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BMC Genomics. 2011; 12: 580.

. Publicado en Internet el 25 de noviembre 2011 doi: 10.1186/1471-2164-12-580


PMCID: PMC3293833
Anlisis de los sitios de metilacin CpG y CGI entre los genomas
de ADN del virus del papiloma humanos
Silvia C Galvn ,
1
Martha Martnez-Salazar ,
1
Vctor Galvn M ,
2
Roco Mndez ,
3
Gibran T-Daz
Contreras ,
4
Moiss Alvarado-Hermida ,
4
Rogelio Alcntara-Silva ,
4
y Alejandro Garca-Carranc
1, 3

Informacin Autor artculo seala copyright y licencia
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Abstracto
Fondo
El genoma del virus del papiloma humano (VPH) se divide en secuencias de
codificacin tempranos y tardos, incluyendo 8 marcos de lectura abiertos (ORF) y una
regin reguladora (LCR). La expresin del gen viral puede ser regulada a travs de los
mecanismos epigenticos, incluyendo la metilacin de citosina en los dinucletidos
CpG. Hemos analizado la distribucin de los sitios CpG y las islas CpG / grupos (CGI)
entre los 92 genomas de VPH diferentes agrupadas en funcin de su tropismo
preferencial: cutnea o mucosa. Se calcul la proporcin de sitios CpG (PCS) para cada
ORF y se calcularon los valores CpG esperados para cada tipo viral.
Resultados
CpGs estn insuficientemente representadas en los genomas virales. Se encontr una
correlacin positiva entre los valores observados y esperados CpG, con alto riesgo, los
virus de la mucosa (HR) que muestran el ms mnimo O / E ratios. Los rangos de los
PCS fueron similares para la mayora de las regiones genmicas excepto E4 , donde la
mayora de CpG se encuentran dentro de islas / grupos. Al menos un CGI pertenece a
cada E2/E4 regin. Se encontraron correlaciones positivas entre PCS para cada ORF
viral en comparacin con los otros, a excepcin de la LCR contra cuatro ORFs
y E6contra otros tres ORFs. La distribucin de las islas CpG / grupos entre los grupos
de VPH es tipo HR-HPV heterogneos y mucosas presentan tanto el nmero ms bajo
y ms corto en comparacin con el tamao de la isla bajo riesgo cutnea y mucosa (LR)
VPH (todos ellos muy diferentes).
Conclusiones
Hay una diferencia entre subrepresentacin CpG viral y celular. Existen correlaciones
significativas entre el PCS completa del genoma y la falta de correlaciones entre varios
pares de regin genmica, especialmente aquellos que involucran LCR
y E6 . L2 y L1ORF comportamiento es opuesta a la de los oncogenes E6 y E7 . El primer
par posee relativamente bajo nmero de sitios CpG agrupados en CGI mientras que los
oncogenes poseen un nmero relativamente alto de sitios CpG no asociados a CGI. En
todos los virus del papiloma humano, E2/E4 es la nica regin con al menos un CGI y
muestra un contenido ms alto de sitios CpG en cada tipo de HPV con un
identificado E4 . Los HR-HPV mucosas muestran ya sea el tamao ms corto CGI,
seguido por la mucosa LR-HPV y por ltimo por el subgrupo viral cutnea, y una
tendencia a la CGI nmero ms bajo, seguido por el subgrupo viral cutnea y, por
ltimo, por la mucosa LR-HPV .
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Fondo
Virus del papiloma humano (VPH) constituyen un grupo de ms de 100 tipos
diferentes. VPH infectan epitelios estratificados, tanto la mucosa y cutnea y se asocian
con trastornos proliferativos benignos y malignos. Tipos virales que infectan
preferentemente epitelios mucosos se agrupan ya sea en un grupo de bajo riesgo (LR-
HPV) no asociados con el cncer, o en un grupo de alto riesgo (VPH-AR), cuyos
miembros se encuentran en casi todos los casos de cncer cervical [ 1 ]. VPH son virus
no envueltos icosadrica en forma de no-lticas,, con una circular, genoma de ADN de
doble hebra de aproximadamente 8,0 kb que se divide funcionalmente en dos regiones
codificantes (denotado E para principios o L para la tarde) y una regin reguladora o
LCR. El E regin incluye seis principales marcos de lectura abierta (ORF) que codifican
protenas funcionales (E1, E2 y E4) y oncoprotenas (E5, E6 y E7), y la Lregin codifica
las dos protenas de la cpside, L1 y L2. E4 se expresa en ambas etapas tempranas y
tardas del ciclo de vida viral [ 2 ].
La expresin de genes de VPH est regulada principalmente a nivel transcripcional y
post-transcripcional y varios estudios han sugerido que la metilacin del ADN viral
puede estar asociada con la expresin gnica viral y la progresin del cncer [ 3 - 6 ].
La mayor parte del trabajo en la metilacin del VPH se ha llevado a cabo en los dos
tipos virales principales implicados en el cncer cervical (tipos 16 y 18). En ambos
genomas hay un aumento progresivo en la metilacin de portadores asintomticos, a
travs de lesiones benignas y enfermedades pre-malignas, a tumores de cncer. Sin
embargo, existe una gran heterogeneidad de la metilacin de CpG en genomas virales
derivados de muestras clnicas [ 4 - 7 ], y la funcin exacta de la metilacin del ADN
viral sigue siendo poco clara.
