos YAC puderam ser determinadas
atravs da comparao entre os mapas de restrio estabelecidos
para cada clone. Por exemplo: o YAC Y301.1 quimrico;
atravs do mapa de restrio desse clone identicou-se todos
os stios de restrio comuns com os clones Y902.2 e Y13.305.2
e que no so quimricos.
63
Estudo de Caso
Esse contig cobre uma distncia de aproximadamente
2 Mb entre a extremidade proximal do clone Y902.2 e distal
do clone Y13.305.2. Nenhum rearranjo ou deleo maior
foi observado no YAC Y902.2. Se nenhum recombinante foi
encontrado entre pmn e Xt (gene Gli3) chegou-se a concluso
que o YAC 902.2 representava o principal clone para a procura
de seqncias codicadoras existentes nessa regio.
O resultado deste trabalho foi a identicao de pelo
menos trs ilhas CpG potenciais presentes nesses clones: 2
ilhas nos YAC Y902.2 e Y13.305.2, entretanto no foi possvel
determinar se esses stios so metilados in vivo nos camundongos.
O status dessas ilhas CpG deveria, ento, ser conrmado pelo
mapeamento da regio genmica correspondente. Entretanto,
Larsen e outros (1992b) mostraram que, desde que 3 ou
mais stios dessas enzimas que cortam raramente o genoma
coincidam com o nvel do DNA do YAC, esses stios devem
estar associados aos genes ao menos em 90% dos casos.
Isolamento e caracterizao dos xons a partir do DNA do
contig
Com o objetivo de identicar as seqncias codicadoras
a partir do contig foi utilizada a tcnica de amplicao dos
xons, sendo que, contig de BAC estabelecido na regio de
interesse foi o escolhido para este m.
Os experimentos foram realizados com os BAC isolados
a partir dos marcadores moleculares Gli20, Gli11, D13Mit215 e
D13Mit115, respectivamente os clones 283E20, 12P11, 388A11
e 496K2 (Tabela 6).
Na primeira etapa, aps clonagem no vetor pAMP10,
foram eleiminados os clones que continham insertos muito
pequenos (< 100 pb), pois seria muito complicado escolher
iniciadores para a PCR a partir de fragmentos de pequeno
tamanho.
64
Estudo de Caso
No foi possvel isolar seqncias codicadoras a partir
dos clones 388A11 e 496K2. Os resultados apresentados
correspondem, pois, aos insertos isolados a partir dos clones
283E20 e do clone 12P11.
Foram obtidas 115 colnias; destas, 47 foram eliminadas,
pois continham insertos de tamanho inferior a 100 pb; 50
colnias continham apenas as seqncias do vetor. Na verdade,
como foi descrito na seo Material e Mtodo, o DNA genmico
a ser analisado clonado dentro de um ntron do gene tat de
HIV. A presena de um stio crtico de recomposio dentro
desse ntron pode, em parte, ser o responsvel pelo isolamento
dos falsos positivos contendo seqncias derivadas do vetor.
Enm, 10 colnias, correspondentes s seqncias provenientes
dos marcadores Gli11 e Gli20, foram isoladas.
A Tabela 7 e a Figura 35 indicam os resultados das 8
colnias restantes nas quais as seqncias correspondem s
seqncias de genes conhecidos ou no e s seqncias das
EST humanas.
No total, foi possvel explorar 260Kb, nas quais foram
encontrados 8 fragmentos correspondentes a 8 genes potenciais.
Dessa forma, estimou-se que na regio do cromossomo 13 de
camundongos contendo o lcus pmn, a densidade gnica mdia
deve ser de um gene a cada 33 Kb.
As EST
As EST humanas, das quais o mapeamento cromossmico
foi publicado (SCHULER et al., 1996), oferecem uma ferramenta
na clonagem dos genes de camundongos levando-se em conta as
homologias de sintenia conhecidas entre essas duas espcies.
Neste sentido, foram selecionadas as EST humanas
localizadas na regio 7p vizinhas ao gene Gli3 e, dessa primeira
seleo, priorizou-se aquelas EST que no tinham homologia de
seqncia com um gene j conhecido.
65
Estudo de Caso
Assim, 15 dessas EST (Tabela 8) e seus iniciadores foram
testados pela PCR sobre o DNA de todos os nossos clones YAC
e BAC (Figura 35), sobre o DNA genmico e cDNA (RT-PCR do
fgado) dos animais de fentipo pmn, Xt e selvagem (+), o que
permitiu o reconhecimento da existncia de uma ou mais EST
localizadas nessa regio do cromossomo 13 de camundongos
e, atravs da tcnica da RT-PCR foi possvel evidenciar uma
possvel diferena de amplicao entre trs cDNA testados
(Xt, pmn e selvagem). O DNA genmico serviu como controle
da amplicao. A Tabela 8 mostra a totalidade dos resultados
obtidos.
Ainda que a maior parte das EST testadas nos tenha dado
resultados positivos para a RT-PCR, nenhuma delas permitiu
detectar uma diferena no tamanho do produto amplicado
pela PCR entre os animais Xt, pmn ou selvagem (um exemplo
disso est mostrado na Figura 36). Tal armao mostra o poder
dessa ferramenta na clonagem dos genes murinos.
66
A MUTAO pmn: UM MODELO DE NEUROPATIA
HUMANA
pmn: um modelo potencial para a patologia neuromuscular
humana
pmn: uma mutao de efeitos independentes
O estudo de caso apresentado ilustrou a tentativa de
clonagem posicional de um gene responsvel pela mutao de
camundongos cujos efeitos so principalmente neuropatolgicos,
os quais podem ser observados no nvel dos neurnios motores
na medula espinal. Essa neuropatia causada por um processo
de morte retrgrada (dying back neuronopathy), durante o
qual a patologia comea nas terminaes nervosas e progride
ao longo do axnio em direo ao corpo celular. Esse esquema
patolgico j conhecido no homem e pode ser encontrado nas
diversas formas de amiotroas espinais. A mutao descrita tem
penetrncia completa, pois aparece em 100% dos indivduos
homozigotos, e o desenvolvimento da doena totalmente
homogneo em relao ao tempo e gravidade qualquer que
tenha sido a linhagem de camundongo na qual a mutao
tenha segregado. Essa armao extremamente interessante,
pois, contrariamente a outras mutaes neurolgicas dos
camundongos como, por exemplo, wobbler (wr - crom. 11 -
DESPORTES et al., 1994), ela mostra que o processo patolgico
que leva os animais pmn/pmn a morte sem dvida alguma
controlado pelo nico gene pmn.
pmn no o lcus homlogo ao lcus responsvel pela amiotro-
fa espinal do tipo Werdnig Hofmann humana
Ao longo do trabalho tambm foi mostrado que, a
despeito de fortes semelhanas anatomopatolgicas, a mutao
pmn no correspondia ao homlogo murino da amiotroa
espinal do tipo Werdnig Hoffmann humana. Este gene (Smn),
que agora est clonado, foi mapeado a, mais ou menos, 20
cM do lcus pmn na regio telomrica do cromossomo 13 de
A Mutao pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
67
camundongos, exatamente no ponto em que no era esperado,
ou seja, na regio de homologia com o cromossomo 5 (5q11.2-
q13.3), onde o gene humano SMN foi mapeado.
At o presente momento no existe nenhum alelo
mutante espontneo do lcus Smn e espera-se que esta seja
produzida in vitro, por recombinao homloga nas clulas
ES, quando, ento, talvez seja revelada a funo desse gene
nos camundongos. Poder-se-, dessa forma, medir o quo as
sndromes humanas podem ser semelhantes umas s outras.
Essa ausncia de homologia entre pmn e Smn no
representa um caso isolado. Ao olharmos as Tabelas 1 e 2
percebemos que grande parte dos genes recuperados nos
camundongos e que tm efeitos deletrios sobre o sistema
neuromuscular no possuem homlogos conhecidos na espcie
humana, e vice-versa. Assim, podemos dizer que nesse estudo
de caso o homlogo humano da sndrome pmn ainda no
conhecido.
Talvez a hiptese mais plausvel para explicar tal
observao, seja o fato de que dispomos, at o presente momento,
de somente uma pequena amostra dos mutantes potenciais de
camundongos. Nesse contexto, os grandes projetos mundiais
de induo de novas mutaes atravs de agentes qumicos,
como o Etil-nitroso-uria (ENU), abrem sem dvida algumas
perspectivas muito interessantes.
pmn: um bom modelo anlogo s amiotrofas espinais
Outro fato relatado neste estudo de caso e que vale
a pena salientar foi o sistema de manuteno da mutao
desenvolvido. Este consistiu no cruzamento dos indivduos
duplos heterozigoto Xt e pmn entre eles (Xt +/ + pmn), o qual
possibilita o reconhecimento, desde o nascimento, dos animais
que desenvolvero a doena pmn antes mesmo que os primeiros
sinais da patologia apaream. Tal modelo de manuteno permitiu
que a mutao pmn fosse utilizada para testar a ecincia de
68
certas estratgias teraputicas atravs de substncias biolgicas
ou qumicas conhecidas por suas atividades na sobrevivncia
dos neurnios motores. Foi demonstrado, por exemplo, que a
administrao do CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), sintetizado
por broblastos geneticamente modicados e enxertados no
comeo da doena, diminui a velocidade da evoluo da doena,
mas no consegue par-la denitivamente (SAGOT et al., 1995b;
SENDTNER et al., 1992). Da mesma forma, foi demonstrado que
a superexpresso do proto-oncogene Bcl-2 (que secreta uma
substncia anti-apopttica) nos homozigotos pmn/pmn no age
na progresso, to pouco na expresso da doena e tambm
no impede a degenerao axonal. Entretanto, foi estabelecido
que ela reduz a perda neural no ncleo facial (SAGOT et al.,
1995a). Enm, a administrao do fator neurotrco GDNF
(Glial cell line Derived Neurotrophic Factor) produz resultados
similares ao CNTF (SAGOT et al., 1996).
Esses resultados levam-nos a pensar que, para essa
mutao, o processo patolgico fundamental no um problema
do corpo celular, mas, ao contrrio: que ela leva a uma neuropatia
secundria, e no a uma axonopatia. Alm disso, esses estudos
mostraram que (1) os mecanismos que levam a uma axonopatia
so independentes daqueles que causam as neuropatias e (2)
que os fatores neurotrcos tm mecanismos de ao muito
especcos e que so diferentes uns dos outros.
pmn, onde est o mal?
O estudo anatomopatolgico dos camundongos
homozigotos para a mutao pmn mostrou claramente
que somente uma parte dos neurnios motores afetada
e degenera, enquanto que a outra parte, aparentemente,
sobrevive normalmente. As razes dessa heterogeneidade
no so conhecidas, mas, com certeza, a elucidao dessa
diferena poder ser de grande importncia na compreenso da
siopatologia da doena. Poderamos imaginar que a populao
de neurnios motores, como a populao de linfcitos, ainda
que homogneos do ponto de vista morfolgico, na realidade
composta de vrias famlias, cada uma respondendo a fatores
69
trcos diferentes. Nesse caso, pmn afetaria somente uma nica
subpopulao de neurnios motores. Contrariamente, tambm
poderamos pensar que todos os neurnios motores pertencem
a uma mesma famlia e que a degenerao de alguns deles nos
animais pmn, num estado precoce, seria apenas o resultado
de um evento j programado, mas que nesses animais estaria
acontecendo prematuramente.
Alguns trabalhos realizados com os fatores de crescimento
dos neurnios motores (HENDERSON, 1995) tendem a aceitar a
hiptese da existncia de uma heterogeneidade populacional.
A etapa seguinte
A despeito dos esforos realizados, no foi possvel
identicar genes candidatos para o lcus pmn, mas, graas ao
contig de YAC e BAC construdo, sabe-se que o gene est mega
pares de bases que foram clonados. Vrias estratgias podero
ser seguidas na continuao deste trabalho, quais sejam:
realizao um enorme trabalho de subclonagem dos
clones do contig e, em seguida, um sequenciamento sistemtico,
como vem sendo feito classicamente no homem;
recuperao dos cDNA candidatos atravs da
hibridizao in situ ou a cDNA selection, mas, como j foi
dito anteriormente, esta uma tcnica difcil de se colocar em
prtica;
na realidade, tendo em vista o atual estado dos
conhecimentos e dos meios disponveis, o mais astucioso e o
menos oneroso consiste, sem dvida alguma, em utilizar as EST
j mapeadas na regio homloga humana, que estejam sobre
o cromossomo 13 murino e que etiquetem um novo gene.
Entretanto, certamente sero encontrados novos marcadores
moleculares que permitiro melhorar a resoluo do nosso
mapa fsico.
Uma concluso tirada da clonagem posicional que,
contrariamente ao que a maioria acredita, ela , na prtica, mais
70
difcil de ser concluda nos camundongos do que no homem.
No caso descrito, chegou-se muito perto do lcus pmn, j que
foi possvel criar a quantidade de animais desejados e realizar,
dessa forma, um mapa muito preciso em volta do lcus pmn.
Entretanto, existe apenas um nico alelo mutante para ser
comparado ao alelo normal e, caso esta seja uma mutao de
ponto, o seqenciamento de todo o gene deve ser considerado
um fato para, quem sabe, identicar a anomalia. Em humanos,
ao contrrio, os genes que foram clonados o foram porque
existia, na maior parte das vezes, uma grande variedade de
alelos (os geneticistas humanos falam de famlias), os quais
s vezes estavam associados a rearranjos cromossmicos
mais ou menos importantes (translocaes, inverses, etc.), e
sabemos que esses rearranjos so tidos como marcadores de
proximidade e ajudam muito no trabalho dos pesquisadores.
Nos camundongos, podemos encontrar rapidamente a ordem
linear dos genes dentro de um segmento cromossmico, mas
eles no permitem identicar facilmente um gene que s possui
um nico alelo mutante.
O fato de que o lcus pmn no recombina jamais com
o lcus Xt pode, de certa forma, confundi as idias, pois
exatamente o que esperado na medida em que o marcador Xt
representa uma pequena deleo. Espera-se colocar no futuro o
lcus pmn na frente de um segundo alelo Xt (Pdn, por exemplo),
o qual no possui uma deleo, mas corresponde a um pequeno
rearranjo cromossmico. Alm disso deve-se pensar em refazer o
mapa gentico da regio a partir de um cruzamento envolvendo
um cromossomo normal, pertencente a uma outra linhagem de
camundongo, e que possua vrios marcadores que estejam em
repulso com relao a pmn.
Podemos defnir o perfl de um gene candidato?
Atualmente, vrias mutaes que levam a morte dos
neurnios motores foram identicadas pela clonagem posicional
humana ou nos camundongos ou, o que mais freqente, pelo
knock-out de um gene cuja funo era total ou parcialmente
desconhecida. Os resultados obtidos no permitem denir um
71
perl de uma protena candidata para o produto do gene pmn.
Genes to diferentes como Sod1 (Superoxyde
dismutase), Il3 (Interleukina 3) ou Nfh (Neurolament heavy
protein) conduzem todos os trs a uma amiotroa espinal com
comprometimento dos neurnios motores e suas seqncias
nucleotdicas no tm nenhuma homologia.
Nesse ponto admiti-se ainda que os genes que codicam
protenas que tm receptores na superfcie das clulas-alvo
produziro o mesmo tipo de mutao que os genes que
codicam para o ligante. Infelizmente, pouqussimas so as
mutaes nos camundongos que afetem principalmente o
neurnio motor (conhecemos oito mutantes desse tipo). Alm
disso, para nenhuma delas o gene est clonado ou possui um
equivalente conhecido no homem (BRUNIALTI et al., 1995), o
que quer dizer que, no nal, ao menos oito novas protenas sero
descobertas, todas com um papel importante na manuteno da
integridade do neurnio motor... certamente deve existir muito
mais que isso!
72
FINAL DA HISTRIA
O gene responsvel pela mutao pmn foi nalmente
clonado em 2001 (MARTIN et al., 2002). Para tanto, foi necessrio
analisar 902 animais F2 mutantes, ou seja, 1804 meioses para,
assim, obter-se um mapeamento gentico e fsico alta resoluo
(MARTIN et al, 2001). Um BAC foi isolado contendo o lcus
pmn, o qual foi, ento, totalmente seqenciado, sendo possvel
evidenciar o gene Tbce (tubulin-specifc chaperone e) como um
forte candidato para a mutao pmn. Aps anlises de expresso
e seqenciamento do gene nos animais normais e mutantes foi
identicado que a mutao levando ao fentipo pmn era uma
substituio de um aminocido triptofano para uma glicina na
posio 524 (Trp524Gly), correspondendo ao ltimo aminocido
da protena chaperone e tubulina-especca (Tbce). Essa
substituio levou queda na estabilidade da protena. Foi
levantada a hiptese de que, em camundongos, a protena Tbce
teria um papel fundamental na manuteno da integridade
celular dos neurnios motores, provavelmente agindo sobre
a estabilidade ou sobre a dinmica de polimerizao destes.
Finalmente, o gene Tbce murino tem seu ortlogo humano TBCE
localizado no cromossomo 1. No homem, uma mutao nesse
gene causa a Sndrome Kenny-Caffey (PARVARI et al., 2002),
cujo fentipo totalmente diferente daquele observado nos
animais pmn. Essa constatao pode signicar que a protena
codicada pelo gene TBCE esteja atuando em diversos tecidos
e que mutaes diferentes podem ter conseqncias distintas
levando a diferentes fentipos.

