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ECNICAS UTILIZADAS PARA DETECTAR GLICOCONJUGADOS Y GLICANOS EN

SECCIONES DE PARAFINA:
1-TECNICA DE PAS.

¿El PAS tiñe únicamente hidratos de carbono?

La técnica de PAS (ácido periódico-Schiff) es y ha sido utilizada durante mucho tiempo por numerosos
investigadores como método de identificación de macromoléculas con hidratos de carbono, pero como
veremos la reacción PAS positiva puede deberse a la presencia de otras moléculas muy diferentes a los
hidratos de carbono. Por lo tanto, según Pearse (1985) la especificidad del PAS para la detección de
hidratos de carbono no puede ser aceptada sin una cualificación.
Los hidroxilos libres de dos átomos de carbono adyacentes (como los grupos 1,2-glicol de las hexosas)
(Fig. 1) de macromoléculas tisulares pueden ser visualizadas histoquímicamente mediante la oxidación
a dialdehídos (con el ácido periódico) y posterior condensación de los grupos aldehídos con agentes
cromogénicos como el reactivo de Schiff (Spicer et al., 1961, Spicer, 1992). Los grupos hidroxilos
adyacentes visualizados por el PAS están presentes principalmente -pero no exclusivamente- en
residuos de carbohidratos (Spicer, 1961). Los azúcares pequeños son solubles y, por lo tanto, no resisten
los diferentes lavados durante el procedimiento.

El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacáridos) como el glucógeno o
de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras moléculas que no son
carbohidratos) incluyen a las glicoproteínas, proteoglicanos y a los glicolípidos (Spicer, 1992). Se ha
demostrado que con tiempos de oxidación normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos
(polisacáridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS
se debe, en parte, a la presencia de glicoproteínas (neutras o levemente ácidas ) y de glucógeno. A su
vez, sólo algunas glicoproteínas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reacción se debe a las
hexosas presentes en las glicoproteínas ya que las hexosaminas y ácidos hexurónicos parecen no
contribuir en la reacción (Pearse, 1985).
Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de proteínas son
susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no están presentes en gran cantidad para
contribuir significativamente a la tinción (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas
pueden detectarse proteínas ricas en residuos de cisteína (Pearse, 1985). A nivel extracelular las
glicoproteínas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colágenas y ciertas sustancias
hialinas son también PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Los glicolípidos, fosfolípidos y algunos pigmentos de naturaleza lipídica como el ceroide son PAS
positivos. También lo son los lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reacción del PAS de diferentes
estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas:
a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La técnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por
lo tanto, no creemos que cuantificar la técnica de PAS sea de importancia, pero sí lo es el hecho de que
una estructura dada sea o no PAS positiva. Es útil analizar las diferencias en intensidades de la
reacción, sólo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de
igual forma.
Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras técnicas con el fin de cualificar los resultados PAS
positivos. Por ejemplo:
a) Técnica de PAS sin oxidación previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el
resultado de una oxidación previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidación previa con el
ácido periódico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).
b) Detección de lípidos en cortes de parafina: en general los lípidos son arrastrados por los solventes
durante la inclusión en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teñir
lípidos insolubles como algunos glicolípidos, fosfolípidos y lípidos insaturados (Spicer, 1992). Los
lípidos son extraídos -según Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de
cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromación previa a la técnica de PAS puede utilizarse
para bloquear los grupos etilénicos PAS reactivos de los lípidos insaturados (Cohn, 1955). La reacción
de Schiff con ácido perfórmico para la detección de lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es
muy útil si a la vez se realiza un control negativo con bromación.
Para detectar la presencia de lípidos insolubles en cortes de parafina son útiles las técnicas de Negro-
Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klüver-Barrera (1953) para detectar fosfolípidos y
glicolípidos -como gangliósidos y cerebrósidos- (Pearse, 1985) y la reacción modificada de Bruckner
(Pearse, 1985) para detectar glicolípidos.