Adems, sobre la base de estudios de virus de Epstein-Barr se ha propuesto que la
metilacin del genoma viral puede permitir que una proporcin de las clulas
infectadas para sobrevivir citotxico de clulas T de vigilancia inmune [ 8 , 9 ], y los
estudios de adenovirus en los genes virales finales sugieren que son ms sensible a la
metilacin de los primeros [ 10 ]. En el caso de HPV L2 y L1 genes, que se han
propuesto para ser reconocidos preferentemente por la maquinaria de metilacin
celular [ 11 , 12 ].
La metilacin es la modificacin covalente slo conocida de ADN en eucariotas y juega
un importante papel regulador en los vertebrados por silenciar genes especficos
durante el desarrollo y la diferenciacin celular. Metilacin de citosina se produce en la
posicin 5 'del anillo de pirimidina, principalmente dentro de un contexto CpG
(m5CpG), a pesar de metilacin de citosinas en diferentes contextos se ha descrito
recientemente [ 13 , 14 ] y 5-hidroximetilcitosina (HMC 5), una novela DNA
modificacin se inform [ 15 ].
Por lo general, la presencia de m5CpG en el ADN genmico est asociado con
condensacin de la cromatina y la inactivacin de la expresin gnica. Sin embargo, no
est claro si el papel evolutivo primario de metilacin del ADN es el silenciamiento
transcripcional o un sistema de defensa del husped frente a elementos de secuencia
parasitarias endgenos o exgenos [ 16 ].
En los genomas de eucariotas superiores, dinucletidos CpG estn generalmente
insuficientemente representadas, de un tercio a un 5% de su frecuencia esperada [ 17 -
20 ]. El mecanismo propuesto para explicar esta falta de representacin, reconoci por
primera vez en los sistemas procariotas [ 21 ], es que los sitios CpG son mutagnicos,
debido a la conversin de frecuencia de methylcytosines a timinas travs desaminacin
[ 22 ].
Similar a sus anfitriones, dinucletidos CpG estn insuficientemente representadas en
la mayora de los virus de ADN pequeos, aunque en menor medida [ 23 ]. Se ha
propuesto que las frecuencias CpG bajos pueden permitir que los virus o bien para
evitar la metilacin por metiltransferasas de acogida y por lo tanto maximizar su
eficacia de la transcripcin, o podra ser un medio para reducir las respuestas
inmunitarias mediadas por CpG [ 24 ].
La opinin general es que los sitios CpG en los vertebrados, agrupadas en racimos o
islas (CGI), son en su mayora no metilados en las regiones promotoras de los genes
transcripcionalmente activos, y metilados en las regiones promotoras de los genes
transcripcionalmente inactivos. En contraste, la metilacin de los genes del cuerpo
parece ser conservadas evolutivamente y juega un papel importante en el tejido-o
regulacin de clulas especficas de promotor alternativo. Adems, las clulas
tumorales por lo general muestran hipometilacin de la mayora de la metilacin del
genoma y de CGI en las regiones promotoras de genes supresores de tumores [ 14 , 25].
Segn Gardiner-Garden y Frommer [ 26 ] un CGI se define como un fragmento de
ADN de al menos 200 pb que contiene al menos 50% de CpG, con una relacin
observada / esperada CpG (O / E) de 0,60 o superior y al menos una brecha de 100 pb
entre diferentes CGIs. Esta definicin, a pesar de su popularidad, ha suscitado muchas
crticas y diversas propuestas diferentes se han postulado [ 27 - 31 ]. Han et al., [ 32 ]
recientemente compar tres algoritmos computacionales para la identificacin de islas
CpG y, sobre la base de la funcin de genes de vertebrados y de otros factores
genmicos, el rendimiento criterios Takai y Jones era el mejor. El anlisis de 132 CGI a
travs de todo el cromosoma humano 21 permiti a los investigadores identificar
varios atributos asociados con cualquiera de metilacin-resistencia o sensibilidad de
metilacin-CGI [ 33 ].
La mayora de las propuestas para la identificacin y los criterios para analizar
predisposicin metilacin en las islas CpG CGI no se puede aplicar directamente a los
genomas debido a su pequeo tamao de VPH. Adems, la falta de mltiples regiones
promotoras y los pocos datos disponibles acerca de metilacin de diferentes tipos
virales hacen difcil este escenario.
Debido a que en nuestra opinin, la comprensin de la metilacin del ADN puede
beneficiarse de nuestro conocimiento de la distribucin de CpG lo largo de diferentes
genomas virales, se han analizado las proporciones genmicas y regionales de sitios
CpG (PCS) y su disposicin en CGI, en la mayora de los tipos de virus del papiloma
humano secuenciado hasta la fecha. Hasta donde sabemos, no ha habido un anlisis
exhaustivo de CGIs en los genomas de virus. Proponemos hiptesis acerca de sus roles
funcionales, teniendo en cuenta tanto los VPH como un solo grupo o en subgrupos en
funcin de su tropismo preferencial (cutnea y mucosa) y su riesgo asociado para
inducir el cncer (mucosa de bajo y de alto riesgo).
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Resultados
Sitios CpG estn infrarrepresentados entre los genomas de HPV, aunque en menor
medida que en sus anfitriones
Despus de identificar todos los sitios CpG entre los 92 disponibles las secuencias de
ADN del VPH, se calcul el valor de CpG esperado para cada genoma viral. El nmero
esperado de sitios CpG se calcul como el nmero de 'C est multiplicado por el
nmero de' G en el genoma viral, dividido por el tamao del genoma.
