GUIAS DE LABORATORIOS

CURSO MICROORGANISMOS Y AMBIENTE

ACTIVIDADES DE LABORATORI
INSTRUCCIONES GENERALES
1.- Lea el prctico antes de llegar al laboratorio. Tome nota de las instrucciones que se
den en el laboratorio y pregunte, si tiene dudas, para clarificar el procedimiento a
seguir.
2.- Concurra al laboratorio con delantal, apuntes de prcticos y lpiz para marcar
vidrio, indeleble al agua.
3.- Los instrumentos de siembra asa de metal, pipetas !asteur, etc." se esterilizarn a
la llama antes y despu#s de usarlos.
$.- % arque todo los tubos, placas, porta-ob&etos que use, con el nombre del
organismo, la fec'a u otra informaci(n necesaria.
).- Todo elemento usado pipetas, porta-ob&etos, tubos, etc." debe considerarse como
contaminado y debe colocarse en los recipientes destinados para este ob&eto. *+
,+-./ /L %/,+* 0/ T.1-12+.
3.-4uide el material de traba&o y traba&e ordenadamente, evitando los descuidos. *o se
lleve las manos a la boca ni a los o&os, como tampoco saque fuera del laboratorio
material contaminado o cultivo bacterianos.
5.- /fect6e todas las tinciones ola!ente en los lugares especialmente destinados para
este ob&eto.
7.- La siembra o el traspaso de cultivos se 'ar cuidadosamente evitando la
contaminaci(n del mes(n de traba&os. /s conveniente desinfectar la zona contaminada
mo&ndola con soluci(n de Lugol.
8.- 4ierre las llaves de agua y apague los mec'eros cuando no los est# usando.
19.- 1l terminar el traba&o de&e el mes(n limpio y todos los 6tiles en su lugar. Los
microscopios deben quedar li!"io.
11.- Lave sus manos al terminar su traba&o prctico.
12.- *o est permitido fumar en el laboratorio.
13.- 4ualquier accidente, por m:nimo que sea debe ponerse en conocimiento del
docente a cargo del prctico.
2
#RINCI#ALES $ERRAMIENTAS DE TRABA%O BACTERIOLOGICO
1. %ec'ero
/ste sirve para esterilizar la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaob&etos, etc.
flameando suavemente" y asas calentando al ro&o".
2. !lacas de !etri
1rtefactos de vidrio en los cuales se coloca una determinada cantidad de medio
de cultivo s(lido con agar-agar", 'asta completar una altura apro;imada de $
mm. 4onsta de una base y una tapa. 0ebe mantenerse cerrada, e;cepto en los
breves momentos en que debe sembrarse el medio de cultivo.
3. !ipetas !asteur
/stn formadas por un tubo angosto dimetro )-3 mm" de vidrio esterilizado y
estirado 'asta sellar la punta. ,irve para trasladar material l:quido gotas" o
bien, para diseminar siembras acodando el e;tremo o formando un <rastrillo=
con #ste". 0ebe romperse la punta y esterilizarse antes de ser utilizada.
.
$. !ipetas graduadas
,on las pipetas corrientes utilizadas en qu:mica que se envuelven en papel y se
esterilizan al 'orno !asteur. 1l desenvolverse, deben flamearse al mec'ero.
). Tubo de ensayo
,e encuentran taponados con algod(n no 'idr(filo o con tapas especiales
metlicas o de plstico". 0ebe flamearse la boca del tubo despu#s de sacar la
tapa y antes de volverla a poner en posici(n.
3. %atraces
,on los matraces 'abituales que se encuentran taponados con algod(n no
'idr(filo y esterilizado al >orno !asteur. Tambi#n debe flamearse la boca
despu#s de sacar la tapa y antes de volver a ponerla.
5. 1sas
?nstrumentos que tienen alambre nicrom" en la punta, en forma de agu&a asa
recta" o con un peque@o c:rculo en el e;tremo asa curva". ,irven para efectuar
siembras bacterianas o para sembrar en profundidad perforando el agar". /l asa
con c:rculo permite trasladar peque@as muestras de los cultivos.