73
MATERIAL E MTODOS UTILIZADOS NO ESTUDO DA
MUTAO pmn
Origem dos alelos mutantes e das linhagens utilizadas
O alelo mutante pmn utilizado no estudo de caso
apresentado foi importado do Instituto Panum, em Copenhague,
onde foi descoberto num estoque de camundongos da
linhagem NMRI/Pan (SCHAMALBRUCH et al., 1991). Machos
heterozigotos +/pmn oriundos do estoque de origem foram
retrocruzados inmeras vezes com fmeas da linhagem 129/
Sv-Pas, que corresponde a uma linhagem isognica mantida
no Instituto Pasteur, na Frana com o objetivo de aumentar o
prolicidade dos animais mutantes.
Os alelos mutantes Extra-toes (Xt) e pearl (pe) foram
importados do Mammalian Genetic Unit, do M.R.C., Harwell,
UK (cortesia dos doutores A. G. Searle e M. F. Lyon). Esses alelos
tambm foram transmitidos para o background gentico do tipo
129/Sv-Pas, da mesma forma como foi feito para o alelo mutante
pmn.
A mutao Extra-toe (Xt) autossmica dominante e
caracteriza-se, do ponto de vista fenotpico, pela presena de
um dedo extra-numerrio na face interna das patas posteriores
(Figura 28). A mutao pearl (pe) autossmica recessiva e
caracteriza-se por uma forte diluio da colorao da pelagem
que pode ser mais bem observada em animais cujo background
gentico Agouti-Black (A/-; B/-).
Para o estabelecimento da localizao gentica da
mutao pmn foi utilizado camundongos da linhagem SEG/
Pas e STF/Pas, linhagens parcialmente isognicas derivadas da
espcie Mus spretus.
74
Material e Mtodos Utilizados no Estudo da Mutao pmn
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do
mapa gentico
Cruzamentos realizados
Para realizar o mapeamento gentico da mutao pmn,
foram realizados dois tipos de cruzamentos.
O primeiro cruzamento foi do tipo retrocruzamento
interespecco implicando as linhagens SEG/Pas e STF/Pas, as
quais correspondem s linhagens moderadamente isognicas
provenientes da espcie Mus spretus. Esse retrocruzamento
interespecco foi construdo para o mapeamento do lcus
pmn atravs da utilizao de marcadores moleculares do tipo
microssatlites, que so muito polimrcos entre as linhagens
derivadas das espcies Mus spretus e as linhagens de laboratrio.
Alm disso, os microssatlites so facilmente utilizveis,
permitindo assim localizar o lcus pmn relativamente rpido.
Vrias fmeas heterozigotas +/pmn foram cruzadas com
machos +/+ STF/Pas ou SEG/Pas para a produo de fmeas F1 +/
pmn? (os machos F1 oriundos desse cruzamento so estreis). As
fmeas F1 interespeccas foram retrocruzadas com os machos
+/pmn do estoque de origem. Os animais mutantes pmn/pmn
foram coletados e utilizados para a anlise dos hapltipos.
O segundo cruzamento foi um intercruzamento,
realizado com os animais portadores dos marcadores fenotpicos
Extra-toe (Xt) e pearl (pe). Esses cruzamentos foram realizados
para (1) conrmar a localizao cromossmica da mutao
pmn estabelecida com a anlise do resultado do cruzamento
interespecco descrito acima e (2) para integrar o lcus pmn
num mapa consenso do cromossomo 13 de camundongos,
considerando que a mutao Xt tambm pode ser identicada
molecularmente atravs da sonda Gli20.
Extrao do DNA
O bao e, em alguns casos, o crebro e os rins dos
animais homozigotos para a mutao pmn foram coletados e
75
congelados imediatamente no nitrognio lquido. Esses rgos
foram, em seguida, triturados no nitrognio lquido, e o p
obtido foi dissolvido em 5ml de tampo de lise (50mM Tris pH
8; 100mM EDTA pH 8; 1% Sarcosyl). Aps 1 hora de incubao
a 55C, foram acrescentados a esse tubo 15l de proteinase K
(20 mg/ml) para cada ml de tampo de lise. A mistura obtida
foi incubada a noite toda a 55C. Aps esse tempo, foram
adicionados ao tubo 20l de RNAse (10mg/ml). Depois de
uma incubao a 37C durante 30 minutos, 4 extraes
sucessivas foram realizadas (2 de fenol, 1 de fenol/ clorofrmio
e 1 de clorofrmio). A soluo de DNA obtida foi, em seguida,
submetida a uma dilise (tampo de dilise: 10mM Tris pH 4,7;
0,1mM EDTA) duas vezes durante 24 horas numa temperatura
de 4C. A qualidade do DNA extrado foi vericada atravs de
um gel de agarose 0,3%. O peso molecular mdio obtido foi
julgado satisfatrio quando superior a 40Kb. A concentrao
do DNA foi calculada pela medida da densidade tica a 260
nm e o grau de pureza foi apreciado pela comparao com a
densidade tica a 280 nm.
Reao em cadeia da polimerase (PCR)
Iniciadores
Os dados relativos aos marcadores microssatlites testados
(seqncias, motivos de repetio, condies de amplicao,
tamanho do fragmento amplicado) foram descritos em diversas
publicaes: AITMAN et al., 1991; CORNALL et al., 1991;
DIETRICH et al., 1992; HEARNE et al., 1991; LOVE et al., 1990;
MONTAGUTELLI et al., 1991.
Condies de amplifcao
De forma geral, as reaes de amplicao foram
efetuadas em 25ml com as concentraes nais seguintes: 10mM
Tris pH 8,4; 50mM KCL; 0,1% Tween 20; 200mM de dATP,
dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia). A concentrao ideal de Mg
2+