Cuando se compar la CpG observado vs los valores esperados para cada tipo viral, una
diferencia significativa fue evidente (un lado p = 0, prueba de Chi cuadrado).Adems,
se encontr una correlacin positiva (dos caras p = 4.30E-37, rho Spearman rango de
correlacin; Figura Figura 1)1 ) que indica una proporcin similar de CpGs
disminucin independientemente del tipo viral. Como se prevea, los sitios CpG estn
infrarrepresentados en los genomas virales, aunque en menor medida que en su
genoma husped humano [ 17 , 20 ]. La diferencia media entre medio es 50,5% (que
van desde 32,5% a 58,1%).

Figura 1
Relacin entre los valores observados y esperados CpG de los genomas de
VPH .
Curiosamente, la mayora de HR-HPV infecta muestran ratios de epitelios mucosos
CpG O / E por debajo de la O / E ratio media (0.50), slo cinco tipos de VPH-AR (18,
26, 45, 39 y 68) muestra diferencias ligeramente por encima de la media relacin (de
ficheros adicionales 1 , Tabla S1). De hecho, el HR-HPV tienen la media ms baja
(0,47) CpG O / E ratio que significa que este subgrupo viral muestra una
representacin insuficiente profundo CpG. CpG O / E ratios de medios de LR y los
tipos cutneos de HPV son 0,49 y 0,51, respectivamente.
En la figura Figura 1,1 , podemos observar los valores de CpG como una funcin de los
valores esperados para todos los genomas secuenciados 92 del VPH. La relacin
calculada O / E de cada nucletido individual entre los diferentes genomas virales
indica que C (0,8) y G (0,9), mientras que estn subrepresentadas A (1,2) y T (1,1)
estn sobre-representados dentro de los genomas de VPH.
HPV E4 es la regin con la mayor proporcin de CpGs
Se calcul cada PCS como el nmero de sitios CpG dividido por el nmero total de
nucletidos en la secuencia considerada. Luego trazamos PCS para cada regin viral en
orden ascendente (Figura (Figura 2)2 ) independientemente del tipo viral. Esto
significa que cada valor del eje x puede representar ms de un tipo viral.

La figura 2
Distribucin de los tipos de VPH en funcin de los valores del PCS
regionales . Cada conjunto de datos se representa grficamente de acuerdo con el
orden de cada uno particulares PCS regionales, desde el ms bajo al mximo. PCS es el
nmero de sitios CpG dividido por el nmero total de nucletidos en ...
De la figura Figura 22 (de ficheros adicionales 2 , Tabla S2, donde se enumeran todos
los genomas virales analizados), est claro que el E4 ORF posee el ms alto valor de
PCS regional (61 de los 68 tipos de VPH que esta regin ha sido identificada, vase la
seccin Mtodos para tipos de VPH que carecen de ORFs reportados), y que
el E2regin (donde E4 es co-situado) no muestra PCS valores similares (media E2 PCS
sin los tipos de VPH que carecen de E4 fue 0.028). En tres de los 68 tipos
virales, E7exhibe los ms altos valores de PCS, mientras que la regin LCR muestra los
valores ms altos de PCS en cuatro de cada 68 tipos.
PCS promedio de la regin (y el rango) para ORFs individuales y la LCR son los
siguientes: E6 , 0,024 (,002-,045); E7 , 0,030 (0,010-0,054); E1 , 0,018 (0,009 a
0,035); E2 , 0.029 (0.014 a 0,050); E4 , 0,051 (0,025-0,088); L2 , 0,023 (0,011-
0,043); L1 , 0,018 (0,009 a 0,036), y LCR, 0,027 (0,009 a 0,054).
Cuando los VPH se agrupan en funcin de su tropismo preferencial, los E4 ORF PCS
promedios son los ms altos en comparacin con cualquier otra regin. De
hecho, E4ORF PCS promedios estn bastante cerca, independientemente del tipo,
porque cutnea, 0.054 y mucosa, 0.049, similar a cuando los VPH mucosos se
agruparon en funcin del riesgo: riesgo bajo, 0.050 y de alto riesgo,
0.048. Adems, E4 promedio de los valores de PCS son alrededor de dos veces los ms
altos PCS promedio de cualquier otra regin en cada grupo viral / subgrupo (datos no
mostrados).
Curiosamente, relaciones de O / E para A (1,16) y G (0,96) nucletidos individuales en
la E4 ORF, siga la misma tendencia encontrada en todo el genoma viral, sin embargo,
T (0.68) parece poco representados y C (1,20) sobrerrepresentados, en comparacin a
los valores de todo el genoma. Cuando Arco-pecado transforman relaciones de O / E de
los nucletidos individuales en E4 se compararon y en todo el genoma, se encontr que
los dos conjuntos de datos son significativamente diferentes (p = 4.94E-14; prueba de
la t), a pesar de que son significativamente correlacin (p = 006; Pearson de
correlacin producto-momento). PCS se Arc-pecado transformados con el fin de
utilizar correctamente los procedimientos estadsticos, como se mencion en la seccin
Mtodos.
Distribuciones del tipo de VPH en funcin de la proporcin regional de los sitios CpG
son diferentes
Tipos de VPH fueron ordenados en funcin del PCS regionales transformadas Arc-sin
(AsPCS) y se compararon entre s utilizando un coeficiente de correlacin lineal de
Pearson y de dos caras pruebas t. Los resultados se muestran en la Tabla Tabla 1,1 ,
donde se puede observar que 36 de los 45 son correlaciones significativas. Esto
significa que cualquier tipo viral mantiene estrechamente su posicin relativa en
funcin de cada par correlacionada significativa de PCS regionales. Hay una falta de
correlacin entre PCS LCR y los de los E1, E4, L2 y L1 regiones, as como el promedio
de los ORFs; entre E6 PCS y los de los E7, E2 y E4 regiones, y entre E7 y PCS que a
partir de la L2regin.