7. %icroscopio
/n bacteriolog:a se emplea el ob&etivo $9 para observaciones sin tinci(n a
fresco" y el ob&etivo 199 para observaciones por inmersi(n colocando una gota
de aceite de cedro sobre la preparaci(n te@ida".
/l microscopio debe quedar perfectamente limpio despu#s de finalizada la
observaci(n correspondiente. !ara ello, utilice un pa@o impregnado con ;ilol.
8. /stufa de cultivo
Las siembras efectuadas con bacterias o productos biol(gicos en medios de
cultivo deben cultivarse en estufas que se encuentran a la temperatura apropiada.
/sta temperatura depende del tipo de microorganismo investigado. 3
19. -a@o %ar:a
4onsiste en un receptculo con agua de la llave y que tiene una fuente de calor
para mantener una determinada temperatura. Aeneralmente se 'ace 'ervir el
agua, por e&emplo, para fundir el agar en los tubos con medios de cultivo s(lido.
11. 2arra de anaerobiosis
/s un receptculo de plstico transparente con una tapa 'erm#tica para impedir
la entrada de aire a la cmara. 0entro de la &arra se colocan las placas sembradas
en medios de cultivo dise@ados para el aislamiento de bacterias anaerobias &unto
con un sobre quemador de >
2
y 4+
2
, al cual se le adiciona agua, y se cierra la
&arra. /l sobre contiene una pastilla de bro'idruro de sodio y otra con una
muestra de bicarbonato de sodio y cido c:trico. 1l agregar agua se libera >
2
a
partir del bro'idruro de sodio" y 4+
2
, en una proporci(n adecuada para obtener
un ambiente casi e;ento de o;:geno, y con )-19B de 4+
2
. /n la tapa de la
&arra se encuentra un catalizador de esta reacci(n a base de paladio".
1lternativamente, se puede usar un sobre que contiene solamente la pastilla con
bicarbonato de sodio y cido c:trico. 4on esto se logra solamente un ambiente
con )-19B de 4+
2
y ba&o contenido de o;:geno bacterias microaer(filas".
$
Laboratorio *C 1
?*T.+0D44?+* 1L L1-+.1T+.?+ 0/ -14T/.?+L+A?1
1.- ,e darn las e;plicaciones necesarias de las partes constitutivas del microscopio,
con especial referencia a los m#todos que se usan en bacteriolog:aE
a" Dso de cada tipo de ob&etivo y su rendimiento en la
observaci(n.
b" Dbicaci(n adecuada del condensador seg6n la t#cnica de
+bservaci(n, sea #sta a fresco o por inmersi(n.
c" Limpieza del microscopio.
2.- ,e conocern cada uno de los materiales e instrumentos y su t#cnica de uso.
a" 1sas de platino.
b" !ipetas graduadas, pipetas !asteur
c" !lacas de !etri
d" Tubos de ensayo
e" %aterial de tinci(n
f" /stufas de cultivo
3.- ,e darn las nociones fundamentales acerca de la asepsia que requiere el traba&o
bacteriol(gico, para evitar la contaminaci(n de los materiales en uso y de los cultivos,
y tambi#n evitar la posible infecci(n del operador.
??.- +-,/.F14?+* 0/ -14T/.?1,
.
Tinciones simples
/stas tinciones se basan en la acci(n de un solo colorante sobre la c#lula
bacteriana, en tal forma que todas ellas presentarn el mismo color. !or este motivo, se
emplean fundamentalmente para observar la forma y la agrupaci(n de las bacterias.
Traba&o #r'cticoE
1 partir de una muestra de agua y cultivos puros que se le entregar en el
laboratorio, prepare tinciones simples. Trate de establecer al e;amen microsc(pico, las
diferentes morfolog:as formas esf#ricas, alargadas, etc." y agrupaciones en cadenas,
en racimos, en pares, t#tradas, etc.".
a" prepare un G.+T?,, que consiste en una delgada capa de bacterias distribuidas en la
superficie de un portaob&etos y fi&ado a #l para que resista las diferentes etapas de la
tinci(n adici(n de colorantes, lavados, etc.".
La preparaci(n del frotis consiste enE
1.- 4olocar una gota de cultivo l:quido en un portaob&etos limpio o una gota de
emulsi(n si se tiene un cultivo en medio s(lido ver observaci(n a fresco". )
2.- /;tender este material cuidadosamente en una capa delgada.