foi determinada para cada par de iniciadores. 100ng de DNA
e 0,6 U de Taq Polimerase (Amersham) foram utilizados para
76
cada reao. As reaes foram efetuadas nos termocicladores
LEP PREM III e TECHNE PHC-3, seja em tubos (40 tubos), seja
em placa de Elisa (96 poos). Trs programas diferentes foram
utilizados de acordo com os iniciadores:
40 ciclos (1 a 94C, 1 a 55C, 30 a 72C) precedidos
por uma desnaturao de 3 a 94C e seguidos de uma extenso
nal de 3 a 72C;
10 ciclos (130 a 92C, 1 a 55C, 30 a 72C), 40
ciclos (130 a 94C, 1 a 55C, 30 a 72C), o todo precedido
de uma desnaturao, seguida de uma extenso nal;
35 ciclos (45 a 94C, 130 a 55C) precedidos por
uma desnaturao de 3 a 94C e seguidos de uma extenso
nal de 3 a 72C.
Anlise dos produtos de PCR
Os produtos das diferentes reaes de amplicao foram
separados num gel de agarose 4% (1% agarose, 3% Nusieve) no
tampo TBE (90mM Tris, 90mM cido brico, 2mM EDTA) e
visualizados na presena de brometo de etdio ou em de gel de
acrilamida a 8% a m de melhorar a resoluo das bandas.
Anlise do polimorfsmo dos microssatlites pela SSCP
Para tanto, as reaes de PCR foram feitas num volume
de 10l, a composio e concentraes dos reagentes foram as
mesmas, a no ser pelo dCTP frio, que foi substitudo pelo dCTP
radioativo
33
P (0,05mM concentrao nal). Os produtos de
PCR foram diludos em EDTA 20mM e SDS 0,1%. Uma amostra
de 2l de cada diluio foi misturada a 2ml do tampo de
parada do seqenciamento (blue stop). Essas amostras foram, em
seguida, desnaturados a 90C durante 5 minutos e colocadas,
imediatamente, no gelo. Logo depois, as amostras foram
separadas num gel de acrilamida no desnaturante (acrilamida
6%) e visualizados por auto-radiograa.
77
Anlise dos resultados
Para cada marcador microssatlite foi examinado a
distribuio dos heterozigotos (dois produtos de amplicao
de tamanhos diferentes) e a dos homozigotos (um nico produto
de amplicao). Os resultados foram analisados por meio de
um programa chamado GENE-LINK (MONTAGUTELLI, 1990),
que calcula, para cada caso, as probabilidades de ligao entre
os loci.
A coleo de DNA do EUCIB
Para estabelecer um mapa gentico de alta resoluo em
torno do lcus pmn, utilizou-se a coleo de DNA do European
Collaborative Interspecifc Backcross. Essa coleo de DNA
formada por 982 amostras, ou seja, 982 meioses originou-se de
dois cruzamentos em retorno interespeccos complementares:
um do tipo (C57BL/6 x Mus spretus) F1 x C57BL/6 e outro do tipo
(C57BL/6 x Mus spretus) F1 x Mus spretus. Todas essas amostras
foram utilizadas no mapeamento dos marcadores microssatlites
disponveis localizados no cromossomo 13. Dessa forma, o
mapeamento da sonda Gli20, que corresponde ao lcus Gli3 o
qual cosegrega constantemente com pmn (maiores detalhes no
estudo de caso), possibilitou integrar o lcus pmn num mapa
molecular consenso e de alta resoluo.
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do
mapa fsico
Preparao do DNA de levedura em blocos de agarose (adapta-
do de BIRREN at al., 1993)
O DNA de levedura foi preparado a partir dos esferoplastos
com o uso de Novozyme, os quais foram lisados com o dodecil
sulfato de ltio. Essa tcnica, que nos permite obter cromossomos
de levedura intactos, com cada bloco chegando a conter entre
1 e 2g de DNA, tem um princpio bem simples: uma colnia
inoculada num meio seletivo, sem triptofano nem uracila (meio
78
AHC, Current Protocols in Human Genetics, 5.5.7.), e cultivada a
30C. Uma parte dessa pr-cultura foi transferida para um meio
rico (YPD, Current Protocols in Human Genetics, 5.5.8.) para a
obteno de uma cultura prxima saturao, no dia seguinte
(D.O. 600nm = +/- 3). A cultura, em seguida, foi centrifugada e
o pellet ressuspenso em uma soluo contendo 10mM Tris-HCl
pH 7,5, 50mM EDTA pH 7,5 e lavado uma segunda vez em 10ml
de SCE (1 M sorbitol; 0,1 M citrato de sdio pH 5,8; 10 mM EDTA
pH 7,5). Aps centrifugao, as clulas foram ressuspendidas
num volume de SCE tal que a concentrao em clulas fosse
a de 4 x 10
9
clulas por ml. Acrescentou-se, ento, um volume
igual de agarose Seaplaque GTG (FMC) 1,5 % preparada no SCE
e contendo 8 mg/ml de Novozyme (Sigma, L3768), e o todo
foi conservado a 50C. A mistura foi rapidamente colocada
em formas de Plexiglas para formar blocos. Para a formao de
esferoplastos, os blocos foram transferidos para uma soluo
de SCE contendo 10 mM de DTT e incubados 2 horas a 37C.
A lise das clulas foi realizada numa soluo contendo 1% de
dodecil sulfato de ltio, 100 mM EDTA e 100 mM Tris-HCl pH 8
durante 16 horas. Os blocos foram, em seguida, lavados no TE
(10mM Tris-HCL pH 8; 1 mM EDTA pH 8) e conservados em 10
mM Tris e 10 mM EDTA a 4C.
Alguns lotes de Novozyme no so, porm, totalmente
puros e podem conter DNAse. Cada lote desse produto deve,
ento, ser testado individualmente.
Eletroferese e campo pulsado e hibridizao
Com a utilizao do aparelho CHEF DR II (Biorad), o qual
produz um campo eltrico homogneo a partir de um dispositivo
hexagonal de 24 eletrodos, estes so ativados de tal forma que
produzem alternativamente dois campos eltricos, nos quais os
vetores de corrente formam um ngulo de 120 um em relao
ao outro. A concentrao da agarose, a concentrao e a
temperatura do tampo, a voltagem, a durao das pulsaes e
a durao total da eletroferese so fatores que afetam o resultado
nal da migrao (BIRREN et al., 1993).
79
Na prtica, as eletroforeses so realizadas na agarose
Seakem GTG (FMC) a uma concentrao de 1% em 0,5 x TBE.
As condies da eletroforese so adaptadas ao tamanho do DNA
que ser separado, seguindo-se as recomendaes de Birren e
Lai (1993). A quantidade de DNA depositada em cada pista no
deve ultrapassar 10 mg. Foram utilizados como marcadores de
peso molecular os cromossomos de Saccharomyces cerevisiae
(16 cromossomos de 225 a 1900 Kb; Yeast chromosome PFG
Marker, New England Biolabs) e um padro de concatmeros de
fagos Lambda (padro de 48,5 Kb a 1018 Kb, Lambda Ladder
PFG Marker, new England Biolabs).
Para a anlise em Southern, o DNA, aps a migrao,
foi transferido para uma membrana de Nylon N
+
da seguinte
maneira: aps colorao no brometo de etdio, o DNA foi
depurinado em HCl 0,25 N durante 8 minutos; em seguida,
foi neutralizado por 30 minutos em 0,5 M Tris-HCl pH 7. A
transferncia para a membrana foi realizada em 1,5 M NaCl; 0,5
M NaOH, durante toda a noite. Aps esse tempo, a membrana
foi neutralizada em Tris-HCl 0,5 M pH 7 e, em seguida, foi
lavada em 2 x SSC (0,33 M NaCl; 0,03 M Na
3
-citrato-2H
2
O).
As hibridizaes foram realizadas na presena do
tampo de hibridizao Church, a 65C, a noite toda. Aps
a hibridizao, os ltros foram lavados no SSC 0,1%, SDS, a
65C.
Isolamento das extremidades dos cromossomos artifciais de
levedura pela PCR-inversa (adaptado de ARVEILER; PORTEUS, 1991)
O DNA do YAC foi digerido por uma enzima cujo stio de
restrio est presente no vetor. O DNA digerido foi, em seguida,
religado sobre si mesmo. Entre as molculas circulares, algumas
possuem um fragmento do vetor fanqueando uma extremidade
do YAC. Utiliza-se, em seguida, iniciadores especcos do vetor
para amplicar a extremidade do YAC (Figura 37).
Na prtica, meio bloco de DNA de levedura (0,5 a 1 ng
de DNA) foi digerido durante 3 horas por enzimas apropriadas
80
(brao esquerdo: TaqI, RsaI, EcoRV; brao direito: PstI, RsaI,
EcoRV). Recomenda-se acrescentar soro de albumina bovina
(BSA) e espermidina. Aps digesto, os blocos foram lavados
em 10 mM Tris-HCl pH 7,5 e em 10 mM EDTA e colocados
dentro de 200 a 400 l (1/2 ou 1 bloco) do tampo de ligao
1X. Aps incubao durante 10 minutos a 65C, o ATP foi
acrescentado a uma concentrao nal de 1 mM, 2 unidades
de B-agarose (Calbiochem) e 40 unidades de ligase (Biolabs).
A mistura foi incubada durante 2 horas a 37C, seguida de
uma hora temperatura ambiente e, nalmente, a noite toda a
14C. Dessa mistura, 5 l foram utilizados para a PCR. A reao
de amplicao foi realizada em 100l com 100 ng de cada
iniciador:
Brao esquerdo: 1. GAATTGATCCACAGGACGGG
2.GCCAGTTGGTTTAAGGCGC
Brao direito: 1. GGAAGAACGAAGGAAGGAGC
2. GCCCGATCTCAAGATTACG
Condio de amplicao: 95C, 5 minutos, seguido de
30 x 94C 45 segundos; 60C, 1 minuto; 72C, 2 minutos. Os
produtos foram analisados em gel de agarose e clonados.
Mapa de restrio do contig de YAC
O mapa de restrio do contig foi construdo atravs da
execuo de digestes totais e parciais do DNA dos YAC. Na
prtica, os blocos so lavados quatro vezes durante 30 minutos
no TE a 40C e equilibrados no tampo de restrio 1X durante
60 minutos no gelo (utilizar 300 l nais para cada bloco de
100ml).
O tampo de restrio 1X , em seguida, substitudo por
uma soluo de digesto completa, ou seja, tampo de restrio
1X, soro de albumina bovina 500 mg/ml, espermidina nas
respectivas concentraes (5 mM para os tampes de restrio
cuja concentrao em sal seja de 50-100 mM; 10 mM para
81
aqueles cuja concentrao em sal seja superior a 100 mM), 1
mM de DTT e um nmero adequado de unidades de enzima.
No se deve colocar a espermidina nas digestes com a enzima
SfI. A reao colocada um hora no gelo antes da incubao
temperatura adequada. As digestes completas so realizadas
a noite toda.
Para reaes parciais, utiliza-se o mesmo nmero de
unidades de enzima colocado na digesto completa, porm
o tempo de incubao modicado. Em geral, tempos de
incubao entre 8 a 20 minutos so sucientes para se obterem
bons resultados na digesto parcial (HAMVAS et al., 1994). As
condies de digesto parcial devem ser testadas para cada
preparao de DNA em bloco de agarose. As reaes so
paradas acrescentando-se ao tubo 500l de EDTA 500mM no
gelo. Recomenda-se lavar os blocos no tampo de eletroforese
antes de carregar o gel.
Aps a eletroforese e transferncia na membrana de
Hybond-N
+
, os produtos de digesto parcial so revelados atravs
da sonda de um fragmento do DNA que reconhea ou o brao
direito do pYAC4 (fragmento PvuII/ SalI de 1.4 Kb proveniente da
digesto do plasmdio pBR322) ou o brao esquerdo do pYAC4
(fragmento PvuII/ EcoRV de 2,3 Kb proveniente da digesto do
plasmdio pBR322). Os fragmentos provenientes da digesto
total so revelados com o DNA genmico de camundongos ou
o DNA Cot-1 (Life Technologies).
Preparao do DNA genmico a partir do BAC
A preparao do DNA genmico a partir do BAC
idntica a uma miniprep de DNA a partir das bactrias. As
clulas cultivadas durante toda a noite a 37C no meio LB +
cloramfenicol so centrifugadas por 30 minutos (1,5 ml de
clulas). O meio descartado e o pellet ressuspendido em 100
l da soluo I (50 mM glucose; 20 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM
EDTA pH 8). Os tubos so, ento, colocados no gelo e a eles
so acrescentados 200 l da soluo II (0,2 N NaOH; 1% SDS),
agitando-os de 7 a 9 vezes, quando so recolocados no gelo.
82
Acrescentam-se, em seguida, 150 l da soluo III (acetado de
potssio 3 M pH 4,8) e os tubos so agitados novamente. Segue-
se uma centrifugao temperatura ambiente durante 1 minuto
e o sobrenadante transferido para um novo tubo. Segue-se
uma precipitao com etanol. Os pellets so ressuspendidos em
20 l de TE e so pegos 5 l para a digesto enzimtica.
A migrao em campo pulsado foi feita durante 18
horas. A durao das pulsaes foi estabelecida em 5 segundos
durantes 6 horas no comeo; em seguida, ela passou a 10
segundos durantes 6 horas e, nalmente, 15 segundos durantes
6 horas. Para essa migrao utilizou-se um gel de agarose 1% e
0,5 x TBE a 14C.
Isolamento e caracterizao das seqncias codifcadoras
RT-PCR
O RNA total foi extrado utilizando-se o mtodo de uma
nica etapa descrito por Chomcznski e Sacchi (1987) e adaptado
pela Biolabs.
As reaes de RT-PCR foram realizadas essencialmente
como descritas por Kawasaki e outros (1990). Dois mg de
RNA total foram tratados com uma unidade de DNAseI (Life