Tabla 1
valores de p para las correlaciones entre los valores * AsPCS regionales
La distribucin de las islas CpG / grupos entre los VPH es heterognea
Ubicacin CGI se resume en la tabla Tabla22 (y se describe en el archivo adicional 3 ,
Tabla S3). Hay en promedio 3 CGI por VPH genoma (que van desde 1 a 8) y el tamao
medio de la isla es 394 pb, que van desde 203 hasta 1379 pb. Veinte dos tipos de HPV
tienen un solo CGI con un tamao medio de 447 pb (que van desde 210 hasta 835); 25
tipos poseen dos CGIs con un tamao promedio de 360 pb (que van desde 215 hasta
562); 15 tipos poseen tres CGIs con un tamao medio de 303 pb (que van desde 234
hasta 426); 10 posee cuatro tipos CGI, tamao medio de 365 pb (que van desde 241
hasta 510); 6 tipos poseen cinco CGI, tamao medio de 481 pb (que van desde 265
hasta 724) ; 6 tipos poseen seis CGI, tamao medio de 477 pb (que van desde 391 hasta
575); 7 tipos poseen siete CGI, tamao medio de 381 pb (que van desde 344 hasta 424),
y un solo tipo (VPH 57) posee ocho CGI con un tamao medio de 505 pb (que van
desde 209 hasta 1.159). Ninguno de los virus carecen de CGI, y en todos los casos al
menos un CGI pertenece a la E2/E4 regin.

Tabla 2
Proporcin de islas CpG por VPH para cada grupo viral
HPV E2/E4 es la regin con el mayor nmero de CGIs
Se encontr que la regin viral con el mayor nmero de CGI (CGIN) es E2/E4 ; cada
tipo viral que posee al menos un CGI en esta regin. Es importante dejar claro que en
el caso de E4 , como en cualquier otra regin, slo hemos tenido en cuenta los tipos de
VPH que este ORF se ha identificado. Otras regiones que contienen ms comnmente
CGI incluyen los E1, E7 y L2 ORF que tienen CGI en al menos la mitad de los tipos de
VPH; la L1 regiones ORF y LCR con una CGI en 25 a 50% de los tipos virales, y,
finalmente, la regin donde menos de 25% de los tipos virales poseen una CGI es E6 .
En la mayora de los tipos, no hay una correspondencia exacta entre toda CGIN
genoma y CGIN regionales porque cuando una isla / cluster se distribuye en ms de
una regin viral, se toma en cuenta en cada regin comprendida, incluso si slo hay
una CGI en todo el genoma. Esto se aplica particularmente a los E2 y E4 regiones
debido a que el E4 ORF se encuentra dentro de la E2 ORF, aunque en un marco de
lectura diferente (vase la Tabla Tabla22 ).
Los tipos de VPH de alto riesgo presentan islas CpG / grupos menos y ms cortos
Cuando agrupados por tropismo, y el promedio de CGI tamaos rangos son los
siguientes: los tipos de VPH cutneos promedio de 446 pb (203 a 1211 pb); todos los
tipos de VPH de la mucosa, 345 pb (205 a 1379 pb); mucosas tipos LR-HPV, 363 pb
(205-1379 pb) y la mucosa tipos de VPH-AR, 275 pb (210-410 pb). En particular,
cuando se compararon las frecuencias CGI por tamao, se encontraron diferencias
significativas entre los HPV cutneos y mucosos (p <0,0005), as como entre la
mucosa LR y HR-HPV (p <0,0001, prueba de Chi cuadrado). Adems, ambos tipos
virales cutneas y mucosas comparten un promedio de 3,0 CGIs por genoma viral (que
van desde 1 a 8), y entre los tipos de mucosas, LR-HPV muestran un promedio de 3,93
CGIs por genoma viral en contraste con HR-HPV que muestran slo 1,60 CGIs.Al
comparar las frecuencias por nmero de CGI, tambin encontramos diferencias
significativas entre los HPV cutneos y mucosos (p <0,005), as como entre la mucosa
LR y HR-HPV (p <0,001, test de Chi cuadrado).
Treinta de 45 cutnea y 32 de los 47 tipos de mucosas poseen 3 o menos CGIs, y 15 de
los 45 cutnea y 15 de los 47 tipos de mucosas poseen ms de 3 CGIs. En el grupo de la
mucosa, 14 de los 29 LR y los 18 HR-HPV poseen 3 o menos CGIs, y 15 de los 29 LR-
HPV posee ms de 3 CGIs (archivo adicional 3 , Tabla S3).
Aunque CGI parecen regionalmente distribuidos de manera similar entre los tipos
cutneas y mucosas (a excepcin de E6, L1 y LCR), hay una diferencia notable entre la
proporcin de CGI entre tanto HR-y de la mucosa LR-tipos (vase la tabla Tabla2),2 ),
especialmente para regiones E6 (0,07 y 0,32, respectivamente), E1 (0,33 y 1,14,
respectivamente), L2 (0,13 y 1,00, respectivamente), L1 (0,0 y 0,55, respectivamente),
y LCR (0,0 y 0,46, respectivamente ). De hecho, entre la mucosa tipos de VPH-AR, slo
HPV 33 contiene un CGI en el E6 regin, slo el VPH 45 contiene un par de CGIs en
la L2 regin, y ninguno de los HR-HPV mucosas contienen CGIs ya sea en la L1 o LCR
regiones.