c) Comprobación de grupos 1-2 glicol: según Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la
comprobación, mediante la reacción de la acetilación reversible, de que el carácter PAS positivo de una
estructura se debe únicamente a las funciones 1-2 glicol. Según este autor este punto es verificado
mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilación con acético anhidro y piridina
anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el ácido periódico no puede actuar y los hidratos de
carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificación (desacetilación) con hidróxido de
potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Según Hale (citado por Pearse, 1985) la
acetilación bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilación restaura su
actividad. Para Pearse (1985) esta reacción carece de fines prácticos, aunque en su libro de
histoquímica (apéndice 15, de la parte primera) menciona la técnica señalando que la reacción negativa
luego de la acetilación indica la presencia de grupos 1-2 glicol.
d) Presencia de glucógeno: El método más útil para identificar la presencia de glucógeno mediante la
técnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan
el glucógeno formando azúcares pequeños que son extraídos con el agua de lavado luego de aplicar las
enzimas. Una disminución o negatividad de la reacción de PAS luego de este tratamiento indica
claramente la presencia de glucógeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). También existen otras
técnicas que permiten detectar la presencia de glucógeno en cortes de parafina. La más utilizada es
el carmín de Best (mecanismo empírico). Es selectiva para el glucógeno, aunque también puede teñir
suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990).
Es útil aclarar que los depósitos de glucógeno intracelulares son fácilmente reconocibles en cortes
ultrafinos a nivel de microscopía electrónica.
e) Azúcares neutros versus azúcares ácidos: desde el año 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han
demostrado que disminuyendo la concentración del ácido periódico puede oxidarse en forma específica
los residuos de ácido siálico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las
glicoproteínas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan más rápido a la oxidación con el
periódico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azúcares neutros
(Volz et al., 1987a). La técnica de Volz y col. (1987a) es un excelente método para la oxidación selectiva
de ácidos siálicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de ácido
siálico de la modificación del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de
oxidación de los residuos de siálico producido por una disminución del pH y la baja concentración de
periódico del agente utilizado. A su vez, ocurriría una disminución en la tasa de oxidación de los
azúcares neutros lo cual produce una concentración insuficiente de grupos aldehídos capaces de ofrecer
reacción visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).