Technologies) durante 30 minutos temperatura ambiente. A
reao foi parada acrescentando-se ao tubo 2 mM de EDTA e
incubado durante 10 minutos a 65C. Essa tcnica tambm pode
ser iniciada utilizando-se 200 ng de RNA poly(A+), o que evita
o tratamento posterior com a RNAse. A primeira ta de cDNA
sintetizada atravs da transcriptase reversa Superscript II (Life
Technologies): 200 unidades de Superscript so colocadas ao
RNA na presena de 10 picomoles de hexmeros aleatrios e 10
picomoles de cada dNTPs. A reao de transcrio realizada a
37C (ou 42C) durante 30 minutos num volume nal de 20 l.
Dois l da reao so utilizados para a amplicao pela PCR
com iniciadores especcos do lcus estudado. Toda reao de
transcrio reversa do RNA deve ter uma reao de PCR controle
que no contenha a RT-PCR. Os produtos de amplicao so
83
revelados pela hibridizao atravs de uma sonda especca,
aps migrao em gel de agarose e transferncia em membrana
de nylon Hynbond-N+.
Amplifcao dos xons
O princpio da captura dos xons foi apresentado na
introduo e pode ser visualizado na Figura 38.
O vetor pSPL3
O vetor de expresso pSPL3 (Figura 39) contm uma origem
de replicao para a bactria E. coli, um gene de resistncia
a ampicilina e um segmento do vrus SV40 para replicao e
transcrio das clulas eucariotas COS-7. Um stio de clonagem
mltipla foi inserido no ntron do gene Tat do HIV. Esse ntron
est cercado pelos stios doador e aceptor de emenda. Esse
conjunto, por sua vez, est cercado das seqncias exnicas do
gene Tat e do gene da -globina.
Um dos inconvenientes desse vetor a presena de
um stio crtico de splicing. Caso ocorra um processamento
dos ntrons atravs deste stio, o resultado ser um xon dito
quimrico.
Os produtos dos processamentos das seqncias do
vetor sozinho, das seqncias desprovidas de xon genmico
e tambm daquelas provenientes do processamento quimrico,
podem ser eliminados atravs de uma digesto enzimtica.
Para a clonagem no vetor pSPL3, o DNA do BAC
digerido pela enzima de restrio BamHI e BglIII (ou somente
BamHI) e ligado ao vetor que foi igualmente digerido por BamHI
e desfosforilado. Um controle realizado ligando-se o vetor a
ele mesmo, sem inserto. Aps eletroporao, 100 l da reao
so semeados no meio de cultura LBA, o restante da soluo de
clonagem utilizado na cultura lquida. Avaliamos a qualidade
da clonagem comparando a ecincia, ou seja, o nmero de
colnias obtidas entre a clonagem-teste e o controle. Uma
84
clonagem considerada eciente quando o nmero de colnias
obtidas na clonagem-teste 10 vezes superior ao do controle.
Transfeco das clulas COS-7
As clulas COS-7 so originadas dos rins de um macaco
verde, as quais foram transformadas, por derivado do SV40
defeituosos, no stio correspondente origem de replicao.
Essas clulas assim modicadas permitem a replicao ativa do
vetor que, como o pSPL3, contm as seqncias ARS do SV40
ausentes nas clulas hospedeiras.
Para tanto, 1l do DNA plasmidiano transferido para
as clulas COS-7 atravs do mtodo de lipotransfeco, de
acordo com o protocolo da empresa (reativo Lipofectase, Life
Technologies). Observamos que qualquer contaminao das
clulas COS por micoplasmas responsvel pela perda total
do experimento. Dessa forma, de suma importncia que seja
vericado regularmente se essas clulas no esto contaminadas
pelos micoplasmas. Para tanto, o kit comercial Mycoplame PCR
Primer Set (Stratagene) permite o controle delas via PCR.
Isolamento do RNA citoplasmtico
O RNA citoplasmtico isolado 48 a 72 horas aps a
transfeco pelo mtodo de extrao utilizando o agente qumico
tiocianato de guanidina e fenol-clorofrmio (CHOMCZYNSKI;
SACCHI, 1987).
Amplifcao e clonagem dos xons capturados
Os RNA produzidos pela transcrio do vetor pSPL3
podem ser amplicados pelos iniciadores especcos do vetor
(SA2, SD6, dUSD2 e dUSA4, Figura 39). As seqncias de cada
um deles so as seguintes:
SA2: ATCTCAGTGGTATTTGTGATC
(complementar s bases 3245 a 3275 do vetor pSPL3)
85
SD6: TCTGAGTCACCTGGACCACC
dUSD2:
CUACUACUACUAGTGAACCTGCACTGTTGACAAGCT
dUSA4:
CUACUACUACUACACCTGAGGAGTGAATTGGTCG
A sntese da primeira ta de cDNA realizada utilizando-se
o iniciador SA2. Aps tratamento da ta de RNA com RNAaseH,
a ta simples de DNA convertida em dupla por um pequeno
nmero de ciclos de PCR atravs dos iniciadores SA2 e SD6.
Para serem eliminados os produtos oriundos do processamento
somente do vetor ou os produtos falsos positivos (processamento
quimrico), necessrio proceder a uma digesto completa
com a enzima BstXI. Nessa etapa, a qualidade da enzima
fundamental para a ecincia do experimento. Uma parte do
produto de digesto , em seguida, utilizado numa segunda
amplicao pela PCR com os iniciadores internos dUSD2 e
dUSA4, que contm dUMP, para posterior clonagem no vetor
pAMP10 (Life Technologies), o qual permite a clonagem dos
produtos de PCR sem passar pela etapa de puricao. Se os
clones obtidos possuem insertos maiores que 177 pb, o que
corresponde distncia entre os iniciadores dUSD2 e dUSA4,
eles possuem a priori um xon. Freqentemente observamos a
produo de clones contendo fragmentos do vetor (seqncias
do HIV e globina), talvez em razo do stio crtico presente no
vetor pSPL3. Por isso, antes de se proceder ao estudo dos xons
amplicados, uma sondagem atravs de hibridizao com sondas
de fragmentos de HIV e do vetor pSPL3 realizada nos xons
obtidos. Aqueles que reagirem positivamente hibridizao so
eliminados.
86
Sequenciamento
Mtodos
As reaes de seqenciamento foram realizadas de
acordo com o mtodo de Sanger, atravs do kit comercial
Sequenase II (USB), para um seqenciamento manual.
Anlise das seqncias
As seqncias obtidas foram introduzidas num programa
chamado Genework. Cada seqncia foi comparada s j
existentes no banco de dados via BLAST, acessvel por email no
National Center for Biological Information, NCBI (blast@ncbi.
nlm.nih.gov). Algumas das seqncias tambm foram analisadas
com o programa GRAIL, tambm acessvel pela Internet, que
prediz a existncia de seqncias codicadoras.
87
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107
Anexos
ANEXO I- FIGURAS
Clonagem pela Funo
Clonagem Posicional
Doena Doena
Mapeamento Mapeamento
Funo Funo
Gene Gene
Figura 1: As estratgias da clonagem
Ilustrao das duas estratgias de que dispomos para conhecer a funo
de um gene qualquer.
Para voltar leitura, clique sobre a figura.
108
Anexos
Figura 2: Mutao alcaptonria (aku).
A urina do animal doente torna-se escura aps o contato com o ar aps
o processo de oxidao. Na foto, o animal afetado est direita; e es-
querda, o normal.
109
Anexos
Figura 3: Animal modelo da fenilcetonria (PKU) humana.
Os camundongos pertencem mesma linhagem (BTRB). A despigmenta-
o observada no animal de cor marrom ( direita) um componente da
sndrome da feniltonria.
110
Anexos
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Humans
Mice
Xenopus
D.
Melagonaster
C. elegans
myr bp
Figura 4: Relaes evolutivas entre os modelos mais utilizados em labo-
ratrio.
Os tempos aproximados em divergncias evolutivas entre organismos
citados e seus ancestrais comuns esto indicados ao longo de uma linha do
tempo, numa escala de milhes de anos (SIILVER, 1995).
111
Anexos
X
Y
XY
X; Y
UN
MT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X Y XY UN MT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Total Orthologies: 10137
Total mapped in booth species: 9677
mouse, laboratory
mouse, laboratory
h
u
m
a
n
h
u
m
a
n
1 1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1 1
1
1
1 1
1
1
1
1 1
1 1
1 1
1 1
1 1
1
1
1
1 1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
274 3 282 355 10 4 18 12 2 15 58
249 124
32 81 2 41
41
41
50
2
62 5
5
39
79 76 191 54 135
37
20
12
7
3
11
28
6
25
11
13
12
8
21
32
16
12
16
20
20
14
11
23
2
2
2
2 2
2
2
2 2 3
3
3
3
3
3
3
3
3 4
4
7
5
5
8
10
10
10
10
257
9
79
80
13 11
21 29 111 45
92 20 34
275
98
37 76
45
370
16 104
96 205
128
207
579
82
99
106
48 60
15 19 36
36
43
132
148
157
158
44
105
140
205 72
45
127
34 34
19
140
12 50
59 112
195 171
79
33 15
248
44 134
112
159 107
118 33
61 211 104
18
22
Figura 5: Oxford Grid.
Cada clula representa uma comparao entre dois cromossomos um do
camundongo e outros do homem. O nmero de ortologias aparece entre
cada clula (Cinza 1; Azul 2-10; Verde 11-25; Alaranjado 26-50; Amarelo 50
ou mais). FONTE: MGI ( www.informatics.jax).
112
Anexos
Figura 6: A mutao pmn
A fraqueza dos animais pmn ( direita na foto) caracteriza-se pela incapaci-
dade de esticar os membros posteriores quando so erguidos pela cauda.
113
Anexos
a b
c
d
A
A
Figura 7: Cortes histolgicos.
(a) Corte do msculo sleo de um animal homozigoto com quatro sema-
nas, j apresentando uma atrofia neural. A largura das fibras normal. (b)
(c) so terminaes nervosas do mesmo msculo. O axnio terminal (A)
apresenta-se inchado e no possui vesculas sinpticas (b), ou estas esto
diminudas (c). (d) Corte longitudinal de um nervo plantar de um camun-
dongo mutante de cinco semanas. As mielinas restantes tm formato
redondo ou oval, indicando um processo de degenerao axonal. Barras:
50mm (a, d) e 1mm (b, c) .
114
Anexos
b a
Figura 8: Nervo frnico.
Corte do nervo frnico de um animal normal (a) e de um animal mutante,
ambos com quatro semanas. Pode-se notar uma abundante perda dos
axnios mielinisados.
115
Anexos
Figura 9: Fentipo obeso.
O animal na parte superior da foto obeso, conferido por uma mutao
espontnea no gene da leptina. A leptina (Lep) uma protena envolvida
na regulao dos lipdeos. Ela est presente predominantemente nos
tecidos adiposos. Nos camundongos homozigotos para mutao obese,
o gene Lep est mutado e a leptina est ausente. Esses animais ingerem
uma quantidade excessiva de alimentos (hiperfagia) e possuem diabete,
intolerncia glicose e uma concentrao de insulina plasmtica elevada.
116
Anexos
10 Mb (5-10 c M) A
A
B
B
C
D
100 Kb
10 Kb
...TAGCTGCTAGCTA...
...TAGCTGGTAGCTA...
x
o
n
n
t
r
o
n
Figura 10: Principio da clonagem posicional.
O esquema acima representa uma clonagem, utilizando-se os clones do
tipo YAC (Yeast Artificial Chromosome). O mesmo pode ser feito com os
BAC (Bacterian Artificial Chromosome). Nesse esquema, a mutao que le-
vou ao aparecimento do fentipo anormal uma transio de uma citosina
para uma timina, o que causou a troca de um aminocido leucina por um
cdon de parada, caracterstico de uma mutao de sentido trocado.
117
Anexos
Camundongo A
Linhagem BLACK
X
X
X
Camundongo B
Linhagem WHITE
F1 Hbrido
Retrocruzamento Intercruzamento
N2
F2
Figura 11: Tipos de cruzamentos utilizados nos projetos de mapeamento.
O intercruzamento, utilizado em mapeamentos de mutaes recessivas,
produz dois cromossomos informativos (resultantes dos eventos de
recombinao para cada indivduo Fl do casal estabelecido). O retrocru-
zamento pode ser utilizado, tanto para o mapeamento de mutaes ou
traos recessivos como de dominantes; o que varia o parental utilizado
no cruzamento com Fl. Nesse tipo de esquema, produzido apenas um
cromossomo informativo (resultante dos eventos de recombinao do
indivduo Fl utilizado).
118
Anexos
retrocruzamento
X
locus 1
n
N
m
+
locus 2
r
n m r
n
n
m r
n m
m
n
m
r
n m r
R
anlise de 1000 descendentes
gamentas do heterozigoto
hapltipos no
informativos
hapltipos informativos
N +
R
N
N
N
+
+
+
R
R
R
R
R
locus 1 mutao locus 2
descendentes
fenotipagem
[+]
[+]
[m]
[m]
[+]
[+]
[m]
[m]
gentipos para os
dois marcadores
N/n
R/r
n/n
r/r
N/n
N/n
N/n
R/r
R/r
R/r
n/n
n/n
n/n
r/r
r/r
r/r
animais no
informativos
animais
informativos
(genotipados
com outros
marcadores)
Figura 12: Estratgias do mapeamento.
Identificao dos animais informativos para refinar a localizao da muta-
o (no caso de um retrocruzamento).
119
Anexos
5 4 3 2 1
domesticus
musculus
molossinus
castaneus
bacterianus
M
u
s