Curiosamente, cuando se centra slo en regiones en las que se identificaron las islas
(con exclusin de cualquier regin sin CGI; ver la Tabla S3), la regin que posee el
nmero ms alto CGI es L1 (promedio 1,71 CGI sobre 21 tipos de VPH), seguido
de L2(promedio 1,58 CGI en 36 tipos de VPH), E1 (promedio 1,26 CGIs en 61 tipos de
VPH) y LCR (promedio 1,20 CGIs en 25 tipos de VPH). Los oncogenes E6 y E7 , as
comoE2 y E4 ORF cuota 1 CGI los das 17, 45, 92 y 68 tipos de VPH, respectivamente.
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Discusin
Para nuestro conocimiento, este es el primer anlisis sistemtico de CGI, as como de
la distribucin del sitio CpG realizado en 92 tipos de VPH. Este anlisis proporciona la
estructura principal que subyace al fenmeno metilacin, orientar la identificacin de
regiones genmicas interesantes para futuros estudios experimentales epigenticos.
Como era de esperar [ 23 ], encontramos diferencias significativas entre los valores
observados y esperados CpG entre todos los genomas secuenciados VPH. Sin embargo,
contrariamente a la escasa representacin notable de sitios CpG entre genomas
eucariotas donde representan slo un tercio a un 5% de los valores esperados; genomas
virales tienen una escasa representacin de slo alrededor del 50% de los valores
esperados CpG. De acuerdo con la hiptesis de co-evolucin, sera de esperar que los
genomas humanos y VPH exhiben valores de infrarrepresentacin de CpG
similares. Las grandes diferencias encontradas podran estar relacionados con otros
fenmenos relevantes, tales como el uso del codn especfico de la especie y la
composicin genmica de base. De hecho, una relacin entre el uso de codones y la
composicin base con C + contenido de G en los VPH se encontr anteriormente
[ 34 ,35 ].
En este contexto, parece necesario mencionar que los VPH son pequeos genomas de
ADN virales de tamao que no evolucionan rpidamente, a diferencia de otros virus.Se
ha calculado que se necesitan alrededor de 200.000 aos en 17 pb, hasta el cambio de
estos genomas [ 36 ].
En un contexto biolgico, una correlacin significativa entre los valores observados y
esperados CpG podra reflejar constricciones funcionales globales comunes
compartidos por la mayora de los tipos de VPH. Al mismo tiempo, la falta AsPCS
inter-regional de correlaciones punto a divergencias funcionales constriccin locales,
en particular en los E6 regiones y LCR (Tabla (Tabla 2).2 ). Sin embargo, ms estudios
de los diferentes tipos de VPH son necesarios para confirmarlo.
Curiosamente, L2 y L1 ORF muestran un comportamiento CpG paralelo. Ambos
poseen relativamente bajos PCS dispuestas principalmente en CGI. La L2 regin es el
sexto lugar en el valor promedio de PCS y el cuarto lugar en nmero isla, y L1 es el
octavo lugar en el valor promedio de PCS y el sexto lugar en nmero isla. Se sabe que
en las lesiones de cuello uterino de bajo grado asociadas al VPH 16, el genoma viral es
episomal, hipometilado, y las L1 y L2 ORF se expresa con el fin de generar las cpsides
virales. Por el contrario, la mayora de las lesiones cervicales de alto grado muestran
DNA viral integrado, hypermethylated y las L1 y L2 ORF no se expresan. En los
vertebrados, la metilacin en los genes del cuerpo juega un papel importante en el
tejido o la regulacin de clulas promotor especfico de alternativa, de tal manera que
CGI hurfanos se utilizan para la identificacin alternativa promotor [ 37 ]. A pesar de
que esta es una idea arriesgada, es tentador especular que los ORFs que codifican la
cpside viral se comportan de manera similar y que cuando la clula hypermethylates
ellos, es posible que la L1/L2 regin desempea un papel como un promotor
alternativo para los genes virales y, cuando integrado, para algunos genes celulares.
Adems, los oncogenes virales tambin muestran un comportamiento CpG paralelo,
pero de una manera opuesta como los genes que codifican la cpside. Ambos de ellos
poseen relativamente altas PCS valores asociados a unos pocos CGI. E7 ocupa el
segundo lugar de acuerdo con los valores promedio de PCS regionales y el quinto lugar
de acuerdo con el nmero media de la isla, mientras que el E6 regin ocupa el quinto
lugar de acuerdo con PCS regionales y la octava colocar de acuerdo con el nmero
promedio de isla. Esto significa que los sitios CpG estn ampliamente distribuidos y
sugieren ambas regiones podran ser sensibles a la metilacin, especialmente cuando
los virus del papiloma humano integran en el genoma de la clula.
El E4 ORF parece ser un caso especial debido a sus mltiples funciones durante el ciclo
viral. Est implicado en diversas funciones celulares y virales, especialmente en la
disminucin de la integridad de queratinocitos [ 38 ], [detencin del ciclo celular en
G239 ], la replicacin del ADN del VPH [ 40 ] y la expresin de las protenas tardas
[ 41], posiblemente a travs de varios productos de la protelisis protena E4 [ 42 ]. De
hecho, la E4 ORF se expresa en todo el ciclo viral [ 2 ]. Sus funciones y la expresin
continua podran depsito municipal restricciones funcionales duros a mutaciones de
secuencia, as como la necesidad de un mecanismo implicado en evitar la metilacin.El
mantenimiento de los sitios CpG en CGI podra ser una especie de compromiso para
satisfacer las restricciones del cdigo de secuencia con la expresin necesaria de la
protena E4.