3.- 0e&ar secar a temperatura ambiente o calentando suavemente a la llama del
mec'ero. /vite sobrecalentamiento.
$.- Gi&ar la preparaci(n pasando rpidamente la cara del portaob&eto que lleva las
bacterias dos o tres veces por la llama del mec'ero, evitando carbonizarlas
por sobrecalentamiento. /l frotis queda entonces listo para ser te@ido con la
coloraci(n deseada.
b" Tinci(n
b" 4ubra el frotis con el colorante que desea y por el tiempo correspondiente.
/&emploE Fioleta de genciana-------------------------1)seg.
,afranina-------------------------------29 seg
1zul de metileno----------------------39 seg.
c" Lave con agua de la llave ba&o un c'orro fino y suave para eliminar el
e;ceso de colorante.
d" ,eque la preparaci(n colocando el portaob&eto entre dos capas de papel
absorbente sin frotarlo, o de&e secar a temperatura ambiente.
e" +bserve la preparaci(n usando el ob&etivo de inmersi(n 199 ;", colocando
sobre la preparaci(n una gota de aceite de cedro inmersi(n".
3.- +bservaci(n macrosc(pica de bacterias
Las bacterias pueden crecer sobre la superficie de medios de cultivo s(lido y
originar una estructura macrosc(pica caracter:stica. /sta se conoce con el
nombre de <4+L+*?1 -14T/.?1*1= y su forma y tama@o es caracter:stica
de cada especie.
Traba&o #r'cticoE
1 partir de la muestra de agua tome 9.1 ml con una pipeta y distrib6yalo
'omog#neamente sobre la superficie de una placa con agar .21. ?ncube la placa a 2)C4
por 2$ 'oras. /n el pr(;imolaboratorio anote sus observaciones.
???.- +-,/.F14?+* 0/ -14T/.?1, 4+*T?*D14+* D*?010 !.14T?41 *C1
1.- Tinciones diferenciales
/stas tinciones permiten agrupar las bacterias de acuerdo con su afinidad por los
colorantes que se utilizan en ellas. 1s:, bacterias que quedan te@idas de diferente color
pertenecen a grupos tambi#n diferentes. La importancia de estas tinciones,
especialmente la de Aram, es que e;iste cierta correlaci(n entre la afinidad tintorial de
la bacteria y otras propiedades, como por e&emplo la susceptibilidad o resistencia a 3
determinados agentes antimicrobianos, basada en diferencias estructurales
principalmente a nivel de la pared bacteriana.
a" Tinci(n de Aram %odificaci(n de >ucHer"
/mplea dos colorantes, violeta de genciana y safranina, con una etapa de decoloraci(n
intermedia. /n esta forma las bacterias se clasifican en Aram positivas si retienen el
primer colorante y por lo tanto aparecen te@idas de azul violeta, o en Aram negativas si
pierden el primer colorante en la etapa de decoloraci(n y se ti@en con el segundo
colorante, apareciendo a la observaci(n microsc(pica de color rosado o ro&o. ,e debe
tener presente que e;isten bacterias que siendo Aram positivas, pueden ba&o algunas
condiciones, observarse como Aram negativas especialmente, cuando los frotis son
preparados con cultivos enve&ecidos. (#odr)a Ud* e+"licar "or que e "roduce ete
,en-!eno.
Traba&o "r'cticoE
1 partir de las colonias que se desarrollaron en la placa que Dd. sembr( en el prctico
anterior, realice esta tinci(n diferencial a aquellas colonias que morfol(gicamente son
diferentes. !ara esto proceda de la siguiente maneraE
a" !repare un frotis de cada una de las colonias diferentes.
b" ,ometa todos los frotis a la tinci(n de Aram, cuya secuencia es la
siguienteE
4olorear con violeta de genciana, o cristal violeta, al 1C durante 39 segundos,
cuidando que el colorante cubra toda la preparaci(n.
/liminar el e;ceso de colorantes y lavar rpidamente con agua, manteniendo el
portaob&etos en posici(n inclinada.
4ubrir la preparaci(n con la soluci(n de Aram o Lugol, de&ndola actuar
durante 39 segundos. Lavar nuevamente con agua.