m
u
s
c
u
l
o
s
spretus
spicilegus
macedonicus
fragilicauda
famulus
caroll
cooki
cervicolor
dunni
Pyromys
Coelomys
Nannomys
S
u
b
g
e
n
u
s

M
u
s
O
t
h
e
r

s
u
b
g
e
n
e
r
a
TRENDS in Genetcs
Figura 13: rvore filogentica da ordem muridae.
Por meio da anlise de dados moleculares coletados a partir da comparao
das seqncias de DNA mitocondrial e genmico, ns podemos reconhecer
vrias espcies diferentes de camundongos pertencentes ao gnero Mus.
FONTE: Gunet et Bonhomme, Trends in genetics, vol. 19, pp. 20-31, 2003.
120
Anexos
Alelo 1 Alelo 2
R1 R1 R2 R3 R3
sonda sonda
linhagem 1 linhagem 2
locus A locus A
Figura 14: Ilustrao do principio de RFLP (Polimorfismo de Comprimento
de Fragmentos de Restrio.
121
Anexos
Alelos
#1
#2
#3
CACACACACACACA
CACACACACACACACACACACA
CACACACACACACACACA
Gentipos
1/1 2/2 3/3 1/2 1/3 2/3
Figura 15: Meios microssatlites e sua deteco.
Trs alelos diferentes de um locus microssatlite composto de repeties
CA. As setas representam os iniciadores locus especfico utilizados na am-
plificao. No esquema que se segue est representado um gel de eletro-
forese com os padres que seriam observados para os diferentes alelos.
122
Anexos
DNA fita dupla
CGTAGCTGATCGATGC
GCATCGACTAGCTACG
CGTAGCTGGTCGATGC
GCATCGACCAGCTACG
Fita 1
Fita 2
Amostra A
Fita 1
Fita 2
Amostra B
Corrida no gel
Amostra A Amostra B
Sentido da
migrao do
DNA
Desnaturao
e
Resfriamento
Figura 16: SSCP - Alelos e sua deteco.
A conformao tridimensional assumida pela fita simples de DNA aps
resfriamento interfere diretamente na velocidade de migrao no gel. A
conformao dependente da seqncia que a fita apresenta. Sendo as-
sim, seqncias diferentes (mesmo em apenas uma base) tero diferentes
velocidades de migrao. Neste esquema esto ilustradas duas amostras
com uma base de diferena em suas seqncias; aps desnaturao e
resfriamento a conformao que cada fita assume; em seguida um gel
revelando o polimorfismo existente
123
Anexos
Figura 17: Mapa comparativo das regies de ortologia entre o cromos-
somo 13 murino ( direita) e os segmentos cromossmicos 1, 3, 5, 6, 7, 9
e 10 humanos.
Os histogramas representados do lado direito do cromossomo 13 murino
correspondem aos cromossomos humanos homlogos. O nmero de cada
cromossomo est indicado acima do histograma. O tamanho de cada uma
das barras posicionadas nos histogramas indica o nmero de genes ortlo-
gos entre o homem e o camundongo localizados naquela regio. Fonte:
www.informatics.jax.org.
Cr. 13
7
9
6
1
10
3
5
1
0