Adems de la falta de representacin de los sitios CpG en el genoma del VPH, las
proporciones de un solo nucletido apuntan a T y A mayores frecuencias a costa de G y
C frecuencias, lo que refuerza la hiptesis de la mutacin T C como resultado de la
desaminacin CpG.
Sin embargo, el E4 regin no comparte el mismo
comportamiento.Sorprendentemente, incluso cuando A y G proporciones son similares
a los de todo el genoma, frecuencias C parecen ser aumentado a expensas de Ts. Este
hecho, sumado a la gran cantidad de sitios CpG, en su mayora organizados en CGIs,
lleva a la pregunta de si existe algn mecanismo para evitar la C T mutaciones, como
resultado de la desaminacin, que afecta el VPH y en especial la viral E4 regin. De
hecho, existen enzimas de reparacin que eliminan bases desaminados, en concreto,
timina ADN glicosilasa (TDG) y metil-CpG dominio de la protena de unin 4 (MBD4),
que son capaces de eliminar uracilo o timina de G U y G T miss- parejas en el
seguimiento de las enzimas de reparacin por escisin de base restaurar un G C par
[ 43 , 44 ].
Cuando agrupados por tropismo, el grupo de VPH cutnea, muestra el mayor tamao
medio de CGI (446 pb), seguido por el grupo LR-HPV con un tamao medio de CGI
intermedia (363 pb) y el grupo HR-HPV muestra el tamao promedio ms pequeo
CGI (272 pb). Adems, a pesar de que Cgin de ambos tipos de HPV cutneas y mucosas
comparten valores similares (3 CGIs, promedio), parece que hay una tendencia hacia
Cgin ms pequeo en comparacin con el HR-LR-VPH (1,6 y 3,93,
respectivamente). Estos datos plantean preguntas sobre el posible papel de los CGIs en
la interaccin entre el virus y las clulas. Al mismo tiempo, esto sugiere una posible
susceptibilidad diferencial a la metilacin en funcin de cualquiera de VPH tropismo o
riesgo asociado. Sin embargo, los nicos estudios experimentales sobre methylomes se
han llevado a cabo en los tipos de VPH 16 y 18, donde se observaron cambios de
metilacin y alta heterogeneidad a lo largo de las fases de la infeccin viral [ 3 - 8 ]. En
resumen, las diferencias entre los grupos podran estar relacionados con diferentes
estrategias epigenticos infecciones virales.
Por ltimo, debe ser interesante examinar virus determinados genes en el genoma
humano y ver cules son sus caractersticas y CGI CpG son. Esperamos que nuestro
anlisis de la distribucin de CpG y CGI entre los genomas de VPH puede proporcionar
elementos para aproximaciones experimentales racionales relacionadas con los
procesos biolgicos y evolutivos de estos virus y sus anfitriones.
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Conclusiones
En primer lugar, queremos sealar que este trabajo se basa nicamente en el anlisis
de secuencia caracterstica, por lo que los resultados presentados aqu pueden
necesitar corroboracin experimental. En este estudio, hemos encontrado que hay dos
diferencias importantes y las correlaciones entre los valores observados y esperados
CpG entre todos los genomas secuenciados de VPH, y que los genomas virales tienen
una escasa representacin de slo alrededor del 50% en comparacin con los genomas
eucariotas en representacin insuficiente es de 30 a 5 %.
El anlisis de la distribucin regional de sitio CpG muestra que las correlaciones entre
PCS completos del genoma son significativos, a pesar de que hay una falta de
correlacin entre varios pares de regin genmica, especialmente aquellos que
involucran LCR y E6 . Por otra parte, se encontr que L2 y L1 ORFs exhiben un
comportamiento opuesto a los oncogenes E6 y E7 ; el primer par que posee un nmero
relativamente bajo de sitios CpG que se asocian a CGI mientras que los oncogenes
poseen un nmero relativamente alto de sitios CpG que no estn asociados a CGI. Nos
gustara sealar que E4 es la regin que posee el mayor contenido de CpGs en cada
tipo de VPH que una E4 se identifica.
A partir del anlisis CGI, el E2/E4 es la nica regin con al menos una CGI en todos los
VPH, y la principal diferencia entre esta regin y el genoma completo es que en
elE4 regin de la frecuencia de Cs parece aument a expensas de Ts . Los HR-HPV
mucosas poseen los tamaos CGI ms cortos, seguido por las mucosas LR-HPV y,
finalmente, por el subgrupo viral cutnea. Al mismo tiempo, los HR-HPV mucosa
muestran una tendencia hacia nmeros ms bajos CGI, seguido por el subgrupo viral
cutnea y, finalmente, por la mucosa LR-HPV.
Por ltimo, esperamos que nuestro anlisis de la distribucin de CpG y CGI entre los
genomas de VPH puede proporcionar apoyo a los enfoques experimentales racionales
relacionadas con los procesos biolgicos y evolutivos de estos virus y sus anfitriones.