En algunas glicoproteínas ácidas, los carbonos 7, 8 ó 9 de los residuos de ácido siálico pueden hallarse
acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la técnica de PAS ni a la modificación de la
misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificación con hidróxido de potasio pueden
desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reacción de
PAS luego de la saponificación puede indicar la presencia de ácido siálico acetilado (con O-acyl ésteres).
No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba también a la desacetilación de grupos 1-2
glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de ácidos siálicos
totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificación
(remoción de los acetilos) y luego realizar la técnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede
reconocerse la presencia de azúcares neutros, bloqueando la reacción del ácido siálico. Las etapas
fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificación con hidróxido de potasio
(eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el ácido siálico), II-oxidación periódica
selectiva según Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehídos, sólo los oxhidrilos de los residuos de ácido
siálico), III-reducir mediante la utilización del borohidruro de sodio los aldehídos producidos en la
oxidación anterior a alcoholes, IV-realizamos la técnica de PAS (de esta forma sólo reaccionarán los
oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azúcares neutros, ya que los oxhidrilos del ácido
siálico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS
reactivos).
El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacáridos) como el glucógeno o
de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras moléculas que no son
carbohidratos) incluyen a las glicoproteínas, proteoglicanos y a los glicolípidos (Spicer, 1992). Se ha
demostrado que con tiempos de oxidación normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos
(polisacáridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS
se debe, en parte, a la presencia de glicoproteínas (neutras o levemente ácidas ) y de glucógeno. A su
vez, sólo algunas glicoproteínas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reacción se debe a las
hexosas presentes en las glicoproteínas ya que las hexosaminas y ácidos hexurónicos parecen no
contribuir en la reacción (Pearse, 1985).
Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de proteínas son
susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no están presentes en gran cantidad para
contribuir significativamente a la tinción (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas
pueden detectarse proteínas ricas en residuos de cisteína (Pearse, 1985). A nivel extracelular las
glicoproteínas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colágenas y ciertas sustancias
hialinas son también PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Los glicolípidos, fosfolípidos y algunos pigmentos de naturaleza lipídica como el ceroide son PAS
positivos. También lo son los lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reacción del PAS de diferentes
estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas:
a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La técnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por
lo tanto, no creemos que cuantificar la técnica de PAS sea de importancia, pero sí lo es el hecho de que
una estructura dada sea o no PAS positiva. Es útil analizar las diferencias en intensidades de la
reacción, sólo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de
igual forma.
Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras técnicas con el fin de cualificar los resultados PAS
positivos. Por ejemplo:
a) Técnica de PAS sin oxidación previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el
resultado de una oxidación previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidación previa con el
ácido periódico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).
b) Detección de lípidos en cortes de parafina: en general los lípidos son arrastrados por los solventes
durante la inclusión en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teñir
lípidos insolubles como algunos glicolípidos, fosfolípidos y lípidos insaturados (Spicer, 1992). Los
lípidos son extraídos -según Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de
cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromación previa a la técnica de PAS puede utilizarse
para bloquear los grupos etilénicos PAS reactivos de los lípidos insaturados (Cohn, 1955). La reacción
de Schiff con ácido perfórmico para la detección de lípidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es
muy útil si a la vez se realiza un control negativo con bromación.
Para detectar la presencia de lípidos insolubles en cortes de parafina son útiles las técnicas de Negro-
Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klüver-Barrera (1953) para detectar fosfolípidos y
glicolípidos -como gangliósidos y cerebrósidos- (Pearse, 1985) y la reacción modificada de Bruckner
(Pearse, 1985) para detectar glicolípidos.

c) Comprobación de grupos 1-2 glicol: según Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la
comprobación, mediante la reacción de la acetilación reversible, de que el carácter PAS positivo de una
estructura se debe únicamente a las funciones 1-2 glicol. Según este autor este punto es verificado
mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilación con acético anhidro y piridina
anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el ácido periódico no puede actuar y los hidratos de
carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificación (desacetilación) con hidróxido de
potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Según Hale (citado por Pearse, 1985) la
acetilación bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilación restaura su
actividad. Para Pearse (1985) esta reacción carece de fines prácticos, aunque en su libro de
histoquímica (apéndice 15, de la parte primera) menciona la técnica señalando que la reacción negativa
luego de la acetilación indica la presencia de grupos 1-2 glicol.
d) Presencia de glucógeno: El método más útil para identificar la presencia de glucógeno mediante la
técnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan
el glucógeno formando azúcares pequeños que son extraídos con el agua de lavado luego de aplicar las
enzimas. Una disminución o negatividad de la reacción de PAS luego de este tratamiento indica
claramente la presencia de glucógeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). También existen otras
técnicas que permiten detectar la presencia de glucógeno en cortes de parafina. La más utilizada es
el carmín de Best (mecanismo empírico). Es selectiva para el glucógeno, aunque también puede teñir
suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990).
Es útil aclarar que los depósitos de glucógeno intracelulares son fácilmente reconocibles en cortes
ultrafinos a nivel de microscopía electrónica.
e) Azúcares neutros versus azúcares ácidos: desde el año 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han
demostrado que disminuyendo la concentración del ácido periódico puede oxidarse en forma específica
los residuos de ácido siálico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las
glicoproteínas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan más rápido a la oxidación con el
periódico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azúcares neutros
(Volz et al., 1987a). La técnica de Volz y col. (1987a) es un excelente método para la oxidación selectiva
de ácidos siálicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de ácido
siálico de la modificación del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de
oxidación de los residuos de siálico producido por una disminución del pH y la baja concentración de
periódico del agente utilizado. A su vez, ocurriría una disminución en la tasa de oxidación de los
azúcares neutros lo cual produce una concentración insuficiente de grupos aldehídos capaces de ofrecer
reacción visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).