c
M
124
Anexos
Vetor pYAC
TEL TEL
Stio de clonagem
O vetor digerido de
tal forma que libere os
dois braos
Brao esquerdo
Tranformao de esferoplastos e
propagao na Saccharomyces cerevisiae
Ligao
Brao direito
TEL TEL
Digesto parcial
(produo de fragmentos
de vrias centenas de Kb
DNA genmico
TRP
ARS
CEN
URA
Figura 18: Princpio da clonagem em YAC.
O vetor de clonagem (pYAC) digerido de maneira a produzir dois braos.
O brao esquerdo contm a regio denominada ARS (origem de replicao
autnoma), um centrmero (CEN), uma seqncia que permite a formao
de um telmero funcional in vivo (TEL) e um marcador de seleo (TRP). O
brao direito contm a seqncia TEL e um segundo marcador de seleo
(URA). A ligao desses braos a grandes fragmentos de DNA genmico
(humano, animal, etc) obtidos pela digesto parcial conduz formao do
cromossomo artificial de levedura (YAC), o qual introduzido dentro do
organismo Saccharomyces cerevisiae. Nele, o YAC capaz de se replicar
(graas seqncia ARS), de estabilizar sua extremidades (graas s se-
qncias TEL) e de se repartir de maneira correta entre as clulas filhas no
momento da diviso celular (graas s seqncias CEN).
125
Anexos
Hind III
Bam HI
Xmal, Smal,
Notl, Bgll, Sfil
Nat I Eag I
Sacl
Sacl
Sal I Sal I
pBAC108L
C
M
R
p
a
r
B
p
a
r
A
repE
o
r
i
S
loxP
cosN
promotor T7 promotor Sp6
Figura 19: Construo do vetor BAC.
O vetor BAC um derivado do epsomo F e possui os genes oriS e repE
que regulam a replicao e os genes parA e parB que controlam o
nmero de cpias do plasmdio ( uma ou duas) na bactria. CMR o gene
de resistncia ao antibitico cloramfenicol. No sitio de clonagem, o vetor
BAC possui: (i) os stios cosN e loxP do bacterifago lambda e (ii) dois
stios de clonagem (HindIII e BamHI). As seqncias dos promotores T7 e
SP6 servem para o seqenciamento da poro de DNA inserida na juno
vetor- inserto.
126
Anexos
DNA genmico de alto
peso molecular
Digesto e fragmentao de
grandes fragmentos de DNA
(vrias centenas de Kb)
Ligao na presena de um
marcador de seleo e em
baixa concentrao de DNA
Circularizao dos fragmentos de DNA
Digesto
Fragmento de juno
Clonagem dos fragmentos de DNA no vetor
adequado, por exemplo, um bacterifago
Banco de fragmentos de jumping
Sondagem de uma biblioteca atravs do
Figura 20: Ilustrao da tcnica do salto no cromossomo.
O DNA genmico digerido e os produtos so ligados na presena de um
marcador de seleo por exemplo, o gene supF cuja presena deste
marcador permite selecionar os clones de juno (aqueles que contm
os fragmentos de DNA que normalmente estariam distantes um do outro
no genoma de origem). As molculas de DNA circular so, em seguida,
digeridas por uma endonuclease compatvel com a clonagem em um vetor
adequado. A maior parte das molculas obtidas correspondem ao DNA
contguo e apenas uma pequena poro de fragmentos pertencem ao DNA
de juno. Uma biblioteca ento construda, utilizando, por exemplo, um
bacterifago. O fago s poder se propagar se tiver o marcador de seleo
supF. Isso quer dizer que apenas os clones que contm o fragmento de
juno estaro presentes na biblioteca. Um fragmento de DNA pode ser
isolado pela sondagem da biblioteca por meio de uma sonda de DNA,
mesmo localizado a vrias dezenas ou centenas de Kb daquela sonda.
127
Anexos
contig n
BAC n1
BAC n2
BAC n3
marcha sobre
o cromossomo
contig n contig n+1
contig n+1
DNA cromossmico
intervalo entre dois
contigs est definido
seqenciamento da extremidade do BACn1
definio de uma STS
Busca de novo BAC portando tal STS (sondagem de biblioteca)
seqenciamento da extremidade do BACn2
definio de uma STS
sondagem de biblioteca
Figura 21: A marcha sobre o cromossomo.
O sequenciamento da extremidade do BAC n 1 fornece uma sequncia
nica amplificada pela PCR (STS). Um BAC portador desta sequncia
procurado numa biblioteca genmica. Este BAC permite aumentar a regio
clonada. Pode-se igualmente utilizar a outra extremidade do BAC n 1 para
marchar sobre o cromossomo para o outro lado.
128
Anexos
mRNA
cDNA
PCR
PCR
Retrotranscrio
Extrao do RNA citoplasmtico
Transfeco dos mRNA
Emenda
Tranfeco em clular de mamferos
xon xon ntron
SA
SA
SD
SD
Vetor de expresso
stio de poliadenilao
Fragmento genmico contendo um xon
AAAAAAAAAAA
= xon cerdado pelas
seqncias do vetor
Figura 22: Princpio da amplificao dos xons internos ou xon-
Trapping.
Os genes, nos organismos eucariotos, apresentam-se em forma de mo-
saicos, em que as seqncias codificantes (xons) so interrompidos por
seqncias no codificantes (ntrons). Os ntrons so transcritos antes
de serem eliminados num processo denominado de emenda (splicing).
Quatro seqncias de DNA tm papel importante nesse processo: o stio
129
Anexos
doador de emenda (SD) em 5 do ntron, o stio aceptor de emenda (SA)
em 3 do ntron, o stio de juno e uma regio de resduos pirimidinas.
Na amplificao do xon, o DNA genmico a ser analisado clonado num
vetor de expresso. O stio de clonagem est localizado dentro de um
ntron de um dado gene e , portanto, enquadrado pelos stios doador e
aceptor de emenda. Em seguida, a construo colocada para propagao
dentro da bactria E. coli. O DNA ento isolado e transfectado nas clulas
eucariotas. Caso o DNA analisado contenha um xon e que este tenha sido
inserido na orientao correta, ou seja, de 5 para 3, ocorrer emenda
entre as seqncias do vetor e do inserto. O produto final dessa emenda
ser um RNAm quimrico que possui a seqncia do xon do DNA testado,
enquadrado pela seqncias dos xons do vetor. Tais molculas de RNA
so extradas e convertidas em cDNA pelo mtodo de RT-PCR (retrotran-
scrio). As molculas de cDNA so, ento, amplificadas pela PCR atravs
dos oligonucleotdios especficos do vetor. Caso o produto de amplificao
seja maior em pb que a distncia que separa os oligonucleotdios no vetor,
um forte indicativo de que um xon foi clonado.
130
Anexos
Digesto do DNA genmico (YAC, ...)
+ adaptador
+ iniciador biotinilado
PRC
Hibridizao em meio lquido
Captura do hbrido sobre as
bilhas de estreptavidina
bilha magntica
+ estreptavidina
Educao do
cDNA
Amplificao
Clonagem
Biblioteca de DNA
Figura 23: Captura de cDNA por afinidade
O DNA genmico digerido e ligado aos adaptadores. A construo en-
to amplificada atravs de oligonucleotdios biotinilados e especficos dos
adaptadores. O DNA amplificado , em seguida, hibridizado, em condio
de alta estringncia, a molculas de cDNA. Os hbridos cDNA-DNA genmico
biotinilado so recuperados por meio de bilhas magnticas cobertas de es-
treptavidina. Os cDNA no especficos so eliminados por meio de lavagem.
Os cDNA especficos restantes so eludados, amplificados e clonados.
131
Anexos
3 RACE
5 RACE
mRNA
Adaptador
cDNA
GSP1
GSP2
AAAAAAAAAAAAAAAAA3
AAAAAAA3
TTTTTTT
TTTTTTT
TTTTTTT
TTTTTTT
Iniciador
complementar
ao adaptador
Iniciador
complementar
ao adaptador
5
mRNA
5
GSP
GSP
GSP
GSP
cDNA
Acrscimo de uma
cauda poli (dC)
(dC)n
CCCCCCCCCC
(dC)n
CCCCCCCCCC
GGGGG
(dG)n
Figura 24: Principio da RACE.
Para obter as extremidades 3 (3RACE), o RNA retrotranscrito
atravs de um oligonucleotdio constitudo de resduos dT e de uma
seqncia adaptadora. As amplificaes so realizadas atravs de
um oligonucleotdio derivado do gene de interesse (GSP1, GSP =
gene specific primer) e de um outro complementar ao adaptador.
Uma segunda amplificao realizada com oligonucleotdios espec-
ficos internos (GSP2) e aquele complementar seqncia adaptadora.
Utilizando-se a mesma estratgia, pode-se obter a extremidade 5 (5RACE).
A retrotranscrio feita atravs de um GSP. Uma cauda poli(C) acres-
centada ao cDNA fita simples. A amplificao realizada por meio de um
oligonucleotdio poli(G) e de um outro especfico GSP1. Uma segunda
amplificao , ento, realizada com um oligonucleotdio complementar
ao adaptador e um outro especfico mais interno.
132
Anexos
Fentipo
Genotipagem
~20 animais afetados
~80 marcadores
Cromossomos
Mapeamentos alta
resoluo
100-1000 meioses
SSLPs/SNPs
Intervalo com o Gene
Candidato
Sequenciamento
Mutao
Marcadores Mb
A
B
C
D
E
F
G
H
Afetado
No Afetado
Linhagem 1 Linhagem 2
35,410,613
35,426,474
36,034,000
36,149,287
37,125,950
37,963,422
38,061,429
38,079,638
438 2 1 1 2
73 2 2
A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1D2 D3 E F1 F2
Figura 25: Identificao da mutao.
Assim que uma mutao isolada (parte de cima da figura, aqui repre-
sentada por um fentipo afetando a colorao da pelagem), os estudos
genticos comeam atravs de cruzamentos que gerem recombinantes
que serviro na genotipagem. A genotipagem realizada atravs de
marcadores moleculares polimrficos entre as duas linhagens utilizadas no
cruzamento. Geralmente estes marcadores so os microssatlites (SSLPs)
ou SNPs. Este processo leva a identificao do cromossomo portador do
lcus mutado (o esquema apresentado meramente ilustrativo), geral-
mente determinado num intervalo candidato entre 10 20Mb (Mega pares
133
Anexos
de bases). O passo seguinte refinar a regio candidata mapeada atravs
do mapeamento lata resoluo. Para tanto, preciso aumentar o nmero
de meioses analisadas, este nmero pode variar dependendo do nmero
de marcadores polimrficos disponveis na regio e da densidade gnica
(de 100 a 1000 meioses). Ao final, o intervalo candidato delimitado ficar
entre 1-2 Mb. No exemplo da figura, a mutao recessiva induzida na linha-
gem C57BL/6 foi mapeada alta resoluo usando animais cruzados com a
linhagem 129SvEv. Aqui, 529 animais foram genotipados com 8 marcadores
distribudos ao longo dos 4,6 Mb que compem a regio candidata e 10 re-
combinantes foram encontrados. Estes animais ou meioses recombinantes
possibilitaram redefinir a regio, a qual foi reduzida para 1,8 Mb. Nesta
altura do trabalho, o sequenciamento dos genes candidatos posicionais
pode comear, aqui a mutao apresentada a transverso da citosina (C)
para a guanina (G).
134
Anexos
Marcadores Hapltipos
D13Mit80
D13Mit215
pmn
D13Mit115
D13Mit3
D13Mit16
D13Mit61
D13Mit154t
Nmeros 46 2 1 1 1 2 6 4
Figura 26: Hapltipo.
O esquema representa os hapltipos dos animais obtidos a partir do
retrocruzamento interespecifico entre a linhagem da espcie Mus spretus
e a linhagem de laboratrio, na qual o alelo pmn est segregando. Os
DNA desses 63 animais N2 pmn/pmn foram tipados com os marcadores
do tipo microssatlite. Os retngulos brancos indicam que o marcador
homozigoto para o alelo Mus musculus domesticus (alelo de laboratrio
originrio do alelo pmn). Os retngulos pretos indicam que o hapltipo
heterozigoto para os alelos Mus spretus e Mus musculus domesticus.
O nmero embaixo de cada coluna representa o nmero total de animais
por hapltipo. O resultado mostra que o lcus pmn se encontra entre os
marcadores D13Mit215 e D13Mit115.
135
Anexos
X
X
Xt + / + +
Xt + / + pmn Xt + / + pmn
+ + / + pmn
[Xt] [pmn] [Xt pmn] [+]
430 211 0 0
F2
F1
P
Nmero
de animais
Figura 27: Cruzamento intra-especifico.
Ns obtivemos 641 animais provenientes do intercruzamento Xt +/ + pmn,
o que representa 1.282 meioses. Nenhum recombinante foi encontrado.
Esses resultados indicam que o lcus pmn encontra-se a uma distncia
compreendida entre O a 1 cM do lcus Xt, com risco de 5% e a uma distncia
de O a 1,5cM com risco de 1%. O mesmo tipo de cruzamento foi realizado
entre pmn e pe. Ns obtivemos 116 (232 meioses) animais, a partir do
intercruzamento de animais pe +I + pmn, e encontramos 6 recombinantes
pe pmn/pe pmn. Esse resultado coloca pmn a, aproximadamente, 4 3 cM
do lcus pe.
136
Anexos
Figura 28: Mutao Extra-toe e o estoque balanceado.
Os animais mutantes (+/Xt) representados esquerda na figura, apresen-
tam um dedo extranumrico visvel na pata posterior, porm ausente na
pata posterior do animal pmn/pmn ( direita). A presena desse marcador
permite identificar os animais homozigotos pmn/pmn desde o nascimento,
pois estes no possuem o dedo extranumrico e tambm permite elimi-
nar os animais que no so portadores do alelo pmn, pois, nesse caso, a
condio Xt/Xt letal in utero. O estoque balanceado Xt +1 + pmn de
grande importncia, pois permite o reconhecimento precoce dos animais
que se tornaro doentes.
137
Anexos
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
D13Mi158
D13Mi80
D13Mit173
D13Mit162
D13Mit207
D13Mit57
D13Mit174
D13Mit206
D13Mit218
D13Mit56
D13Mit215
D13Mit
Gli20
D13Mit305
D13Mit115
D13Mit17
D13Mit3
D13Mit133
D13Mit16
D13Mit154
D13Mit81
D13Mit61
D13Mit10
Msx2
D13Mit13
D13Mit21
S3S5.ex2
Cf2R
D13Mit28
D13Mit47
D13Mit32
Cr. 13
Figura 29: Localizao precisa dos marcadores microssatlites no cromos-
somo 13 murino.
Esse mapa foi estabelecido, utilizando-se a coleo de DNA do EUCIB. Os
genes G1i20 (BRUNIALTI et al., 1995), Msx-2 (ROBERT; BRUNIALTI, 1995),
Cf2r (POIRIER et al., 1996) e Smn (S3S5.ex2) (VIOLLET et al., 1997) tambm
foram localizados nesse mapa.
138
Anexos
Xt
D13Mit80
D13Mit173
D13Mit154
Gli3
D13Mit3
D13Mit16
D13Mit154
D13Mit218
D13Mit115
D13Mit133
(3,35 +/- 0,57 cM)
(0,8 +/- 0,28 cM)
(0,4 +/- 0,23 cM)
(1,32 +/- 0,36 cM)
(1,82 +/- 0,42 cM)
(2,43 +/- 0,48 cM)
1q
7p
Figura 30: Mapa gentico parcal da regio cromossmica de interesse.
Mapa gentico do cromossomo 13 (parcial) de camundongos indicando a
regio onde se encontra o gene pmn (retngulo pontilhado). Esse mapa foi
estabelecido, utilizando-se a coleo de DNA do EUCIB (N=982) e os mar-
cadores moleculares em torno do lcus G1/3. A localizao do lcus pmn
foi definida levando-se em conta os resultados apresentados nas figuras 26
e 27. Os retngulos esquerda da figura indicam as regies de homologia
entre o cromossomo 13 murino e os cromossomos 1 e 7 humanos.
139
Anexos
Y
1
3
.
1
1
5
Y
9
0
3
.
1
Y
9
0
2
.
2
AB1380
1
6
4
0