0ecolorar con alco'ol et:lico 8)B durante 39 segundos y lavar con agua
etapa diferencial". ?mportante respetar el tiempo.
4oloraci(n de fondo, o de contraste con safranina durante 29 segundos.
Lavar con agua, secar y observar por inmersi(n.
La fase de decoloraci(n con alco'ol constituye la etapa ms importante de la tinci(n de
Aram y en ella reside su carcter diferencial. 1quellas especies que retienen el colorante
se denominan Aram positivas y se observan de color azul, y aquellas en que fue
arrastrado por el alco'ol, Aram negativas, y se observarn de color ro&o debido a que
captan el colorante de contraste. +bserve por inmersi(n la morfolog:a, agrupaci(n y
afinidad tintorial de las bacterias que Dd. seleccion(.
c" Tinci(n de Iie'l-*eelsen %odificaci(n de Jinyoun"
5
/sta tinci(n, al igual que la de Aram, emplea dos colorantesE La fucsina y el azul de
metileno o amarillo victoria", con una decoloraci(n intermedia basada en el uso de un
decolorante en#rgico alco'ol cido". Las bacterias capaces de resistir esta decoloraci(n
y que, por lo tanto, se observan de color ro&o intenso se denominan alco'ol cido
resistente 11.".La importancia de esta tinci(n radica en que algunas bacterias alco'ol
cido resistentes son el agente causal de importantes enfermedades tuberculosis, lepra".
Traba&o "r'cticoE
+bserve las bacterias 11. en un frotis que se 'a te@ido previamente. >aga la
observaci(n con el ob&etivo de inmersi(n.
2.- Tinciones especiales
/stas tinciones, cuyas t#cnicas son ms comple&as que las tinciones simples,
tienen por ob&eto destacar algunas de las partes constitutivas de la c#lula bacteriana.
4omo e&emplos se pueden citar las tinciones de n6cleo, flagelos, cpsulas, esporas, etc.
*o son, en general, de uso rutinario y encuentran su aplicaci(n en traba&os de
investigaci(n bacteriol(gica.
Traba&o "r'cticoE /n el laboratorio encontrar diferente frotis te@idos con tinciones
especiales para observar las siguientes estructurasE
a" Glagelos
b" /sporas
c" 4psula
Dtilice ob&etivo de inmersi(n para realizar sus observaciones.
Laboratorio *C 2
T/4*?41, 0/ 1?,L1%?/*T+ -14T/.?1*+
/n la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos
comple&as. ,on diversos los procedimientos e;istentes para el estudio de los
microorganismos. Dna t#cnica esencial en %icrobiolog:a es la t#cnica de aislamiento
que permite la obtenci(n de cultivos puros, a partir de los cuales se pueden realizar
estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Dn cultivo puro es aquel que
tiene una sola clase de microorganismos.
!or aislamiento bacteriano se entiende la separaci(n en cultivos puros, las diferentes
bacterias que se encuentran en cultivos o productos polimicrobianos. /n general, la
flora bacteriana de productos o ambientes naturales agua, alimentos, suelo, etc." y de
materiales patol(gicos es 'eterog#nea y por lo tanto, el aislamiento constituye una
etapa fundamental para la gran mayor:a de los estudios bacteriol(gicos.
/;isten varias t#cnicas de aislamiento que pueden usarse en forma individual o en
combinaci(n, de las cuales las de uso ms corriente sonE
a" !or diseminaci(n en superficie.
b" 1islamiento en medios selectivos.
1.- 1islamiento por diseminaci(n en superficie
7
Traba&o "r'ctico/
a" ,iembre por diseminaci(n, en la superficie de una placa de agar tripticasa o
agar .
2
1, una muestra que contenga mezcla de bacterias. La siembra por diseminaci(n
consiste en depositar una asada de muestra en la superficie del medio de cultivo, cerca
del borde de la placa, y desde ese punto recorrer el agar siguiendo un trazado
zigzagueante lo ms numeroso posible utilizando la mayor superficie del agar, con el
prop(sito de disminuir el contenido de bacterias en el instrumento de siembra y de esta
manera, obtener colonias aisladas. 0urante esta operaci(n, tenga cuidado de no romper
el agar con el asa. ,iga las instrucciones que le darn en el laboratorio.
b" ?ncube el cultivo a 39C4.