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Mtodos
Nuestro anlisis de CpG comprende dos fases: la primera es la comparacin de la
distribucin del sitio CpG entre los tipos de VPH como un solo grupo, y en la segunda
fase que identificar posibles similitudes o diferencias en la distribucin del sitio CpG
asociados a la tropismo preferencial y / o el riesgo de cncer causado por los subgrupos
virales mucosas. La distribucin de CpG se refiere a proporciones CpG (PCS) y, o bien
tamaos CGI o nmeros.
Fuente de datos
VPH secuencias de ADN se obtuvieron en lnea de GenBank (EE.UU. Biblioteca
Nacional de Medicina y los Institutos Nacionales de Salud; ver ficheros adicionales 1 ,
Tabla S1). El criterio principal para la seleccin del genoma viral fue que cada
secuencia de nucletidos haba sido identificado previamente como un tipo de HPV por
un estudio taxonmico. Seleccionamos todas las secuencias de VPH incluidos en los
esquemas de clasificacin de De Villiers et al. [ 45 ], sobre la base de la secuencia de L1,
y de Diallo et al. [ 46 ], en base a secuencias del genoma completo.
Secuencia del VPH tipo 16 incluye los cambios propuestos por el Grupo de Biologa
Terica y Biofsica en el Laboratorio Nacional de Los Alamos. 92 Todos los genomas de
VPH incluidos en el anlisis fueron reeditados por lo que todas las secuencias
comienzan en el primer nucletido de la E6 ORF. Las excepciones a esto son los tipos
de VPH 71 y 14D, porque ninguno tiene un reporte de E6 ORF. Adems, los tipos de
VPH 14D y 3 falta informaron E7 ORFs, tipo de VPH 53 carece de un
informado E1ORF y 24 tipos virales carecen informado E4 ORF (VPH 1a, 3, 7, 8, 9, 10,
12, 14D, 15, 17, 19, 25, 26, 27, 30, 32, 34, 40, 45, 50, 52, 53, 56 y 71).
Debido a la ausencia de datos puede contribuir a un sesgo en el anlisis, se
identificaron ORFs putativo para cada tipo de VPH que carecen ORFs reportados
utilizando la herramienta en lnea "ORF finder" [ 47 ]. Los principales criterios de
seleccin putativo ORF era el tamao de las regiones codificantes identificados y la
existencia de un solo candidato ORF en cada regin considerada. Tomamos en cuenta
los fragmentos individuales de 200 pb o ms, y luego se calcul el PCS para estos ORFs
putativo. Como puede verse en el archivo adicional 4 , Tabla S4, encontramos putativo
sola E 1 y E 7 ORFs para tipos de VPH 53 y 3, respectivamente. En el caso de VPH 14D,
encontramos sola E 6 y E 7 ORFs, sin embargo, se constat que eran recubrirse con
ms de 100 pb. Para los tipos de VPH sin reportado E 4 ORF, hemos identificado un
nico ORF putativo en slo tres tipos virales de VPH: 25, 26 y 32. Los otros 21 tipos de
VPH tenan ms de un ORF identificado: se encontraron 11 tipos de VPH con 2, 8 tipos
de VPH de 3, 1 tipo de VPH con 4 y 1 tipo de VPH con 5 putativo E4 ORFs.
El PCS para las ORFs putativo no cambiaron notablemente el PCS promedios
regionales ni el anlisis de los resultados (vase la disposicin 5 , cuadro S5).
Por ltimo, con el fin de evitar sesgos en los resultados, se incluy una secuencia de
cada tipo de VPH y evitamos cualquier secuencia de tipo Variant.
Datos de entrada
Los datos de entrada comprendidos todo el genoma, cada ORF y LCR, incluyendo los
sitios de inicio y fin, para cada tipo de HPV.
Se analizaron los genomas completos de 92 secuencias virales, as como los dividen en
8 regiones ( E1, E2, E4, E6, E7, L1 , y L2 ORF, y LCR). Debido a la escasa cantidad de
datos, no hemos incluido tres ORFs reportados en el anlisis: el E8 ORF se ha
encontrado solo en 1 de HPV, el E5 ORF est presente slo en 23 de los 92 tipos de
VPH (5, 6 bis, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 51, 58, 59, 67, 68, 69, 70, 74, 82 y
85), y el E5 B ORF se informaron slo para dos HPV tipos (11 y 31).
Datos de salida
Con el fin de identificar los sitios CpG que utilizamos PISMA, una herramienta
computacional que hemos diseado, que est disponible a peticin de SCG y / o
RAS.PISMA permite la localizacin y la identificacin de los motivos que varan entre 2
a 10 bases, en un mximo de 10 kb secuencias de ADN. Adems, esta herramienta
contar el nmero de motivos en las regiones definidas. Hemos identificado los sitios
CpG individuales por regin de todas las secuencias de VPH, y en base a los datos de
PISMA, se calcularon los PCS como el nmero de sitios CpG dividido por el nmero
total de nucletidos en la secuencia. Identificacin de putativo islas CpG / grupos se
llev a cabo utilizando la isla CpG Explorer 2.0, disponible pblicamente
enhttp://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx [ 28 ]; parmetros utilizados en la
isla CpG de identificacin fueron los de Gardiner-Jardn y Frommer [ 26 ]: CpG 50% o
ms, ObsCpG / ExpCpG relacin de 0,60 o ms alto, al menos 200 pb tamao y 100 pb
brecha. En la figura Figura 33 se muestran los resultados obtenidos para el VPH 16.

Figura 3
Distribucin de CpG en el genoma de VPH tipo 16 . A. mapa Viral gen; B.
Localizacin de sitios CpG y C. sola isla CpG identificados.