K
b
1
0
9
5

K
b
U
R
A
3
e
n
d
o
g
n
e
8
4
0

K
b
Y
1
3
.
1
1
5
Y
9
0
3
.
1
Y
9
0
2
.
2
AB1380
1
6
4
0
-
1
0
9
5
-
1
1
2
0
-
1
1
3
0

K
b
9
8
0
-
9
5
0

K
b
6
8
0

K
b
5
9
0

K
b
4
4
0

K
b
3
5
0

K
b
Figura 31: Anlise pela eletroforese em campo pulsado dos YAC Y902.2,
Y903.1 e Y13.115.
Quatro culturas independentes de cada clone foram analisadas. A eletro-
forese em campo pulsado foi realizada em agarose Seake GTG 1%; 0,5 X TBE,
a 190 volts. Os tempos dos pulsos so de 45 segundos durante 24 horas
(foto da esquerda). Aps transferncia para membrana de Nylon 1\1 pelo
mtodo de Southern blot, os cromossomos artificiais de levedura foram
revelados pela hibridizao de um fragmento do gene URA3 de levedura
(foto da direita). Essa sonda reconhece o gene endgeno e o gene pre-
sente no vetor YAC. AB1380 uma linhagem de levedura (Saccharomyces
cerevisiae).
140
Anexos
4
9
6
K
2