2.- 1islamiento en medios selectivos
Traba&o prcticoE
a" ,iembre la mezcla de g#rmenes en placas conteniendo medios selectivos
agar %c4onHeyK 1gar 4ristal FioletaK agar Telurito de J". 1l sembrar, 'galo por
diseminaci(n con el fin de obtener colonias aisladas e ?ncube el cultivo a 39C4.
./,DLT10+,E /n el pr(;imo laboratorio observe el desarrollo que
presentan los diferentes cultivos que 'a sembrado. +bserve si logr( colonias
aisladas y si 'ay de diferentes caracter:sticas macrosc(picas. !repare un frotis y
tinci(n de Aram de cada tipo de colonia. 4ompare los resultados obtenidos con cada
una de las diferentes t#cnicas empleadas.
Laboratorio *C 3
0/T/.%?*14?+* 0/ L1 !+-L14?+* -14T/.?1*1
Dno de los problemas que se presenta en bacteriolog:a es determinar o estimar el
n6mero de bacterias viables y recuperables en cultivo, presentes en una poblaci(n
dada, sea ella la de un cultivo puro o la de una muestra de alimento, de suelo o de
agua.
0e los m#todos empleados, los ms utilizados sonE
1.- %#todo de diluci(n seriada en tubos.
2.- %#todo de recuento en placa por diseminaci(n en superficie
3.- %#todo de recuento en placa por siembra de microgota .
$.- 0eterminaci(n de densidad (ptica
1" %#todo de diluci(n seriada en tubos, consiste en sembrar al:cuotas de diluciones
sucesivas de la muestra, en tubos conteniendo medio l:quido 'asta que algunas de
estas siembras resulten sin desarrollo negativas" debido a que la porci(n sembrada,
por su nivel de diluci(n, no contiene ninguna c#lula bacteriana viable. /ste m#todo
permite obtener una estimaci(n de la poblaci(n bacteriana y su resultado esta
sustentado en principios estad:sticos de probabilidades y por ello, se e;presa como el
*6mero %s !robable de microorganismos presentes en la muestra original *.%.!.". 8
2" %#todo de recuento en placa por diseminaci(n en superficie, consiste en sembrar
al:cuotas, generalmente de 9.1ml, de diluciones sucesivas en la superficie de agar-agar
con los requerimientos necesarios de nutrientes de manera que las bacterias quedan
atrapadas y fi&as en el agar con el fin de que cada c#lula d# origen a un crecimiento
macroscopico llamado <colonia bacteriana=. 4ontando el n6mero de colonias
desarrolladas en cada cultivo y de acuerdo con la diluci(n utilizada, con es posible
calcular el n6mero de bacterias viables presentes en la muestra analizada. /l m#todo
de siembra por microgota es una modificaci(n del anterior, que consiste en depositar
en la superficie del agar al:cuotas de 29Ll de la muestra.
3) 0eterminaci(n de densidad (ptica, Las fases de crecimiento de una poblaci(n
bacteriana pueden determinarse midiendo la turbidez del cultivo consiste en determinar
la 0ensidad Mptica 0+ a una longitud de onda espec:fica usualmente entre )79 a
329nm. 1unque dic'a turbidez no es una medida directa y e;acta del n6mero de c#lulas,
su incremento es indicativo del crecimiento bacteriano. !ara esta determinaci(n, se
utiliza un espectrofot(metro, en el cual la luz a una longitud de onda previamente
definida, pasa a trav#s del cultivo bacteriano. 1 medida que la concentraci(n celular
aumenta, el cultivo se 'ace ms turbio, y se reduce la cantidad de luz transmitida
consecuencia de la difracci(n de la luz por parte de las c#lulas.
Traba&o "r'cticoE
/n el laboratorio encontrar muestras de agua de la laguna de <Los !atos= con una
poblaci(n apro;imada de 19
3
o ms bacterias por ml. 0etermine la poblaci(n de la
muestra de agua mediante las siguientes t#cnicasE
1.- %#todo de diluci(n seriada en tubos
1 partir de la muestra de agua, efect6e una serie de diluciones seriadas de 19 en 19.