En algunas glicoproteínas ácidas, los carbonos 7, 8 ó 9 de los residuos de ácido siálico pueden hallarse
acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la técnica de PAS ni a la modificación de la
misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificación con hidróxido de potasio pueden
desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reacción de
PAS luego de la saponificación puede indicar la presencia de ácido siálico acetilado (con O-acyl ésteres).
No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba también a la desacetilación de grupos 1-2
glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de ácidos siálicos
totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificación
(remoción de los acetilos) y luego realizar la técnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede
reconocerse la presencia de azúcares neutros, bloqueando la reacción del ácido siálico. Las etapas
fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificación con hidróxido de potasio
(eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el ácido siálico), II-oxidación periódica
selectiva según Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehídos, sólo los oxhidrilos de los residuos de ácido
siálico), III-reducir mediante la utilización del borohidruro de sodio los aldehídos producidos en la
oxidación anterior a alcoholes, IV-realizamos la técnica de PAS (de esta forma sólo reaccionarán los
oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azúcares neutros, ya que los oxhidrilos del ácido
siálico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS
reactivos).
3) UTILIZACION DE LA TECNICA DE PAS JUNTO CON EL AZUL ALCIAN.
Esta técnica puede diferenciar fácilmente la presencia de glicoconjugados y ácidos y neutros en un
mismo preparado (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una primera tinción con el azul alcián a pH
2,5, seguida de la técnica de PAS. El uso en primer lugar del azul alcián permite colorear los
glicoconjugados y glicosaminoglicanos ácidos. Los glicoconjugados ácidos que puedan reaccionar con el
PAS aparentemente son bloqueados por el azul alcián. Por lo tanto, la posterior utilización del PAS sólo
reaccionará con los glicoconjugados neutros (Bancroft y Stevens, 1990). Según Spicer (1992) pueden
reaccionar también glicoproteínas con hexosas PAS reactivas y grupos aniónicos alcián reactivos. La
interpretación de los resultados es la siguiente (Spicer, 1992):
 PAS+, azul alcián- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoproteínas
neutras (raramente glicolípidos insolubles).
 PAS+, azul alcián+ (el color dependerá de la entidad dominante y puede variar del azul
púrpura, hacia el púrpura o al violeta): glicoproteínas ácidas o una mezcla de glicoproteínas
ácidas y neutras o una mezcla de glicoproteínas ácidas y neutras más glicosaminoglicanos.
 PAS-, Azul alcián+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoproteínas ácidas
libres de hexosas PAS reactivas. También debe considerarse aquí la presencia de glicoproteínas
ácidas con hexosas bloqueadas por la unión del alcián a la macromolécula (Bancroft y Stevens,
1990).



Los grupos cromóforos son los grupos funcionales de la molécula responsables de la absorción.
Principalmente son: dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromáticos, grupo
carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un átomo con pares libres).
Los grupos auxocromos son sustituyentes del cromóforo y alteran λmax y/o ϵmax. Son auxocromos
los grupos metilo, halógenos, hidroxi, alcoxi, amino.
Los grupos auxocromo tienen los siguientes efectos sobre los cromóforos:
 Desplazamiento batocrómico. La absorción del cromóforo se desplaza hacia mayores longitudes de
onda.
 Desplazamiento hipsocrómico. La absorición del cromóforo se desplaza hacia menores logitudes de
onda.
 Efecto hipsocrómico. Aumenta ϵmax, presentando la banda mayor intensidad.
 Efecto hipocrómico. Disminuye ϵmax, disminuyendo la intensidad de absorción.