(
1
4
0

K
b
)
Y
1
3
.
3
0
5
.
2

(
1
2
5
0

K
b
)
1
2
P
1
1

(
1
0
0

K
b
)
2
8
3
E
2
0

(
1
6
0

K
b
)
3
8
8
A
1
1

(
1
4
0

K
b
)
Y
1
3
.
1
1
5
.
1

(
1
6
4
0

K
b
)
Y
.
1
3
.
2
1
5

(
1
2
0
0

K
b
)
Y
.
9
0
2
.
2

(
1
0
9
5

K
b
) Y
.
9
0
3
.
1

(
8
4
0

K
b
)
C
r
.
1
3
D
1
3
M
i
t
2
1
5
p
m
m
G
l
i
3
G
C
K
D
1
3
M
i
t
3
0
5
I
N
H
B
A
D
1
3
M
i
t
1
1
5
Figura 32: Organizao dos YAC.
Esta organizao contm os marcadores D13Mit215, D13Mit305 e
D13Mit115 e o gene Gli3 (sondas Glill e G1i20) na forma de um contig. Os
traos descontnuos correspondem s regies quimricas. Os BAC obtidos
a partir dos marcadores D13Mit215 (388A11), G1i20 (283E20), Glill (12P11)
e D13Mit115 (496K2) esto igualmente representados embaixo da figura.
Os marcadores GCK e INHBA so dois genes humanos que ns localizamos
pela PCR nos YAC.
141
Anexos
Y902.2
Y13.115
Y13.215
Y13.305
AB1380
Y903.1
Figura 33: Anlise por Southern blot da extremidade esquerda do clone
Y902.2.
Os cromossomos de levedura foram separados pela eletroforese em um gel
de agarose Seaken GTG 1%;0,5 X TBE a 9C, a 190 volts. Os tempos dos pulsos
foram de 45 segundos durante 24 horas. O DNA foi, ento, transferido e
fixado sobre uma membrana de nylon N+. A membrana foi hibridizada com
um fragmento de DNA marcado com radioatividade e que correspondia
extremidade esquerda do YAC Y902.2. Na figura, pode-se ver que esse frag-
mento est presente nos clones Y903.1, Y13.305.2 e reconhece tambm
o DNA do clone do qual foi isolado. AB1380 uma linhagem de levedura
(Saccharomyces cerevisiae).
142
Anexos
CpG
CpG
CpG
Gli3
I
D13Mit305
D
D
D
G
G
G
Y13.305.2
Y903.1
Y902.2
100 Kb
M M
M
M
NN N N
N
N N E
E
E E E E EE
B
B
S
S
R R R
R
R
Sa Sa
Figura 34: Mapa de restrio do contig de YAC que cobre a regio pmn.
D e G representam as extremidades direita (lado URA3 do vetor pYAC4) e
esquerda (lado TRP do vetor pYAC4), respectivamente. Os crculos cheios
correspondem s extremidades dos clones provenientes da regio pmn. Os
crculos vazios correspondem s extremidades quimricas (a extenso da
regio quimrica est representada pelas linhas pontilhadas). As ilhas CpG,
definidas pelo agrupamento de 3 ou mais enzimas de restrio que cortam
raramente o genoma, esto igualmente representadas. B: BssHII, E: Eagl,
M: Mlul, N: Notl, R: Nru, S: Sall, Sa: Sacll, SM: Smal.
143
Anexos
100 Kb
D
G
Y13.305.2
Y903.1
Y902.2
M M
M
M
NN N N
N
N N E
E
E E E E EE
B
B
S
S
R R R
R
R
Sa Sa
D G
283E20
12P11
496K2
D
G
E1
E2
CL9
CL14
CL30
CL34
Gli3
E13
CL10
CL20
D13Mit305
D13Mit115
E3
E11
E7 E10
Figura 35: Localizao dos xons e das ESTs.
Localizao dos fragmentos dos genes isolados pela tcnica da amplifica-
o dos xons internos (CL) e localizao das EST humanas (E) no mapa de
restrio do contig de YAC e BAC.
144
Anexos
E7 E2
Xt pmn Xt pmn + + B6 B6
H
2
O
H
2
O
M
220 pb 317 pb
Figura 36: Anlise pela PCR das EST humanas E7 (A006127) e E2
(WL9635).
O cDNA dos animais de fentipo Xt, pmn e selvagem (+) foram testados para
cada conjunto de oligonucleotdios. O DNA genmico da linhagem C57BL/6
e gua foram utilizados para o controle da amplificao. O DNA genmico
no foi amplificado com os oligonucleotdios provenientes da EST E7. Esse
resultado indica a existncia de seqncia intrnica entre os oligonucle-
otdios, o que, provavelmente, tornou a amplificao impossvel. J para
a EST E2, foi obtido um produto de amplificao para o DNA genmico,
indicando a inexistncia de um ntron entre os oligonucleotdios. No foi
encontrada diferena de tamanho do produto amplificado entre os animais
Xt, pmn e +. (M) Marcador de peso molecular 100pb Ladder (Pharmacia).
145
Anexos
E
E
E
E
T
T T
T
T
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
1
1
1
4
4
3
3
3
3
5
5
2
2
2
P
P P
P
P
E
E
E E
E
E
E
E
H
H H
H
H
Ligao Ligao
Ligao
Taql
Taql
EcoRl
EcoRl
Pstl
Hindlll
Hindlll Pstl
TEL TRP1 ARS1 CEN4 SUP4
Figura 37: Isolamento das extremidades do YAC atravs da PCR inversa.
O DNA do YAC foi digerido por uma enzima cujo stio de restrio est pre-
sente no vetor. O DNA digerido foi, em seguida, religado sobre si mesmo.
Entre as molculas circulares, algumas possuem um fragmento do vetor
flanqueando uma extremidade do YAC. Utiliza-se, em seguida, iniciadores
especficos do vetor para amplificar a extremidade do YAC.
146
Anexos
mRNA
cDNA
PCR
PCR
Retrotranscrio
Extrao do RNA citoplasmtico
Transfeco dos mRNA
Emenda
Tranfeco em clular de mamferos
xon xon ntron
SA
SA
SD
SD
Vetor de expresso
stio de poliadenilao
Fragmento genmico contendo um xon
AAAAAAAAAAA
= xon cerdado pelas
seqncias do vetor
Figura 38: Principio da amplificao dos xons internos ou xon-
Trapping.
Legenda detalhada na Figura 22.
147
Anexos
xon xon
5000
Eamll051l
4958
Bsa
4891
Fsp l
4738
Pvu l
4591
Bcg l
4436
BsaHl 4422
X mm l 4359
4000
Xcm l 3906
Apa l 3774
Hpa l 3395
SAv 3095
Msc l 3231
3000
EcoNl 2348
2000
Nhel 1976
Stio de clonagem mltipla
N de l 1119
1000
Blos l
862
Sal
687
689
SDv
Xba I 681
BsaA I IEco 721674
Esp I641
Avt II 324
Sfr I270
6000
on
Drd I 5743
Hae II 5607
BspH I 5131
Cfno I 4878
Bgl I 4839
Ap
BspH I 4123
Ban II 3774
Mun I 3406
Mam I 3494
Aval 3107
Hind III 2857
Dra III 2815
Mun I 2371
Mam I 2271
Ava I 1023
Cfno I 1157
Pvu III 1799
Stu I
1548
Dra III
1311
Ban II
1020
Acc I 687
Acc 485
Dsal IN oo I
491
H
in
d
III 3
4
0
Slu I321
Bgl I271
Dsa I IN co I
231
Sph I 140
Sph I 68
Pvu II 1
HaeII
5977
pSPL3
603 1 bp
Bstx I
Meio-stio
698
Sdv
Stio de
clonagem
Mltipla
Sdc
1134
Bstx I
Half-site
3095
Sav
3245-3265
Sa2
dUSA 4
3178-3199
1056
1009
dUSD 2
654-671
Sv40
P
607-626
Sd6
EcoR I
Bstx I
Sst I
Xho I Xma III Pst I
BanH I EcoR v
CCAGAATTCTGGAGCTCGAGCGGCCGCTGCAGGATCCCAGATATCTGG
Bstx I
Figura 39: O vetor de expresso pSPL3.
A parte superior do esquema representa os ntrons e xons do gene tat do
HIV-1, tendo nas bordas as seqncias exnicas da B-globina. P = promotor
SV40; SDv = stio doador de emenda; SDc = stio crptico de emenda; e SDa
= stio aceptor de emenda. Os oligonucleotdios utilizados na PCR tambm
esto indicados. A parte inferior da figura representa o mapa circular do
plasmdio.
Anexos
Doenas Humanas Mapeamento Referncia Modelo animal
(camundongo) ou
gene homlogo
Mapeamento Referncia
Musculatura
Miotroa espinal
distal
7p Hum. Mol. Genet.,
1995, 4:1629-32
Miotroa espinal
(Tipos 1, 2 e 3)
5q11-q13 Cell, 1995, 80:155-
165
Smn 13 Genomics, 1997,
Distroa muscular
(SCARMD)
17q12-q21.33 Cell, 1994, 78:10-20
Distroa muscular
congenital merosina
negativa
6q22-q23 Hum. Mol. Genet.,
1994, 3:1657-61
mutante distroa
muscular (dy)
10 J.Bio.Chem., 1994,
269:13729-32
Distroa muscular de
cinturas (LGMD2B)
2p Genomics, 1995,
27:192-95
Distroa muscular de
cinturas (LGMD2A)
15q15.1-q15.3 Cell, 1995, 81:1-20 calpana 3 (Canp3) 3 ou 4 Mamm. Genome,
1996, 7:377-379
Distroa muscular de
cinturas (LGMD1A)
5q Am.J.Hum. Genet.,
1992, 50: 1211
Distroa muscular
fcio-escpulo-
humeral
4q35 Lancet, 1990: 336-
365
Distroa muscular
culofaringeal
14q1 1.2-q13 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4: 429-434
Distroa muscular de
Duchenne
Xp21.2 Nature, 1992,
300:6971
muscular dystrophy
(mdx)
X EMBO J., 1988,
7:3017-3021
Miopatia distal
autossmica
dominante
14q Am.J.Hum. Genet.,
1995, 50:422-427
Sndrome de
Schwartz-Jampel
1p34-p36.1 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4:1633-36
Sistema nervoso
Adrenoleucodistroa Xq28 Nature, 1993:726-730 adenocortica lipid
depletion (ald)
1 Acta Pathol.
Microbiol. Scan.,
1963, 58:212-218
Ataxia cerebelosa
peridica familiar
19p13 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:1443-1449
Ataxia de Friedreich
com dt isolado em
vitamina E
8q Nature Genetics,
1995, 9:141-145
Ataxia espino-
cerebelosa
autossmica
dominante (SCA2)
12q23-24.1 Genomics, 1995,
25:433-435
Ataxia espino-
cerebelosa
autossmica
dominante (SCA3)
14q24.3-q32.2 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:193-201
Ataxia espino-
cerebelosa
autossmica
dominante (SCA5)
11cen Nature Genetics,
1994, 8:280-284
Ataxia espino-
cerebelosa com incio
na infncia (IOSCA)
10q23.3-q24.1 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:1088-1095
Ataxia espino-
cerebelosa do tipo I
(SCAI)
6p22-p23 Nature Genetics,
1993, 4:221
ScadI 13 Genomics, 1992,
12:818-821
Epilepsia noturna
frontal autossmica
dominante
20q13.2 Nature Genetics,
1995, 10:117-118
Acra4 2 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:289-293
Hidrocefalia ligada ao
cromossomo X
Xq28 HGM, 1991, 11,
Abstract:234
Doena de Alzheimer
familiar
1q31-42 Science, 1995,
269:970-977
camundongo
transgnico
Nature Genetics,
1995, 9:21-30
Doena de Alzheimer
precoce (locus AD3)
14q24.3-q32.2 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4:1355-1364
Doena de Charcot-
Marie-Tooth tipo 1A
17p11.2 HGM, 1991, 11,
Abstract:12
mutante trembler
(Tr)
11 PNAS, 1992,
89:4382-6
Doena de Charcot-
Marie-Tooth tipo 2
1p35-p36 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 57:853-858
Doena de Charcot-
Marie-Tooth tipo 4A
8q13-21.1 Mol.Genet., 1993,
2:1625-1628
Doena de Machado-
Joseph
14q24.3-q32.2 J.Med.Genet., 1995,
32:25-31
Malformaes
cavernosas do crebro
7q Genomics, 1995,
28:311-314
Neurobromatose do
tipo 2
22q12 Nature, 1993,
363:515-521
Neuropatia axonal
moto-sensorial
Xq24-q26 Genomics, 1995,
29:409-412
Paraplegia
espasmdica
familiar autossmica
dominante
14q Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:183-187
Retardo mental ligado
ao X
Xp22 Am.J.Hum.Genet.,
1994: 581-585
Esclerose lateral
miotrca juvenil
recessiva
2q33-q35 Nature Genetics,
1994, 7:425-428
Sndroeme de Cohen 8q Nature Genetics,
1994, 7:201-204
Sndroeme de
Kallmann
Xp22.3 Cell, 1991, 67:423-
435
Sndrome do X frgil Xq27-q28 Am.J.Hum.Genet.,
1991, 38:336-342
camundongo
transgnico (Fmr-1)
X Genomics, 1992,
12:818-821
Tabela 1.
ANEXO II- TABELAS
Para voltar leitura, clique sobre a tabela.
Anexos
Mutao Smbolo Cromossomo Modo de transmisso
arrested development of righting response adr 14 recessiva
agitans ag 18 recessiva
ataxia ax 18 recessiva
bouncy bc 18 recessiva
cribriform degeneration cri 4 recessiva
dystonia musculorum dt 1 recessiva
ducky du 9 recessiva
dystrophia muscularis dy 10 recessiva
gracile axonal dystrophy gad 5 recessiva
gray tremor gt 5 recessiva
hotffot ho 6 recessiva
jimpy jp X recessiva
jittery ji 10 recessiva
lethargic lh 2 recessiva
lumbosacral neuroaxonal dystrophy lnd 7 recessiva
Lurcher Lc 6 semidominante
motor neuron degeneration mnd 8 recessiva
motor neuron degeneration 2 mnd2 6 recessiva
motor end plate desease med 15 recessiva
muscle decient mdf 19 recessiva
muscular dystrophy with myositis mdm 2 recessiva
X-linked muscular dystrophy mdx X recessiva
myodystrophy myd (fg) 8 recessiva
opisthotonos opt 6 recessiva
progressive motor neuronopathy pmn 13 recessiva
quaking qk 17 recessiva
quivering qv 7 recessiva
shiverer shi 18 recessiva
spastic spa 3 recessiva
staggerer sg 9 recessiva
swaying sw 15 recessiva
tipsy ti 11 recessiva
tippy tip 9 recessiva
tottering tg 8 recessiva
Trembler Tr 11 recessiva
Trembly-like Tyl X semidominante
twitcher twi 12 recessiva
vibrator vb 11 recessiva
wabbler-lethal wl 14 recessiva
wasted wst 2 recessiva
weaver wv 16 recessiva
wobbler wr 11 recessiva
Tabela 2.
Sites na Internet Comentrios
Gentica de camundongos
www.informatics.jax.org/mgihome/ Mouse Genome Informatics o centro de bioinformtica do
Jackson Laboratory,
Maine (USA).
So encontrados dados sobre a gentica, genmica e biologia
dos camundongos de
laboratrio.
Anlise do genoma do camundongo
http://www.ensembl.org/Mus_musculus/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/
http://www.genome.ucsc.edu/
Todos os trs sites oferecem banco de dados hierrquico da
sequncia murina.
Centros de mutgnenese e descries de mutantes
http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/mutabase/
http://www.gsf.de/ieg/groups/enu-mouse.html
Todos os sites apresentam o fentipo dos mutantes obtidos
nos centros de pesquisa:
Harwell (Inglaterra)
Munique (Alemanha)
Informao sobre a expresso dos genes
http://bodymap.ims.u-tokyo.ac.jp/ Banco de dados que apresenta a expresso dos genes
humanos e dos camundongos.
Embriologia e anatomia patolgica dos camundongos
http://genex.hgu.mrc.ac.uk/
http://www.med.unc.edu/embryo_images/
Site apresenta um atlas tridimensional do desenvolvimento
embrionrio do camundongo,
bem como o perl de expresso dos genes ao longo da
embriognese.
Site apresenta imagens de microscopia eletrnica de
camundongos normais e mutantes.
Tabela 3.
Anexos
Nmero de stios/ilha
b
Grupo Nmero de
CpG
Contedo
de G+C
Enzimas
a
Stio Esperado Observado Estimativa de todas os
stios na ilhas
I 2 8/8 NotI GCGGCCGC 0.14 0.35 93
AscI GGCGCGCC 0.14 0.27
II 2 6/6 BssHII GCGCGC 1.68 2.11 76
EagI CGGCCG 1.68 1.17
SstII/SacII CCGCGG 1.68 1.89
III 1 6/6 NaeI GCCGGC 1.68 1.14 41
NarI GGCGCC 1.68 1.65
SmaI CCCGGG 1.68 2.14
IV 2 4/6 MluI ACGCGT 0.42 0.03 4
NruI TCGCGA 0.42 0.11
PvuI CGATCG 0.42 0.08
SplI CGTACG 0.42 0.03
V
c
1 4/6 SalI GTCGAC 0.42 0.14 5
XhoI CTCGAG 0.42 0.43
VI HhaI GCGC 46.2 21.86 26
HpaI CCGG 46.2 20.35
a
Todas as enzimas listadas so bloqueadas pela metilao.
b
O tamanho mdio assumido para as ilhas de 1.4 Kb. Esta estimativa baseada nas 37 primeiras ilhas
CpG descritas em humanos.
c
Existe vrias enzimas neste grupo, porm aqui esto listadas as mais comuns.
Tabela 4.
Tabela 5. Clones de YAC utilizados na construo do contig.
Lcus YAC Tamanho em Kb
D13mit215 Y13.215 1000
GLI20 Y902.2 1095
Gli11 Y903.1 1000
D13Mit305 Y13.305.2 1200
D13Mit115 Y3.115.1 1640
Tabela 6. Clones de BAC utilizados na procura de seqncias codifcadoras.
Lcus BAC Tamanho em Kb
D13Mit215 388A11 140
Gli20 282K20 160
Gli11 12P11 100
D13Mit115 496K2 140
Tabela 7.
Clone Origem Tamanho
(pb)
Localizao
nos YAC/
BAC
RT-PCR Homologia Nmero de Acesso
(Genebank)
CL25 AEI, BAC
282E20
350 pb nenhuma positiva gene Fabpi
(exons 1-4)
M65033
CL9 AEI, BAC
282E20
300 pb Y902.2;
283E20
negativa cDNA
humano
AA029228
CL10 AEI, BAC
12P11
150 pb Y903.1;
Y13.305.2;
12P11
positiva nenhuma
homologia
CL12 AEI, BAC
282E20
400 pb nenhuma positiva protena
tirosina cinase
P42685
CL14 AEI, BAC
12P11
200 pb Y902.2;
283E20
positiva EST humana F12060 (clone
c-35c03)
CL20 AEI, BAC
12P11
500 pb Y903.1;
Y13.305.2;
12P11
positiva EST humana R60817 (clone
42061)
CL30 AEI, BAC
282E20
330 pb Y902.1;
283E20
positiva nenhuma
homologia
CL34 AEI, BAC
282E20
310 pb Y902.1;
283E20
positiva EST rato H32240 (EST107143)
Anexos
EST Iniciadores para a PCR Tamanho produto
de PCR (pb)
Localizao nos
YAC/ BAC
RT-PCR
stSG1827 (E1) 1.ACTGGCTGCTCTTGTCTTGGT
2.CCTCTTCTGACCTGCTTTG
149 pb Y902.2 positiva
WI.9635 (E2) 1.GTGCTTGGTGTGGTTGTGG
2.AAGGAGCTGGAATAGCTTTGC
317 pb Y902.2 positiva
WI.11127 (E3) 1.CTCACGACTGTTCTGGAAAGG
2.CCCACAAATAAAAAGCAAGTTG
179 pb Y903.1; Y13.305.2 positiva
WI.6721 (E4) 1.TGAGGCATTATCAGGAAATGC
2.ATGCTCAGCAGTACAAAATAGATCC
107 pb nenhuma negativa
WI.8128 (E5) 1.CGACTCCACCTCCAAACTGT
2.GATGCATTTCCCCCACATAC
WI.9547 (E6) 1.AACCCAGTTTTCCAGCCAC
2.AATTCTGATTCCTTTTATCATGTGC
A006I27 (E7) 1.AGTTAGTCATAGGAGACAGT
2.CCTTGTACTGTTGTTATACA
220 pb Y13.115.1; Y903.1 positiva
A006J31 (E8) 1.AACAGACCTCTAGGGTTC
2.GTACATTAAGACATTGAATG
SHGC.8675 (E9) 1.TCAGGCGGTTCAAGGCAG
2.GTGTCCATCATCAGGGGAAG
SHGC.5634 (E10) 1.GGAGCTGAGCACATTGTGG
2.ATTCTGTTGTCAAGGGGCAAG
160 pb Y13.115.1; 496K2 positiva
WI.16185 (E11) 1.GGGTCACTTGGCCTCTTCTA
2.TTTGCAGTCAGGACAAGCCT
107 pb Y903.1; Y13.305.2 positiva
WI.6581 (E12) 1.AGCCCTCCTGAGGTTGTTG
2.GGGGCAGCTAAAATTTTTATTC
205 pb nenhuma positiva
stG3118 (E13) 1.GAGTTGGTGCCAGATGGG
2.TTTAAATGTTGGCTCCCTGG
158 pb 12P11 positiva
stG4037 (E14) 1.TGCAAGGACAGCAGAGGAC
2.TGGGGCCAGTTAGAAGAGG
stG4087 (E15) ATGTATCCATTTCAAAGGCCC
2.GCCATGTTAAAATAGGAGTGCC
Tabela 8.

A Clonagem Posicional

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