/fect6e los traspasos con pipetas esterilizadas a tubos conteniendo 8 ml de agua
destilada est#ril. /fect6e las diluciones de acuerdo a las instrucciones del profesor de
prctico. ,iembre las diluciones anteriores en series de tres tubos conteniendo medio
de cultivo l:quido, %arque las series de tubos con la diluci(n correspondiente e
inc6belas a 39C4, por 2$-$7 'oras. Lea los resultados en la Tabla del *.%.!. Los
tubos positivos se presentan turbios a causa de crecimiento.
2.- %#todo de recuento en placa por diseminaci(n en superficie
Dtilice las mismas diluciones preparadas anteriormente y deposite 9.1ml de ellas en la
superficie del agar, siguiendo las instrucciones de su profesor, distribuya la al:cuota por
la superficie del agar
3.- 0eterminaci(n de densidad (ptica 0.+.E
/n el laboratorio encontrara un matraces con cultivos de Eschericha coli de 1, 19 29 y
$9 'ora de incubaci(n, de cada uno obtenga al:cuotas de 1ml y disp(ngalos en una
cubeta de cuarzo para su lectura a 399nm en el espectrofot(metro, siguiendo las
instrucciones de su instructor de practico. !aralelamente, de cada cultivo efectu#
diluciones seriadas y siembre en la superficie de placas mediante el m#todo de la
<microgota= siguiendo las indicaciones de su instructor.

/n el laboratorio siguiente, analice los resultados obtenidos
19
N/ncontr( diferencias entre la estimaci(n de la poblaci(n bacteriana efectuado
mediante el m#todo de la microgota con la 0+O
NPue consideraciones tiene el m#todo que permite estimar la poblaci(n bacteriana
mediante la 0.+ con respecto al de la microgotaO

Laboartorio *C $
A/*/T?41 -14T/.?1*1 %utaci(n"
0*1 Detecci-n de Mutante
1islamiento de mutantes resistentes a los antibi(ticos.
/n el laboratorio encontrar un cultivo l:quido de Bacillus subtillis que 'a sido
incubado por 2$ 'orasE

!roceda de la siguiente maneraE
1.- 1dicione una gota del cultivo a un tubo que contiene 2 ml de agua destilada est#ril.
2.-?mpregne una t(rula con esta suspensi(n bacteriana y siembre con ella toda la
superficie de una placa con agar nutritivo o agar sangre".
3.-4oloque un disco de papel filtro impregnado con rifampicina ) Lg" y otro con
clo;acilina ) Lg" en la superficie de esta placa.
$.-?mpregne la misma t(rula pero en el cultivo concentrado y siembre con ella toda la
superficie de una placa con agar nutritivo que contiene )9ugQml de rifampicina.
?ncube las placas a 35C4 por $7 'oras.
Laboratorio de Mutaci-n 2 continuaci-n3
+bserve el desarrollo de la cepa de Bacillus subtillis en la placa en la cual se coloc( un
disco con rifampicina y otro con clo;acilina.
,i es que e;iste desarrollo de algunas colonias es interesante estudiar cules son sus
propiedades, en relaci(n con los antibi(ticos ensayados sobre la cepa salva&e. /sto es,
determinar si se 'a producido alg6n cambio en estas propiedades a causa del desarrollo
de la bacteria en presencia de rifampicina.
N4(mo podr:a Dd. estudiar este cambio potencialO
?ntente dise@ar una e;periencia simple para demostrarlo, en base a las metodolog:as ya
empleadas en las clases prcticas anteriores.
/fect6e esta e;periencia e incube la placa a 35C4 durante 2$ '.
11
+bserve las placas con las cuales se efectu( la e;periencia para investigar cambios en
las propiedades de la cepa de Bacillus subtillis desarrollado en presencia de rifampicina,
en relaci(n a la cepa salva&e. 4ompare estos resultados con los originales de la cepa,
antes de ser sembrada en el medio seleccionador.
1nalice las placas que sembr( para caracterizar las trasnscon&ugantes
Laboartorio *C )
A/*/T?41 -14T/.?1*1 4on&ugaci(n"
.Tran,erencia de deter!inante de reitencia a lo antibi-tico "or con&u4aci-n.