PCS transformaciones Arc-sen se calcularon con el fin de utilizar correctamente los
procedimientos estadsticos paramtricos que no son adecuados para los datos de
proporcin debido a la naturaleza binomial del proceso biolgico (ocurrencia CpG). En
resumen, la distribucin de proporciones es a menudo sesgada, y la transformacin
arcoseno a menudo hace que la distribucin ms normal.
Por ltimo, se calcularon los valores esperados CpG para cada genoma viral con el fin
de compararlos con los valores observados CpG.
Anlisis de Datos
Las posibles relaciones entre los resultados de los datos se identificaron utilizando rho
de Spearman rango de correlacin y pruebas de Chi cuadrado, as como Momento de
Pearson del producto de correlacin y dos caras pruebas t. Los clculos se realizaron
utilizando ad hoc Excel macros y corroboracin de los clculos, el uso de software libre
en lnea las estadsticas [ 48 , 49 ].
Procedimiento de revisin
Con el fin de comprobar la posibilidad de errores en los clculos, se revis todo el
procedimiento de seleccin al azar tres grupos de treinta tipos de VPH cada uno. A un
grupo se utiliza para repetir los procedimientos de datos de entrada; un segundo grupo
se utiliz para repetir los procedimientos de datos de salida, y el tercer grupo se utiliz
para repetir los clculos del valor estadsticos y p.
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Lista de las abreviaturas
VPH: virus del papiloma humano; LR-HPV: los tipos de VPH de bajo riesgo; HR-HPV:
los tipos de VPH de alto riesgo; ORF: marco de lectura abierto; PCS: proporcin de
sitios CpG; AsPCS: Arc-sin proporcin transformada de sitios CpG; m5CpG : sitio CpG
metilado; CGI: isla CpG; Cgin: Nmero isla CpG; E (nmero): protena viral temprana,
L (nmero): protena viral tarda; E (nmero): viral temprana ORF, L(nmero): viral
tarda ORF; LCR: regin de control de largo; SRPK1: serina-arginina-rica protena
quinasa 1.
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Autores de las contribuciones
SCG inici el estudio, realizado el anlisis y la interpretacin, y escribi el
manuscrito.MMS, VMG y RM obtuvieron los datos y revis el manuscrito. RAS, GTDC
MAH y desarrollaron la herramienta computacional y particip en la obtencin de los
datos, y AGC siempre mpetu inicial para llevar a cabo el anlisis y participaron en la
redaccin y revisin del manuscrito. Todos los autores ledo y aprobado el manuscrito
final.
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Informacin de los autores
SCG es un investigador asociado y RAS es profesor en la Universidad Nacional
Autnoma de Mxico; AGC es un investigador de la Universidad Nacional Autnoma
de Mxico y en el Instituto Nacional del Cncer, VMG es profesor en la Universidad
Metropolitana, RM es un investigador asociado en el Instituto Nacional del Cncer,
MMS es becario postdoctoral en el laboratorio de AGC; GTDC y TAC son estudiantes
guiados por RAS.
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Material complementario
Archivo adicional 1:
Tabla S1. CpG observado y esperado valores para cada tipo de VPH . La tabla
contiene el nmero de acceso de GenBank, los nmeros observados y esperados CpG, y
la relacin O / E CpG, para todos los 92 tipos de VPH incluidos en el anlisis.
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(39K, XLS)

Archivo adicional 2:
Tabla S2. Proporcin de sitios CpG entre diferentes regiones
genmicas . La tabla contiene la proporcin de CpG en la E6, E7, E1, E2, E4,
L2 y L1 ORF, y la LCR, todo el genoma y todos los ORFs juntos, para cada tipo viral.
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(41K, XLS)

Archivo adicional 3:
Cuadro S3. Islas CpG por regin de cada tipo de VPH . La tabla contiene el
nmero de la isla CpG en la E6, E7, E1, E2, E4, L2 y L1 ORF, y la LCR y de genoma
completo, el tamao medio de CGI y el tropismo para cada tipo viral.
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La disposicin 4:
Tabla S4. ORFs putativo de los tipos de VPH que carecen de ORFs
reportados . La tabla contiene todos los fragmentos posible codificacin de 200 pb o
ms grande para cada tipo de HPV que carece ORFs reportados; los sitios de inicio y
fin, y los valores correspondientes PCS.
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Archivo adicional 5:
Tabla S5. P valores de las correlaciones entre AsPCS regionales cuando se
incluyen las ORFs putativo . La tabla contiene valores de p para las correlaciones
entre los valores AsPCS regionales cuando se incluyen AsPCS de ORFs putativo.
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Agradecimientos
Queremos reconocer el apoyo de PAPIIT-UNAM IN215411-3 (a SCG) y IN226408 (a
AGC). Este trabajo se realiz en la Unidad de Investigacin Biomdica en Cncer,
Instituto de Investigaciones Biomdicas de la Universidad Nacional Autnoma de
Mxico y el Instituto Nacional de Cancerologa, SSA, en colaboracin con
investigadores de la Facultad de Ingeniera, Universidad Nacional Autnoma de
Mxico y del Instituto Nacional de Cancerologa , SSA. Agradecemos al Prof. Luis
Bojrquez-Castro til para los debates y asesoramiento estadstico, y la Dra. Elizabeth
Langley y QFB Martha D. Snchez-Barrios para la revisin crtica del
manuscrito.Tambin damos las gracias a dos revisores annimos por excelentes
crticas constructivas.
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