,e dispondr de un cultivo l:quido de E. coli J12 1*
r
" cepa receptora" en caldo
nutritivo y de la cepa E. coli GT15 T
r
, J
r
" cepa dadora".
2.1- 4aracterizaci(n de las cepas bacterianas dadora y receptora.
,iembre ambas cepas en la mitad de una plca con agar %ac 4onHey sin antibi(ticos.
1dicione una gota de cada cultivo a tubos que contiene 2 ml de agua destilada
,iembre con t(rulas una suspensi(n de las cepas dadora GT15 y otra con la cepa
receptora J-12 en placas con agar tripticasa y luego deposite en su superficie discos
impregnados con tetraciclina, Hanamicina, ampicilina y cido nalidi;ico. ?ncube por
2$ 'oras a 35C4 y observe los 'alos de in'ibici(n del crecimiento bacteriano en torno a
los discos con los antibi(ticos.
2.2.-4on&ugaci(n
,iembre $.) ml de cultivo de E. coli J12 y 9.) ml de cultivo de E. coli GT15 en un
matraz que contiene 19 ml de caldo tripticasa. ?ncube a 35C 4 por 1 'ora.
0iluya la mezcla bacteriana en agua destilada est#ril 'asta la diluci(n 19
-2
.
,iembre 9.1 ml de la diluci(n 19
-2
en la superficie de las siguientes placasE
-agar %ac 4onHey con tetraciclina 2) LgQml" y cido nalidi;ico )9 LgQml".
-agar %ac 4onHey con Hanamicina 39 LgQml" y cido nalidi;ico )9 LgQml"
-agar %ac 4onHey sin antibi(ticos. /n este caso particular, la siembra debe efectuarse
de tal modo de obtener colonias aisladas diseminaci(n en superficie" y se debe efectuar
las correspondientes diluciones para ello.
?ncube las placas a 35C 4 por 2$ 'oras.
GENETICA BACTERIANA 2Continuaci-n3
5* Tran,erencia de deter!inante de reitencia a lo antibi-tico "or
con&u4aci-n*
2.1. +bserve las placas en las cuales sembr( el par con&ugante
12
N/;iste desarrolloO
N/s #ste confluente o en forma de colonias aisladasO
N,on las colonias similares a las de la cepa dadora o receptoraO
N!or qu# se coloc( cido nalid:;ico en ambas placasO
N!odr:a 'aberse sembrado en una placa adicional conteniendo cido nalid:;ico,
tetraciclina y HanamicinaO
NPu# diferencia e;iste el proceso de mutaci(n y el de con&ugaci(n, en cuanto a los
determinantes de resistencia y su aparici(n en las cepas resistentesO
2.1 4aracterizaci(n de las cepas bacterianas transcon&ugantes
0esde cada una de las placas seleccionadoras eli&a dos o ms colonias y siembre en las
siguientes placasE
- agar %ac 4onHey con tetraciclina 2) ugQml"
- agar %ac 4onHey con Hanamicina 39 ugQml"
- agar %ac 4onHey con cido nalid:;ico )9 ugQml"
- agar %ac 4onHey sin antibi(ticos
?ncube las placas a 35C4 por 2$ 'oras.
NPu# se pretende con esta e;perienciaO
4ompare estos los resultados con los obtenidos con la cepa dadora y receptora.
13
Laboratorio *C 3
0/T/.%?*14?M* 0/ L1 41L?010 -14T/.?+L+A?41 0/L 1AD1
Las bacterias al(ctonas constituyen uno de los contaminantes biol(gicos ms
importantes de los sistemas acuticos y su incorporaci(n a #l se realiza principalmente
por la descarga de desec'os dom#sticos a trav#s de los emisarios de alcantarillado.
Las bacterias de origen ent#rico, entre las cuales se encuentran especies pat(genas para
el 'ombre, llegan a los r:os y su presencia se eval6a mediante la detecci(n de
microorganismos indicadores. /ntre #stos, Escherichia coli y Enterococcus son
utilizados convencionalmente como indicadores de riesgo potencial de la presencia de
bacterias pat(genas como Salmonella sp. y Shigella sp. y de otros pat(genos intestinales
como virus y parsitos.
.equisitos bsicos para ser considerado un buen indicador de la calidad del agua
a" 0ebe estar presente en presencia de pat(genos
b" 0ebe ser especifico para contaminaci(n fecal
c" 0ebe ser capaz de permanecer viable en el agua por mayor tiempo que el pat(geno
d" 0ebe ser detectable por m#todos simples y rpidos
/l m#todo de tubos m6ltiples puede ser desarrollado sembrando series de cinco )"
tubos o series de tres 3" tubos con 19, 1 y 9.1 ml respectivamente. ,i la muestra se
sospec'a ms contaminada puede ser analizada utilizando diferentes grados de diluci(n
que tengan una progresi(n geom#trica de 19. !or e&emplo sembrar 1 o 9.1 ml de una
diluci(n 1E19 ( 1E199, 1E1999
!ara una muestra de agua la metodolog:a consiste enE
-!reparar una serie de 3 o de ) de tubos con caldo lactosado con 19 ml de caldo con el
doble de la concentraci(n y una segunda serie con 8 ml de caldo lactosado con una
concentraci(n normal o simple. /n todos se debe incorporar una campana de vidrio y
tapar los tubos con algod(n para luego esterilizar en el autoclave durante 1) minutos a
129R4.
- 0isponer de igual n6mero de tubos con 19ml de caldo bilis verde -rillante con
concentraci(n normal o simple, ponga en todos los tubos una campana de vidrio, tape
los tubos con algod(n y esterilice en el autoclave durante 1) minutos a 129C4.
- 0isponer de igual n6mero de tubos con ) ml de caldo /4 con concentraci(n normal o
simple, ponga en todos los tubos una campana de vidrio, tape los tubos con algod(n y
esterilice en el autoclave durante 1) minutos a 129 R4.
To!a de !uetraE
La muestra debe ser tomada en frascos de vidrio est#riles con una capacidad m:nima de
2)9 ml y transportadas al laboratorio en ca&as refrigeradas a $R4 sin congelar" y
procesadas entes de ) 'oras.
1$
Traba&o "r'ctico*
#rocea!iento de la !uetra/
a" .otule adecuadamente los tubos con caldo lactosado. 1gite el frasco con la
muestra y siembre as#pticamente 19 ml de muestra en la serie de 3 tubos con el
doble de la concentraci(n.
b" ?nocule 3 tubos con 1 ml y 3 tubos con 9.1ml de la muestra en la serie de tubos
con concentraci(n normal e incube los tubos a 35C4 durante $7 'oras. .egistre
el n6mero de tubos con desarrollo bacteriano positivos, aquellos tubos con
turbidez y con presencia de gas en la campana de vidrio. NOTA ,e considera
desarrollo positivo cuando el volumen de gas corresponde a apro;imadamente a
un tercio del volumen total de la campana.
c" 1 partir de todos los tubos con desarrollo positivo traspase simultneamente
9.1ml o 2 asadas, a tubos con caldo bilis verde brillante -F- y a tubos con
caldo /4. ?ncube, durante $7 ', los tubos con -F- a 35C4 para coliformes
totales y a $$.)C4 para coliformes fecales. .egistre el n6mero de tubos positivos
e interprete en la tabla de n6mero ms probable.
ReultadoE .egistre el n6mero de tubos con desarrollo bacteriano positivo, estos es
tubos con turbidez y presencia de gas en la campana de vidrio. ,e considera positivo
cuando el volumen de gas corresponde a apro;imadamente un tercio del volumen total
de la campana*
Tabla Reu!ida del N6!ero !' "robable NM#7088!l 2081018*03
888 <3 088 3,6 588 9,1 988 23
880 3,0 080 7,2 580 9,1 980 39
885 6,0 085 11 585 20 985 64
889 9,0 089 15 589 26 989 95
808 3,0 008 7,3 508 15 908 43
800 6,0 000 11 005 15 500 20
805 9,2 505 27 900 75 905 120
809 12 009 19 509 34 909 160
858 6,2 058 11 558 21 958 93
850 9,3 050 15 550 2 950 150
855 13 055 20 555 35 955 210
859 16 059 24 559 42 959 290
898 9,4 098 16 598 29 998 240
890 13 090 20 590 36 990 460
895 16 095 24 595 44 995 1100
899 19 099 29 599 53 999:1100
1)
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